Methodenartikel

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

DOI:

10.3791/2511

⸱

6 december 2010

 ,  ,  ,  ,  , 
1Buck Institute for Age Research, Novato, CA, 2Department of Pathology, Center for Free Radical Biology, University of Alabama at Birmingham - UAB, 3Seahorse Bioscience, North Billerica, MA

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een beschrijving van een methode voor het profileren van mitochondriale functie in cellen wordt verzorgd. De gegenereerde mitochondriale profiel biedt vier parameters van mitochondriële functie die kan worden gemeten in een experiment: basale ademhaling, ATP-linked ademhaling, proton lek, en reservecapaciteit.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De mogelijkheid om cellulaire stofwisseling te meten en te begrijpen mitochondriale dysfunctie, heeft het mogelijk gemaakt wetenschappers wereldwijd om hun onderzoek te bevorderen in het begrijpen van de rol van de mitochondriale functie in obesitas, diabetes, veroudering, kanker, cardiovasculaire functie en veiligheid van toxiciteit.

Cellulair metabolisme is het proces van het substraat opname, zoals zuurstof, glucose, vetzuren en glutamine, en de daaropvolgende omzetting van energie door middel van een serie van enzymatisch gecontroleerde oxidatie en reductie reacties. Deze intracellulaire biochemische reacties resulteren in de productie van ATP, de vrijlating van warmte-en chemische bijproducten, zoals lactaat en CO 2 in het extracellulaire milieu.

Waardevol inzicht in de fysiologische toestand van de cellen, en de wijziging van de toestand van die cellen, kan worden verkregen door middel van het meten van de snelheid van zuurstof wordt verbruikt door de cellen, een indicator van de mitochondriale ademhaling - het zuurstofverbruik Rate - of OCR. Cellen ook het genereren van ATP via glycolyse, dat wil zeggen: de omzetting van glucose naar lactaat, onafhankelijk van zuurstof. In gekweekte putten, lactaat is de primaire bron van protonen. Het meten van de melkzuur indirect geproduceerd via protonen vrijkomen in het extracellulaire medium rondom de cellen, waardoor verzuring van het medium zorgt voor de extra-cellulaire Verzuring Rate - of ECAR.

In dit experiment worden C2C12 myoblast cellen gezaaid bij een bepaalde dichtheid in Seahorse celkweek platen. De basale zuurstofverbruik (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) tarieven zijn gemeten met de uitgangswaarde tarieven vast te stellen. De cellen worden vervolgens metabolisch verstoord door drie toevoegingen van verschillende verbindingen (achter elkaar) dat de bio-energetische profiel van de cel shift.

Deze test is afgeleid van een klassiek experiment om te beoordelen mitochondriën en fungeert als een raamwerk waarmee meer complexe experimenten gericht op het begrijpen zowel fysiologische en pathofysiologische functie van de mitochondriën te bouwen en het vermogen van cellen om te reageren op stress en / of beledigingen voorspellen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit experiment worden C2C12 myoblast cellen gezaaid bij een bepaalde dichtheid in Seahorse celkweek platen. De basale zuurstofverbruik (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) tarieven zijn gemeten met de uitgangswaarde tarieven vast te stellen.

1. Cellen Injectie

De cellen zijn metabolisch verstoord door drie toevoegingen van verschillende verbindingen (achter elkaar) dat de bio-energetische profiel van de cel shift. De ene groep zal dienen als de controle, met het runnen van media toegevoegd als controle "verbindingen".

  1. De eerste injectie is oligomycin. Oligomycin remt de ATP-synthese door het blokkeren van de proton-kanaal van de F-o gedeelte ATP synthase (Complex V). In het mitochondriaal onderzoek, wordt het gebruikt om de staat 3 (fosforylerende) ademhaling te voorkomen. Met cellen, kan het worden gebruikt om het percentage van O2-verbruik gewijd aan de ATP synthese en het percentage van de O2-verbruik nodig is om de natuurlijke proton lek in het binnenste mitochondriale membraan te overwinnen onderscheiden.
  2. De tweede injectie is FCCP. FCCP (Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) is een ionofoor dat is een mobiele ion drager. Het is een ontkoppeling agent omdat het ATP-synthese verstoort door het transport van waterstof-ionen in het mitochondriale membraan in plaats van het proton kanaal van ATP synthase (Complex V). Deze ineenstorting van de mitochondriale membraanpotentiaal leidt tot een snelle verbruik van energie en zuurstof, zonder het genereren van ATP. In dit geval zullen zowel de OCR en ECAR te verhogen, OCR als gevolg van ontkoppeling, en ECAR als de cellen poging om hun energie-evenwicht te bewaren met behulp van de glycolyse om ATP te genereren.
    FCCP behandeling kan worden gebruikt om de "vrije" respiratoire capaciteit van de cellen die wordt gedefinieerd als het kwantitatieve verschil tussen de maximale ongecontroleerd OCR en de eerste basale OCR te berekenen. Het is voorgesteld dat het behoud van enige reservecapaciteit respiratoire capaciteit, zelfs onder omstandigheden van maximale fysiologische of pathofysiologische stimulus is een belangrijke factor het bepalen van de vitaliteit en / of de overleving van cellen. Het vermogen van cellen om te reageren op stress onder omstandigheden van verhoogde vraag naar energie is in een groot deel beïnvloed door de bio-energetische capaciteit van de mitochondriën. Deze bio-energetische capaciteit wordt bepaald door verschillende factoren, waaronder het vermogen van de cel om substraat te leveren aan mitochondria en de functionele capaciteit van enzymen die betrokken zijn in het elektron transport
  3. In de derde injectie, is rotenon, een Complex I-remmer, toegevoegd aan de cellen. Het programma wordt afgesloten mitochondriale ademhaling en maken zowel de mitochondriale en niet-mitochondriale fracties bij te dragen aan de ademhaling worden berekend. Men zal zich aan een afname van de OCR te wijten aan een verminderde mitochondriale functie, met een gelijktijdige verhoging van ECAR als de cel verschuift naar een meer glycolytische staat om de energie-evenwicht te handhaven
    Rotenon is een mitochondriaal inhibitor dat de overdracht van elektronen van de Fe-S-centrum in Complex I tot en met ubiquinon (Co-enzym Q) voorkomt. Deze remming van het Complex I voorkomt dat de potentiële energie in NADH worden geconverteerd naar bruikbare energie in de vorm van ATP.

2. Reagentia en materialen

  1. Oligomycin, FCCP, en Rotenon Solutions (Seahorse Mito Stress Test Kit)
  2. DMEM Running Media (Seahorse # 100965-000)
  3. DMSO (Sigma D8418)
  4. Gedestilleerd water (Gibco 15230-170)
  5. Kalibratie buffer (Seahorse Bioscience)

3. Groeimedium

  1. 500 ml DMEM (Gibco 11965-092)
  2. 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
  3. 5 ml Penn / Strep (Gibco 15.140 tot 122)
  4. 5 ml natriumpyruvaat (Sigma S8636)
  5. 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061)

4. Zaaien Protocol

  1. Cellen worden uitgezaaid in XF96 celculturen platen met 10.000 cellen / putje in 100 ul van groeimedium en geplaatst in 37 ° C incubator met 10% CO 2.
  2. Cellen zullen zich houden aan de XF96 celcultuur plaat binnen 1 uur.
  3. Assay cellen in XF96 24 uur na zaaien.

5. Voorbereiding van de Assay Template

  1. Met behulp van de Wizard Assay (bijlage I), het genereren van een sjabloon met de volgende groep lay-out:
    figure-protocol-1
    Figuur 1. Well rooster lay-out te identificeren kolom en groepsopdrachten

6. Compound Voorbereiding

  1. Bereid de volgende verbindingen in de XF DMEM Assay media als volgt:
    10 uM Oligomycin, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM Rotenon,
    Deze concentraties vertegenwoordigen de 10x verdunning die zullen worden gemaakt wanneer de verbindingen worden geïnjecteerd in de put. De werkende concentraties zijn:
    1 uM Oligomycin, 3,0 uM FCCP, 2,0 uM Rotenon

7. Media Verandering en celpreparaat

  1. Plaats de cel plaat op de XF Prep Station
  2. Stel het uiteindelijke volume van de middelgrote tot 160 ul per putje.
  3. Incubeer in 37 ° C incubator zonder CO 2 gedurende 60 minuten om cellen te pre-evenwicht met de voedingsbodem.

8. Het laden van Sensor Cartridge

  1. Warm verbindingen tot 37 ° C vóór het laden sensor cartridge en de verbindingen in de injector poorten als volgt laden:
    1. Kolommen 1-4: Load 16, 18, en 20 ul van XF Assay media (DMEM) in havens A, B en C, respectievelijk.
    2. Kolommen 5-12 jaar:
      Belasting 16 pi van Oligomycin in havens A
      Belasting 18 pi van FCCP in havens B
      Belasting 20 ul van Rotenon in havens C

9. Protocol Commando's

Commando Tijd (min) Poort
Kalibreren
Evenwicht
Loop Start 3X
Mengen 3
Wacht 2
Meten 3
Loop End
Injecteren Een
Loop Start 2X
Mengen 3
Wacht 2
Meten 3
Injecteren B
Loop Start 2X
Mengen 3
Wacht 2
Meten 3
Injecteren C
Loop Start 2X
Mengen 3
Wacht 2
Meten 3
Einde

Tabel 1. Protocol commando's

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze test is afgeleid van de klassieke experiment om mitochondriale functie sonde en dient als een raamwerk waarmee meer complexe experimenten gericht op het begrijpen diverse veranderingen in het celmetabolisme, de mitochondriale functie, en de algehele bio-energetica te bouwen.

Alle verbindingen die in dit experiment moet worden geoptimaliseerd voor de concentratie die het maximale effect geeft. Dat wil zeggen, men moet apart titratie-experimenten uit te voeren om deze waarden vast te stellen. Dit is vooral belangrijk met FCCP, zoals de titratiecurve de neiging om heel scherp, en te veel FCCP daadwerkelijk kan de reacties verminderen in OCR. Typische reeksen (eindconcentraties) om te testen zou zijn:

  • 0,1 tot 1,0 ug / ml Oligomycin
  • 0,1 tot 5,0 uM FCCP
  • 0,1 tot 1,0 uM Rotenon

Merk op dat de antwoorden op elke verbinding hierboven (in het bijzonder FCCP) zal worden beïnvloed door de test media samenstelling (basistype, [glucose], [pyruvaat], de aanwezigheid / afwezigheid van BSA, enz.). Verder, als de XF test media samenstelling is veranderd, zal optimalisatie moeten opnieuw worden uitgevoerd. De aanwezigheid en concentratie van pyruvaat is vooral van belang bij het verkrijgen van de maximale respiratoire capaciteit als gevolg van FCCP. Zeepaardje Bioscience heeft waargenomen in een aantal cellen lijnen die omissie van pyruvaat het vermogen van cellen om maximaal te reageren (zie boven baseline) te FCCP schaft. Normaal gesproken, moet de concentratie van 1-10 mM pyruvaat worden getest om de optimale concentratie van pyruvaat te begrijpen maximale ademhaling te verkrijgen. Merk op dat [pyruvaat] EN [glucose] moet mogelijk worden "cross-getitreerd" om de optimale media voorwaarden voor het experiment te verkrijgen.

Typische resultaten van dit experiment worden hieronder weergegeven in een grafiek met OCR versus tijd en een ander laten zien ECAR vs tijd:

figure-discussion-1
Figuur 2. OCR vs Time

figure-discussion-2
Figuur 3. ECAR vs Time

Hier hebben we de verwachte responsen waargenomen in OCR en ECAR als de cellen worden behandeld met elke opeenvolgende verbinding. Voor oligomycin, OCR afneemt als gevolg van het blokkeren van ATP-synthese op mitochondriale Complex V. Sinds de cellen niet in staat om ATP te synthetiseren via OXPHOS, ze terug te keren naar glycolyse om hun vraag naar ATP te voldoen, dus zien we een toename van de ECAR. Zoals eerder aangegeven, FCCP fungeert als een ontkoppeling agent. Omdat de cellen moet nu overwinnen van de proton lek over het binnenste mitochondriale membraan, OCR aanzienlijk toeneemt naarmate er meer O2 wordt geconsumeerd om terug te pompen het overtollige protonen over het mitochondriale membraan. Tot slot, rotenon remt mitochondriaal Complex I en Complex III, respectievelijk, waardoor de stroom van elektronen te staken in de elektronen transportketen, en daarmee de consumptie van O2 is drastisch verminderd.

figure-discussion-3
Figuur 4. Ademhaling parameters

Verder dan de verwachte veranderingen in ademhaling en ECAR, kan een aantal respiratoire parameters worden verkregen van deze gegevens. Dit is samengevat in de figuur hierboven:

Hier zien we dat we informatie over de basale ademhaling van de cellen, het percentage van de O2-consumptie gewijd aan de ATP productie evenals het bedrag voor het handhaven van de proton gradiënt (ten gevolge van H + lekken) te verkrijgen. Verder kunnen we de maximale ademhaling te verkrijgen onder de voorwaarden van het afgekoppelde ademhaling (soms aangeduid als reserve-respiratoire capaciteit) en tot slot, kunnen we de hoeveelheid O2-verbruik niet te wijten aan mitochondriale processen bepalen.

Een snel groeiend aantal studies zijn dienst dit mitochondriale profiel om cellulaire bio-energetica beoordelen, mitochondriale disfunctie te identificeren en om het vermogen van cellen om te reageren op stress en / of beledigingen voorspellen. Voor meer informatie en details over deze experimentele methode en het idee van de vrije ademhaling capaciteit, zie verwezen naar de volgende publicaties 1-8.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers en David A. Ferrick zijn werknemers van Seahorse Bioscience, die reagentia en instrumenten die in dit artikel wordt veroorzaakt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-oplossingenSeahorse BioscienceSeahorse Mito Stress Test Kit
DMEM-runmediumSeahorse Bioscience100965-000
DMSOSigma-AldrichD8418
Gedestilleerd waterGIBCO, by Life Technologies15230-170
KalibratiebufferSeahorse Bioscience

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure. J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).
  2. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochem J. 424, 99-107 (2009).
  3. Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway. Nature. , 459-7245 (2009).
  4. Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion. J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).
  5. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).
  6. Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor. Biochem J. 428, 255-267 (2010).
  7. Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts. Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).
  8. Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell. , 142-142 (2010).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le functiezuurstofconsumptiesnelheidextracellulaire verzuringssnelheidSeahorse XF 96 Analyzerbasale respiratieATP omzettingprotonlekkagereserve respiratoire capaciteitmitochondri le stresstest

Gerelateerde artikelen