Voor de beoordeling van de In vivo Effecten van therapeutische interventies voor spier-en vaatziekten, zijn methoden nodig om de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier kwantificeren. We detail een methode om te beoordelen myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd muis achterbeen spieren. Deze analyse geeft een robuuste aanpak ontwikkelen om kwantificeren van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie, evenals de vergelijking van therapieën in muismodellen van spierziekte.
Methodenartikel
Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Om de in vivo effecten van therapeutische interventies voor de behandeling van spierziekte 1,2,3, zijn kwantitatieve methoden nodig die maatregel de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier. Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in vers geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. We beschrijven de atraumatische oogst van de muis extensor digitorum longus, de montage van de spier in een spier strip myograph (Model 820MS; Deense Myo Technology), en de meting van de maximale twitch en tetanische spanning, samentrekking tijd, en half-relaxatie tijd, met behulp van een square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Met behulp van deze metingen, tonen we de berekening van de specifieke twitch en tetanische spanning genormaliseerd naar spier dwarsdoorsnede, de twitch-to-tetanische spanning ratio, de kracht-frequentie relatie curve en de lage frequentie curve vermoeidheid 4. Deze analyse biedt een methode voor kwantitatieve vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5, evenals de vergelijking van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9.
Protocol
Het protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
1. Dissectie van de muis extensor digitorum longus (EDL) Muscle
- Voer alle dierlijke procedures in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.
- Euthanaseren van dieren met 200 mg / kg intraperitoneaal pentobarbital / cervicale dislocatie net voor de spieren oogst 10. De dissectie moet zo goed worden beoefend, dat de spier kunnen worden geoogst en gemonteerd in de spanning transducer binnen 15 minuten van euthanasie.
- Schik karkas rugligging op dissectie tray en pin been naar de tray.
- Onder dissectie microscoop, open huid, voorzichtig open fascia (Fig.1A), en de schil tibialis van de enkel naar boven bloot te leggen EDL (Fig.1B). Gebruik druppels Ringerlactaat te houden van de spieren vochtig en gebufferd tijdens de oogst.
- Verwijder de EDL, met behoud van zo veel pees mogelijk op elk uiteinde, en in een petrischaal met Ringer-Lactaat oplossing. Tie hechting aan elk van de pezen van de spieren (Fig.1C). Het is essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt of gestoord tijdens de dissectie.
2. Montage van de Muis EDL in de Muscle Strip Myograph
- Voor deze studies, is een weefsel bad nodig die stelt de spier tijdens het op in fysiologische oplossing baden bij constante temperatuur met continue zuurstof. Het bad is gekoppeld aan een krachtopnemer voor het meten van spierspanning. Wij maken gebruik van een geïntegreerd spier strip myograph bad van Deense Myo Technologie (DMT Model 820MS) voor dit doel. Daarnaast worden een vierkant puls elektrische stimulator (Grass Model S48) en data-acquisitie platform (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System en LabChart software) die nodig is om te lokken, en opnemen analyseert myo-mechanische reacties, respectievelijk. De DMT 820MS heeft platina-elektroden geïntegreerd in het deksel van die zijn geplaatst aan weerszijden van de spier, in het midden-gedeelte van de spier strip. Andere myographs kunnen vereisen specifieke aandacht voor de plaatsing van de elektroden.
- Vul myograph bad met 5 ml Krebs Henseleit-oplossing 11. Warm tot 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) via bad gedurende 15 minuten voorafgaand aan gebruik.
- Gebruik hechtingen aan EDL uit te breiden tussen de klemmen van myograph en de pezen van de EDL spier (Fig.1D, E) veilig tussen de klemmen. Wees voorzichtig dat u de spier zelf klem.
- Handhaaf myograph bad bij 25 ° C.
3. Myo-mechanische analyse
A. Twitch spanning
- Stel de eerste lengte in het bad, zodat er geen spier laksheid.
- Bepaal maximale stimulus (duur 0,5 ms) door het aanpassen van spanning om maximale twitch spanning te verkrijgen, vervolgens stimulus op 20% boven de maximale (tot supramaximale stimulus te bereiken). In onze studies, is het supramaximale stimulus meestal bereikt bij een uitgang van 40 volt.
- Controleer of uitgang van de stimulator met behulp van een oscilloscoop.
- Bepaal optimale lengte door geleidelijk het uitrekken van de spier totdat er geen verdere toename van de twitch spanning.
- Laat spieren in evenwicht gedurende 3 minuten.
- Lever supramaximale vierkante stimulus (0,5 ms) bij optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output.
- Record: twitch spanning curve (P t vs tijd; fig. 2a).
B. Tetanus spanning
- Laat spieren rusten gedurende 3 minuten.
- Breng een trein van supramaximale stimuli voor 300msec op 150 Hz op optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output.
- Record: tetanus spanning curve (P o vs tijd; Fig.2B).
C. Force-frequentie
- Laat spieren rusten gedurende 3 minuten.
- Force-frequentie: van toepassing treinen van supramaximale stimuli op 30, 60, 100, 140, en 160 Hz met 3 minuten rust tussen elke stimulus (Fig.3). Als alternatief kunnen treinen worden toegepast 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 en 160 Hz voor een betere resolutie bij lagere frequenties, waar de kracht verandert aanzienlijk.
- Plot: kracht-frequentie relatie (% maximale kracht vs stimulatie frequentie).
D. Vermoeidheid
- Van toepassing zijn trein van korte tetani: 60 Hz voor 300 ms (of frequentie ingesteld op 50% van de piek kracht produceren), elke 3 seconden gedurende 10 minuten. Met 10 minuten, moet de tetanische kracht dalen tot een plateau niveau van ~ 15% van de oorspronkelijke waarde (Fig.4).
- Plot: lage frequentie vermoeidheid (% maximale kracht vs tijd).
E. Aanvullende gegevens verzamelen aan het eind van het protocol
- Voordat ontkoppelen de spier van de myograph, stelt u de Muscle op optimale lengte, zoals bepaald in stap III.A.4 en meet de diameter met behulp van een oculair op de microscoop of met remklauwen. Bereken doorsnede (um 2).
- Meet spiermassa (mg) door het verwijderen van hechtingen en een gewicht van spieren.
- Weeg de muis om het lichaamsgewicht (g) te beoordelen.
4. Berekeningen
- Spier: body mass ratio =
spiermassa / body mass - Twitch spanning, P t (mN) =
maximale spanning die tijdens twitch - Specifieke twitch spanning (N / cm 2) =
twitch spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Tijd om piek spanning (ms) =
de tijd vanaf het begin van de contractie om een maximale spanning - Half-relaxatietijd (ms) =
tijd van piek spanningen tot 50% van de piek spanning - Tetanische spanning, P O (MN) =
maximale spanning die tijdens tetanus - Specifieke tetanische spanning (N / cm 2) =
tetanische spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 - Maximale snelheid van de stijging van tetanus (N / s) =
maximumpercentage van de stijging van de spanning tijdens de spanning stijging van tetanus, dat wil zeggen, de maximale helling van de tetanische spanning curve (of, dP O / dt) - Half-relaxatie tetanische spanning (ms) =
tijd van beëindiging van stimulatie tot 50% van de spanning bij beëindiging van de stimulatie - Twitch spanning-to-tetanische spanning ratio, P t / O = P
maximale twitch spanning / maximale tetanische spanning - Vermoeidheid index =
verhouding van de spanning na twee minuten met een lage frequentie vermoeidheid tot maximale isometrische spanning
5. Representatieve resultaten
Figuur 1. Dissectie van EDL spier. A, Blootstelling van achterbeen muscles.TA, tibialis anterior. B, Blootstelling van EDL (extensor digitorum longus) spier. C, Bevestigen van hechtingen aan EDL pezen. D, Tension transducer bad (view van de zijkant). E, EDL gemonteerd in bad (bovenaanzicht). De spier in onvolledig ondergedompeld in de buffer voor illustratieve doeleinden, in de praktijk, de spier moet volledig worden ondergedompeld om te voorkomen dat uitdroogt.
Figuur 2. Voorbeeld van spanning bochten. A, voorbeeld van de twitch spanning curve illustreert maximale twitch spanning (P t), contractie tijd (CT) en de half-relaxatietijd (HRT). Bar, 1s. B, Voorbeeld van tetanische spanning lijn die de maximale tetanische spanning (P o) en half-relaxatie tetanische spanning (HRTT). Bar, 1s.
Figuur 3. Voorbeeld van een kracht-frequentie-relatie-analyse. A, spanningen opgewekt door incrementele stimulatie frequenties. B, Voorbeeld van een puls trein op 30MHz. Bar, 80ms. C, Voorbeeld van een puls trein op 140MHz. Bar, 80ms. D, Voorbeeld van een kracht-frequentie curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de kracht-frequentie curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren.
Figuur 4. Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid-analyse. A, afnemende spanningen opgewekt over periode van lage frequentie stimulation.Examples van pulsreeksen bij bepaalde tijdstippen (B, C, D) worden hieronder weergegeven. E, Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de lage frequentie vermoeidheid curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren.
Discussie
Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. De EDL, terwijl moeilijker te ontleden vanwege de achterste positie achter de tibialis anterior spier, is gemakkelijker te beoordelen dan de tibialis anterior vanwege zijn prominente tendineuze bijlagen aan de enkel-en kniegewrichten. Deze pezen voor montage in de spier strip myograph. In tegenstelling tot de meer gemakkelijk bereikbaar tibialis anterior heeft een brede, bijna atendinous gehechtheid aan het kniegewricht, waardoor het buitengewoon moeilijk om zowel ontleden, zonder afbreuk te doen aan de spier, en veilig monteren in de myograph. We wijzen er ook op dat snel monteren van de spier in een zuurstofrijke bad in fysiologische buffer en de temperatuur is essentieel voor het behoud van de spieren van de mechanische eigenschappen. We hebben ontdekt dat we deze analyse herhalen voor maximaal 30 minuten zonder significante veranderingen in de spieren reactie onder deze omstandigheden. Tot slot is het essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt tijdens de dissectie en montage procedures, omdat dit nadelige gevolgen kunnen hebben op de spierfunctie, en leiden tot onderschatting van myo-mechanische kracht. Door het volgen van deze procedures, deze analyse biedt een robuuste kwantitatieve benadering van de evaluatie van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9, evenals vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5 .
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een GGD Grant (HL086513) van NHLBI tot PEO, en een uitgebreide Research Grant van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RC1-00104), een Public Health Service Grant (HL085377) van NHLBI, en een gift van de Pollin Stichting HSB
SC werd ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde Bridges to Cell Research Award (TB1-01194) naar San Francisco State University Stem.
Materialen
Oplossingen en Media
Ringer-Lactaat oplossing
- 100 mM NaCl
- 30 mM CH3CH (OH) COONa (natrium lactaat)
- 4 mM KCl
- 1 mM CaCl 2 2H 2 O (calcium chloride dihydraat)
- de pH instellen op 6,75
Krebs Henseleit oplossing
- 118 mM NaCl
- 4,7 mM KCl
- 1,25 mM CaCl 2
- 1.2 mM MgCl 2
- 1,2 mM KH 2 PO 4
- 25 mM NaHCO 3
- 11 mM glucose
- breng de pH op 7,2-7,4 door equilibreren met O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas
Pentobarbital
- 5 mg / ml werkoplossing in steriel water
Referenties
- Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue. Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).
- Messina, S. VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice. FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).
- Danieli-Betto, D. Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue. Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).
- MacIntosh, B. R., Willis, J. C. Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).
- Hayes, A., Williams, D. A. Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming. J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).
- Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties. Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).
- Danieli-Betto, D. Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).
- Chan, S. A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).
- Personius, K. E. Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice. J Appl. , Forthcoming (2010).
- Donovan, J., Brown, P. Euthanasia. Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).
- Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II. Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).
Herprints en machtigingen
