Toepassing en directe metingen van de krachten op neuronen in de 2-1000 microdyne serie worden bereikt met een hoge precisie met geijkte glas naalden. Deze methodiek kan gebruikt worden om de controle en meten van verschillende aspecten van axonale ontwikkeling, waaronder axonale initiatie, axonale spanning, snelheid van axonale rek, en kracht vectoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cel manipulaties en uitbreiding van de neuronale axonen kan worden bereikt met gekalibreerde glazen micro-vezels geschikt voor het meten en toepassen van krachten in van 10-1000 μdyne range 1,2. Force metingen worden verkregen door observatie van de Hookean buigen van het glas naalden, die worden gekalibreerd door een directe en empirische methode 3. Apparatuur eisen en procedures voor het fabriceren, kalibreren, behandelen, en het gebruik van de naalden op cellen worden volledig beschreven. De kracht regimes eerder gebruikte en de verschillende celtypes waarop deze technieken zijn toegepast tonen de flexibiliteit van de methodologie en worden gegeven als voorbeelden voor toekomstig onderzoek 4-6. De technische voordelen zijn de continue 'visualisatie' van de krachten die door de manipulaties en de mogelijkheid om rechtstreeks in te grijpen in een verscheidenheid van cellulaire gebeurtenissen. Deze omvatten directe stimulatie en regulering van de axonale groei en terugtrekking 7, evenals onthechting en mechanische metingen op elk type van de gekweekte cellen 8.
Protocol
1. Het maken van glas naalden.
- Een verstelbaar micro-naald trekker wordt gebruikt om naalden te fabriceren met een taps toelopende tip over 4 mm in lengte en die zijn gesloten solide balken. In tegenstelling tot een lange flexibele tip, deze korte 4 mm lengte beperkt trillingen van de naaldpunt tijdens de experimenten. Aan het proximale gebied van de 4 mm vezel, de naald versmalt snel van de diameter van de glazen buizen tot 15 micrometer binnen 1 mm, terwijl de distale meest 1 mm van de vezel is 2,5 micrometer in diameter. We maken gebruik van R-6 glazen capillaire buis, OD 0.9 mm, 0.6 mm ID 8 "lengte en een BB-CH trekker. Als de onderzoeker geïnteressee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Technieken toe te passen en te meten cellulaire krachten hebben een lange geschiedenis 9. Onze methode werd oorspronkelijk ingegeven door het werk van Dennis Bray, die vroeger glas naalden vergelijkbaar met die van ons met 'slepen' neuronen met een constante snelheid met behulp van een gemotoriseerd hydraulische inrichting 10. Er zijn veel alternatieve middelen van de toepassing van krachten om cellen die onder andere: stappenmotoren 11, 12 magnetische korrels, microfabricated ba.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van dr. Robert E. Buxbaum in de ontwikkeling van deze methodologie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| R-6 capillaire buis | Drummond Scientific | 9-000-3111 | R-6 glas OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8" |
| BB-CH puller | Mecanex S.A., Genève, Zwitserland | BB-CH puller | Gebruik Mode 4 Alt bij CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000 |
| 0.001" Chromel-draad | Omega Engineering, Inc. | SPCH-001-50 | ongeïsoleerde thermokoppeldraad, spoel van 50ft, nu bekend als Chromega |
| 0.003" Constatan-draad | Omega Engineering, Inc. | SPCI-003-50 | ongeïsoleerde thermokoppeldraad, spoel van 50 ft |
| fijne pincet | Fine Science Tools | 91150-20 | Dumont Inox #5 |
| universele microscooparmstatief | Nikon Instruments | 76135 of 90430 | de meeste merken of typen armstatieven zijn geschikt voor dit gebruik |
| mechanische micromanipulator | Narishige International | M-152 | direct-drive grove micromanipulator met drie assen |
| hydraulische micromanipulator | Narishige International | MO-203 | nu beschikbaar als MMO-203, type met drie beweegbare assen |
| naaldhouder | Leica Microsystems | 11520145 | set van 3 |
| enkelvoudige instrumenthouder | Leica Microsystems | 11520142 | |
| dubbele instrumenthouder | Leica Microsystems | 11520143 | |
| mechanische micromanipulator | Leica Microsystems | 39430001 | paalmontage, 1 probehouder, RH Model 430001 |
| joystick mech. micromanipulator | Leica Microsystems | 11520137 | |
| Leica DM IRB | Leica Microsystems | omgekeerde microscoop | |
| Vibraplane isolatietafel | Kinetic Systems | 1200 serie | ons model is 1201-02-12 |
| Ringcubator | Zelfgebouwd (zie referentie 19) | referentie 19, vereist bijgewerkte controller zoals hieronder vermeld | |
| programmeerbare temperatuurcontroller | Instrumart.com | Fuji Electric PXR3 | vervangt de uitgefaseerde PXV3 temperatuurcontroller |
| Nikon Diaphot TMD | Nikon Instruments | omgekeerde microscoop, circa 1980 | |
| Nikon SMZ-10 binoculair dissectiemicroscoop | Nikon Instruments | andere dissectiemicroscopen zijn ook geschikt |
Referenties
- Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation. J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).
- Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons. <....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
