Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Summary

De Virochip is een pan-virale microarray ontworpen om gelijktijdig alle bekende virussen, alsmede nieuwe virussen te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie. Hier laten we zien hoe een Virochip test uitvoeren om klinische monsters te analyseren op de aanwezigheid van zowel bekende als onbekende virussen.

Abstract

De diagnose van virale oorzaken van veel besmettelijke ziekten is het moeilijk te wijten aan de inherente volgorde diversiteit van virussen, alsook de voortdurende opkomst van nieuwe virale pathogenen, zoals SARS coronavirus en 2009 pandemische H1N1-influenzavirus, die niet opspoorbaar zijn door de traditionele methoden. Om deze uitdagingen, hebben we eerder ontwikkeld en gevalideerd een pan-virale microarray platform genaamd de Virochip met de capaciteit om alle bekende virussen, alsmede nieuwe varianten te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie ^1. Met behulp van de Virochip, hebben we het volledige spectrum van virussen geassocieerd met infecties van de luchtwegen, met inbegrip van gevallen van onverklaarbare kritieke ziekte in het ziekenhuis opgenomen patiënten, met een gevoeligheid gelijk is aan of beter dan de conventionele klinische tests ^2-5. De Virochip is ook gebruikt om nieuwe virussen te identificeren, met inbegrip van het SARS-coronavirus ^6,7, een roman rhinovirus clade ^5, XMRV (een retrovirus gekoppeld aan prostaatkanker) ^8, Avian Borna Virus (de oorzaak van een slopende ziekte in papegaaien) ^9, en een nieuwe cardiovirus bij kinderen met ademhalings-en diarree ^10. De huidige versie van de Virochip is geschikt gemaakt voor een Agilent microarray platform en bestaat uit ~ 36.000 probes afgeleid van meer dan ~ 1500 virussen in GenBank ingang van december 2009. Hier laten we zien de stappen die betrokken zijn bij de verwerking van een Virochip test van start tot finish (~ 24 uur doorlooptijd), met inbegrip van steekproefsgewijze nucleïnezuur-extractie, PCR-amplificatie met behulp van willekeurige primers, fluorescente kleurstof oprichting, en microarray hybridisatie, scannen en analyse.

Protocol

De stappen van de Virochip test omvatten (1) nucleïnezuur extractie uit klinische monsters, (2) reverse transcriptie van geëxtraheerde RNA en 2 ^e-streng cDNA synthese, (3) PCR-amplificatie van willekeurig geprimed cDNA, (3) Cy3 fluorescerende kleurstof incorporatie , (4) hybridisatie van gelabeld materiaal aan de Virochip microarray, en (5) scanning en analyse (figuur 1). Het protocol hieronder demonstreren het gebruik van de Virochip test op een neusuitstrijk monster van een kind met een influenza-achtig ziektebeeld.

Primer Sequences

Primer Een 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N ₉₎ -3 '

Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '

1. Nucleic Acid Extraction

1. Nucleïnezuur-extractie uit klinische monsters moeten worden uitgevoerd onder Biosafety Level 2 (BSL-2) of hoger voorwaarden, zoals deze monsters zijn mogelijk infectieus.
2. De neusuitstrijk monster wordt vervoerd in virale holding medium. Aliquot 200 pi van het monster in een 1,5 ml Eppendorf microcentrifugebuis.
3. Optioneel: passeren monster door een 0.22 urn filter (om te zuiveren voor virale deeltjes)
4. Optioneel: voorbehandelen monster met DNAse (voor het hosten genomisch DNA af te breken en te zuiveren voor beschermde, encapsidated viraal nucleïnezuur) met behulp van de Turbo DNAse kit (Ambion) volgens de instructies van de fabrikant
5. Extraheer het monster met behulp van de Zymo ZR Viral RNA-extractie Kit of Qiagen Ultrasens Virus Kit volgens de instructies van de fabrikant.

2. Reverse transcriptie en 2 ^e-streng cDNA Synthese ("Round A")

1. Voeg 1 uL 40 pmol / ul Primer A tot en met 4 ul geëxtraheerde RNA. Verwarm tot 65 ° C laten gedurende 5 min in een thermocycler (bijv. GeneAmp PCR System 9700) en daarna afkoelen bij kamertemperatuur x 5 minuten.
2. Voeg 5 ul van een master mix die bestaat uit 2 pl 5X RT buffer, 1 ui 12,5 mM dNTP, 1 ui water, 0,5 pi 0,1 M DTT, en 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen). Incubeer bij 42 ° C x 60 minuten.
3. In een programmeerbare thermocycler, warmte tot 94 ° C x 2 min (af te breken van de reverse transcriptase reactie), afkoelen tot 10 ° C, pols centrifuge, en voeg dan 5 microliter Sequenase mix, bestaande uit 1 ui 5X Sequenase buffer, 3,8 uL water, en 0,15 pi Sequenase (USB Corporation). Voor de 2 ^e streng synthese, op helling van 10 ° C tot 37 ° C gedurende 8 min, 8 min, vervolgens warmte vasthouden aan 94 ° C x 2 min (tot Sequenase inactiveren) en laat afkoelen tot 10 ° C (houden).
4. Optioneel: Rd Een voorbeeld van een cDNA kan worden opgeslagen op dit punt bij -20 ° C.

3. PCR-amplificatie van willekeurige primer CDNA ("Round B")

1. Voeg 5 uL van Rd Een steekproef tot 45 ul van een master mix bestaande uit 5 ul 10X PCR-buffer, 1 ui 12,5 mM dNTP, 1 ui 100 pmol / ul primer B, 1 ui KlenTaq LA (Sigma), en 37 pi water.
2. Run PCR-protocol als volgt: 94 ° C, 2 min → (25 cycli van 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( ingedrukt houden)
3. Controleer de Rd B monster op een 1,5% agarose elektroforese gel. Een uitstrijkje van ongeveer 200 - 1000 bp moet worden gevisualiseerd (Figuur 2A)

4. Cy3 fluorescerende kleurstof Incorporation

1. Optioneel: een ander monster kan worden gelabeld met de Cy5 fluorescente kleurstof en gehybridiseerd op hetzelfde microarray.
2. Op te nemen aa-dNTP, voeg 5 uL van Rd B monster op 45 uL van een master mix bestaande uit 5 uL 10X PCR-buffer, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / ul primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), en 37 uL water. Run PCR-protocol als volgt: 94 ° C, 2 min → (15 cycli van 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( ingedrukt houden)
3. Reinig de Rd C monster met het DNA Schoon en Concentrator-5 Kit (Zymo Onderzoek) volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 10 pi.
4. Voeg 1 uL van 1M bicarbonaat (Sigma) en 1 uL Cy5 (GE Healthcare) aan de Rd C monster.
5. Incubeer x 1 uur in het donker.
6. Reinig de Cy3-gelabelde monster met het DNA Schoon en Concentrator-5 Kit (Zymo Onderzoek) volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 12 uL.

5. Hybridisatie aan Virochip Microarray

1. Optioneel: gebruik 1,5 pi tot cDNA concentratie en de hoeveelheid kleurstof opgericht op een Nanodrop spectrofotometer cheque (voor de normalisatie van de monsters)
2. In een PCR-strook buis voeg 1 ui 25X fragmentatie buffer, 5 ul 5x blokkerende buffer, 9,5 pi (of het bedrag te normaliseren) van Cy3-gelabeld monster, en water tot een totaal volume van 25 pi (Agilent)
3. Voeg 25 ul van 2X Gex hybridisatiebuffer (Agilent). Kort spin down om luchtbellen te verwijderen.
4. Belasting 40 pl van het monster op pakking dia.
5. Plaats Agilent bedrukte Virochip array (Universiteit van Californieen, San Francisco / Agilent) (kant met de aanduiding "Agilent" down), op de top van pakking glijbaan en goed vast schroeven.
6. Hybridiseren 's nachts in 65 ° C oven, snelheid instelling op 10 toeren per minuut.
7. Om arrays, verwarm buffer 2 (Agilent) wassen tot 37 ° C. Uit elkaar te halen pakking schuif / array sandwich onderwater in buffer 1 (Agilent). Was in buffer 1 x 1 min. Was in de voorverwarmde buffer 2 x 1 min. Verwijder langzaam dia uit buffer 2, let daarbij goed op luchtbellen te vermijden (gebruik kimwipe om weg te lont extra vocht wordt voorzichtig om te voorkomen dat rechtstreeks aan te raken actieve kant van de array)
8. Plaats dia in diahouder en invoegen in array-scanner.

6. Virochip Scanning en analyse

1. Scan Cy3-gelabeld array op 5 micrometer of 2 micrometer volgens de instructies van de standaard scanning protocol (Figuur 2B).
2. Analyseer Virochip microarrays door middel van visuele inspectie, cluster analyse, of de geautomatiseerde Virochip analyseprogramma, E-Predict ^11. Door elk van deze drie methoden, is influenzavirus gemakkelijk gedetecteerd in de neus wattenstaafje monster (van een kind met influenza-achtig ziektebeeld) (figuur 2C)

7. Representatieve resultaten:

Wanneer het protocol goed wordt gedaan, moet een uitstrijkje te zien op agarosegelelektroforese na de Rd stap B (Figuur 2A). De Virochip microarray op de Agilent platform zal moeilijk worden om visueel te analyseren (figuur 2B), maar als een virus aanwezig is moet het gemakkelijk worden geïdentificeerd door middel van visuele inspectie, cluster-analyse, en / of E-Voorspel (figuur 1C). Monsters kunnen worden verrijkt met afgepaste hoeveelheden nucleïnezuur van een bekend virus (bijv. tabak mozaïek virus; MS2 bacteriofaag) om te dienen als een positieve controle voor de test.

Figuur 1. Schematische voorstelling van Virochip microarray verwerking en analyse. Extracted nucleïnezuur uit klinische monsters worden willekeurig versterkt, gelabeld met fluorescente kleurstoffen, en gehybridiseerd aan de Virochip microarray. Microarrays worden gescand op 2 micrometer resolutie en geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van computationele instrumenten, waaronder E-Predict.

Figuur 2. Stappen in de Virochip assay Na amplificatie door willekeurige PCR, een uitstrijkje van 200 -. 1.000 bp kunnen worden gevisualiseerd door gelelektroforese (A) (B) Drie Virochip microarrays van de 8 arrays / glasplaatje worden getoond, met een kleine regio. van een microarray opgeblazen in de inzet op de rechter benedenhoek. (C) Geautomatiseerde microarray-analyse met behulp van virale E-Voorspel het openbaren van de aanwezigheid van influenza A-virus in de klinische monster. De hoge gelijkenis score (s = 0,55) komt overeen met een p-waarde die dicht bij nul, waardoor dit een zeer belangrijke voorspelling.

Discussion

De Virochip protocol zoals hier beschreven is complex en vereist een zorgvuldige en vakkundige research analist. De juiste reagens concentraties en de voorwaarden voor PCR, etikettering, en hybridisatie zijn van cruciaal belang. De Virochip protocol kan eenvoudig worden aangepast om de analyse van zieke weefsels door het gebruik van een tissue-extractie methode zoals TRIzol (Invitrogen) voor nucleïnezuur extractie tegemoet te komen. Probes kunnen worden toegevoegd of verwijderd als nodig is om het gewenste spectrum en de breedte van de dekking te verkrijgen, bijvoorbeeld, probes voor de detectie van niet-virale doelstellingen zoals bacteriën en schimmels kunnen worden ontworpen en toegevoegd "on-the-fly". Enkele toepassingen van de Virochip test momenteel in ontwikkeling zijn onder een breed spectrum virale diagnostiek in het klinisch laboratorium, onderzoeken van uitbraken, zuiverheid screening van geneesmiddelen en vaccins, en nieuwe virale ziekteverwekker ontdekking.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens / materiaal	Naam van het reagens / materiaal
Primera	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 '
Primer B	5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 '
RT Master Mix (5 pi)	2 pl 5X RT buffer
	1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 ui water
	0,5 pi 0,1 M DTT
	0,5 pi SSIII RT (Invitrogen)
Sequenase Mix (5 pi)	1 ui 5X Sequenase buffer
	3,8 pi water
	0,15 pi Sequenase (USB Corporation)
Rd B PCR Master Mix (45 pi)	5 ul 10X PCR-buffer
	1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 pi 100 pmol / ul primer B
	1 pi KlenTaq LA (Sigma)
	37 pi water
Rd C PCR Master Mix (45 pi)	5 uL 10X PCR-buffer
	1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen)
	1 pi 100 pmol / ul primer B
	1 pi KlenTaq LA (Sigma)
	37 pi water
Hybridisatiebuffer (25 pi)	1 ui 25X fragmentatie buffer (Agilent)
	5 ui 5X blokkerende buffer (Agilent)
	9,5 pi (of het bedrag te normaliseren) van Cy3-gelabelde sample
	Verdun met water tot totaal volume van 25 ui
Agilent Virochip microarray	vergunning verlenen in afwachting; die beschikbaar zijn vanaf Chiu laboratorium, UCSF