Methodenartikel

Finger-stick Blood Sampling Methode voor de bepaling van lichamelijke oefening geïnduceerde apoptose Lymfocyt

DOI:

10.3791/2595

⸱

24 februari 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Kinesiology, Recreation, and Sport, Western Kentucky University, 2Department of Health and Human Performance, University of Houston

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De uitoefening in staat is om apoptose in immuuncellen. Er zijn verschillende meet-beperkingen, met name met betrekking tot de hoeveelheid tijd die nodig is om te isoleren en te behandelen een bloedmonster voorafgaand aan de beoordeling. Aangetoond is een snelle en minimaal invasieve procedure voor de analyse van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De oefening is een fysiologische stimulus in staat is het induceren van apoptose in immuuncellen. Tot op heden zijn er diverse beperkingen geïdentificeerd met het meten van dit fenomeen, met name met betrekking tot de hoeveelheid tijd die nodig is om te isoleren en te behandelen een bloedmonster voorafgaand aan de beoordeling van celdood. Vanwege dit, is het moeilijk om vast te stellen of melding van een toename in de immuun cel apoptose kan worden bijgedragen aan het werkelijke effect van de oefening op het systeem, of zijn een weerspiegeling van de tijd en de verwerking noodzakelijk is om uiteindelijk te verkrijgen deze meting. In dit artikel zullen we laten zien een snelle en minimaal invasieve procedure voor de analyse van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten. In tegenstelling tot andere technieken, is volbloed toegevoegd aan een antilichaam panel onmiddellijk na het verkrijgen van een monster. Na de incubatieperiode, worden de rode bloedcellen gelyseerd en monsters zijn klaar om te worden geanalyseerd. Het gebruik van een vinger-stick sampling procedure vermindert de benodigde hoeveelheid bloed, en minimaliseert het ongemak te onderwerpen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Finger-Stick Blood Sampling

  1. Het verzamelen van bloed is die gewoonlijk in rust voor een nulmeting (meestal na 10-15 min gezeten rust), tijdens of onmiddellijk na een oefening bout, en de rest van de post-training periode (over het algemeen van 1-3 uur na de beëindiging van de oefening).
  2. Met behulp van universele voorzorgsmaatregelen, eerst steriliseren van de vingertop met 70% isopropyl alcohol.
  3. Vervolgens prikken de site met behulp van een geautomatiseerd lancet of soortgelijk apparaat. Hoewel we gebruik van een 30-gauge lancet om te voorzien in onderwerp comfort, zou een grotere naald worden gebruikt.
  4. Veeg de eerste druppel bloed, en verzamel bloed in capillaire buizen of microvettes behandeld met lithium heparine ter voorkoming van bloedstolling.

2. Cel Fenotypering en Apoptosis kleuring

  1. Voeg 10 uL gehepariniseerd bloed naar titred antilichaam panel in 250 ul bindingsbuffer (zie tabel 1 schema). We hebben gebruik gemaakt van een 1:20 verdunning met succes, maar elk laboratorium moeten titre de reagentia aan de beste werkende oplossing te bepalen.
    Tabel 1. Antilichaam paneel voor de bepaling van de oefening-geïnduceerde apoptose in leukocyten subsets. Begin van de apoptose werd gedefinieerd door de expressie van annexine V, terwijl de late apoptose werd gedefinieerd door dubbele positieve etikettering met Annexine V en 7-AAD. Necrotische cellen werden Annexine V-en 7-AAD + cellen alleen.
    Buis 1 Buis 2 Buis 3 Buis 4
    Cellen alleen buis Annexine V - FITC Annexine V - FITC Annexine V - FITC
    Anti Human CD4 - PE Anti Human CD8 - PE Anti Human CD19 - PE
    7-AAD 7-AAD 7-AAD
    Anti Human CD45RA - APC Anti Human CD45RA - APC

    7-AAD = 7-Amino-actinomycine D, APC = Allophycocyanin, CD4 = Helper T-lymfocyten, CD8 = Suppressor / cytotoxische T lymfocyten, CD19 = B-lymfocyten, CD45RA = naïeve cel subsets, FITC = Fluoresceïne isothiocyanaat, PE = fycoerythrine.
  2. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
  3. Centrifugeer bij 1075 xg gedurende 5-10 minuten.
  4. Decanteren, voeg 300 ul Red Blood Cell Lysis Buffer, en grondig vortex.
  5. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  6. Voeg 300 ul PBS naar RBC lysis reactie te stoppen.
  7. Centrifugeer bij 1075 xg gedurende 5-10 minuten.
  8. Decanteren, rack, en voeg 50 ul bindende buffer.
  9. Analyseren door flowcytometrie.

Het wordt aanbevolen dat bij een minimaal de volgende controles worden gebruikt: een cellen alleen buis om te dienen als een negatieve controle bij het opsporen achtergrond autofluorescentie, en buisjes met elk individu fluorochroom op schadevergoeding ingesteld tijdens de eerste opzet van de flowcytometer. Daarnaast hebben we gebruik vergoeding standaard kralen met succes aan het opzetten van onze experimenten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een minimaal invasieve monstername procedure en de daarop volgende analyse is aangetoond voor de analyse van zowel de vroege en late fase van de oefening geïnduceerde apoptose lymfocyten. Het is ook mogelijk om duidelijk uit te sluiten die cellen, die zijn necrotische en apoptotische niet. Deze procedure overwint de nadelen en ongemak dat verbonden is met invasieve venapunctie uit de antecubitale regio op verschillende tijdstippen voor, tijdens en onmiddellijk na de inspanning, of vastzetten van een katheter voor de duu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door een nieuwe faculteit Grant van de faculteit Scholarship Council van Western Kentucky University.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bindingsbuffer voor flowcytometrieeBioscience00-4222-26
RBC-lysisbuffereBioscience00-4333-57
LancetapparaatAccu Check Soft TouchRoche Group
Capillaire buisjesGehepariniseerde capillaire buisjesChase Scientific Glass, Inc.501
CentrifugeGmC LabGilson, Inc.PMS-880
Annexine V-FITC conjugaatBiovision Inc.K201-400-1
CD4-PE conjugaatAnti-human, kloon RPA-T4eBioscience12-0049-42
CD8-PE conjugaatAnti-human, kloon OKT8eBioscience12-0086-73
CD19-PE conjugaatAnti-human, kloon HIB19eBioscience12-0199-42
7-AAD viabiliteitskleuringsoplossingeBioscience00-6993-50
CD45RA-APC conjugaatAnti-human, kloon HI100eBioscience17-0458-42
FlowcytometerC6Accuri

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans. Res. Sports Med. 15, 157-174 (2007).
  2. Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes. Eur. J. Appl. Physiol. 87, 38-42 (2002).
  3. Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., Völker, K. Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise. J. Appl. Physiol. 93, 147-153 (2002).
  4. Peters, E. M., Eden, M. V. an, Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes. Eur. J. Appl. Physiol. 98, 124-131 (2006).
  5. Wang, J. -S., Huang, Y. -H. Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men. Eur. J. Appl. Physiol. 95, 290-291 (2005).
  6. Mooren, F. C., Lechtermann, A., Völker, K. Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status. Med. Sci. Sports Exerc. 36, 1476-1483 (2004).
  7. Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -S. Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise. Med. Sci. Sports Exerc. 37, 369-373 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrielysis van rode bloedcellenAnnexine V kleuringinspanningsge nduceerde apoptoseanalyse van volbloedlymfocytensubfractiesmonsterneming via capillaire buisincubatie van antilichaampanel

Gerelateerde artikelen