Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Summary

Een flow-cytometrische methode voor de identificatie en moleculaire analyse van differentiatie-fase-specifieke muriene erytroïde voorlopers en precursoren, direct in vers geoogste muis beenmerg, milt of foetale lever. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en de celgrootte.

Abstract

De studie van de erytropoëse wil om te begrijpen hoe rode cellen worden gevormd uit eerdere hematopoëtische en erythroid voorlopers. In het bijzonder, is de snelheid van de rode bloedcellen de vorming gereguleerd door het hormoon erytropoëtine (EPO), waarvan de synthese wordt geactiveerd door weefselhypoxie. Een bedreiging voor een adequate zuurstofvoorziening van de weefsels resulteert in een snelle toename van EPO, het rijden een verhoging van de erytropoëtische tarief, een proces dat bekend staat als de erytropoëtische stress respons. De daaruit voortvloeiende toename van het aantal circulerende rode bloedcellen verbetert weefsel zuurstof levering. Een efficiënte erytropoëtische reactie op stress is dan ook van cruciaal belang voor het overleven en herstel van fysiologische en pathologische omstandigheden, zoals grote hoogte, bloedarmoede, bloedingen, chemotherapie of stamceltransplantatie.

De muis is een belangrijke model voor de studie van de erytropoëse en de reactie op stress. Muis definitieve (volwassen-type) erytropoëse vindt plaats in de foetale lever tussen embryonale dag 12,5 en 15,5, in de neonatale milt, en bij volwassen milt en beenmerg. Klassieke methoden voor het identificeren erytroïde voorlopercellen in het weefsel vertrouwen op het vermogen van deze cellen om aanleiding te geven tot rode bloedcellen kolonies toen bedekt met Epo-bevattende semi-vaste media. Hun erytroïde voorloper nakomelingen zijn geïdentificeerd op basis van morfologische criteria. Geen van deze klassieke methoden toegang tot een groot aantal van differentiatie-fase-specifieke erythroïde cellen voor moleculair onderzoek. Hier presenteren wij een flow-cytometrische methode voor het identificeren en bestuderen van differentiatie-fase-specifieke erytroïde voorlopers en voorlopers, direct in de context van vers geïsoleerde muis weefsel. De test is gebaseerd op het celoppervlak markers CD71, Ter119, en op de flow-cytometrische 'forward-scatter' parameter, die een functie is van de celgrootte. De CD71/Ter119 assay kan worden gebruikt om erythroïde voorouders bestuderen tijdens hun reactie op erytropoëtine stress in vivo, bijvoorbeeld bij anemische muizen of muizen ondergebracht in lage zuurstofgehalte. Het kan ook worden gebruikt om erythroïde voorouders studie direct in de weefsels van genetisch gemodificeerde volwassen muizen of embryo's, om de specifieke rol van de gewijzigde moleculaire route in erytropoëse te beoordelen.

Protocol

1. Oogsten van de weefsels

1. Bereid buisjes met 2 tot 5 ml koude vlekken buffer (fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met toegevoegde 0,2% BSA en 5mm glucose). Houden buizen op ijs voorafgaand aan de weefsel oogst.
2. Cull muizen volgens passende goedgekeurde protocol (bv CO ₂ inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie).
3. Trekken bloed door het hart doorboren in EDTA of heparine bloed-collectie buizen voor latere analyse, bijvoorbeeld van de hematocriet, aantal reticulocyten of CBC-analyse.
4. Oogst de milt en de botten, het plaatsen van weefsels van elke muis in een aparte buis, bereid in stap 1. Gemakkelijke toegang tot milt is vanaf de linkerkant. Voor het beenmerg, oogst een of beide bovenbenen. Houden geoogst weefsel op het ijs.
5. Indien gewenst, wegen de milt. Muizen ondergaat een erytropoëtische reactie op stress zijn waarschijnlijk een aanzienlijke stijging van de milt gewicht te tonen.

2. Voorbereiding van de milt-cellen

1. Met behulp van een pre-bevochtigd 3 ml spuit zuiger, duw de milt, of een deel van de milt (idealiter, 0,1 gram of minder, wat overeenkomt met ongeveer 10 ⁸ cellen) door een 40 um steriele cel zeef (Fisherbrand catalogusnummer 22363547 of andere) geplaatst op de top van een 50 ml conische buis. Houd de buis op ijs tijdens deze procedure. Was de cellen door de zeef met een totaal van 2 ml vlekken buffer.
2. Voorzichtig pipet de gespannen celsuspensie te breken elke kleine bosjes. Indien nodig, re-stam van de cellen.
3. Twee keer wassen van de cellen door centrifugeren en resuspendeer in koude buffer.
4. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Typische rendementen zijn 1-2 x 10 ⁸ cellen / milt. Voor flow-cytometrie analyse, aliquote 1 tot 2 miljoen cellen per monster, ofwel in FACS kleuring buizen (BD Falcon polystyreen ronde bodem buizen, 352008) of U-bodem 96 wells plaat (BD Falcon 353.910). Monster vlekken volume is 200 ui, tot een uiteindelijke celconcentratie 0,5 tot 1 x 10 ⁷ cellen / ml of 1-2 x 10 ⁶ cellen / 200 pi monster.

3. Voorbereiding van beenmergcellen

1. Bereid 1 of 3 ml spuiten met een aangesloten 26G naald, vooraf gevuld met koude kleuren buffer.
2. Verwijder de spieren aan het dijbeen om zo tot op het bot duidelijk te visualiseren.
3. Met behulp van scherpe chirurgische schaar, knip beide uiteinden van het dijbeen, zo dicht mogelijk bij de uiteinden van het bot. Dit zou wijzen op een klein gat aan beide afgesneden uiteinde, die leidt naar het beenmerg holte, die loopt door de lengte van het dijbeen.
4. Met behulp van de voorgevulde spuiten in stap 1, steek de naald door een van deze gaten, en zachtjes spoelen het merg uit door het gat aan de andere kant, in een buis.
5. Distantiëren van de cellen gespoeld door zachte pipetteren, en de stam door een 40 um zeef als voor de milt hierboven (zie paragraaf 2.1).
6. Twee keer wassen cellen door centrifugeren in een koude vlekken buffer
7. Tel het aantal cellen en resuspendeer zoals in paragraaf 2.4. Typische rendementen zijn ongeveer 10 ⁷ cellen per dijbeen.

4. Voorbereiding van de foetale levercellen

1. Voor te bereiden getimede-zwangere vrouwelijke muizen, muizen opgezet om te paren in de avond; te onderzoeken voor vaginale stekkers voor 10 uur de volgende dag, de dag waarop de vaginale plug wordt gedetecteerd wordt beschouwd als dag 0,5. Diergeneeskundig personeel in staat zijn om onderzoekers die onbekend zijn met deze techniek aan zwangere vrouwen te identificeren helpen. Zwangerschap kan ook worden bepaald door monitoring muis gewicht.
2. Timed-zwangere vrouwelijke muizen zijn afgemaakt op dag 12,5 tot 14,5 van de zwangerschap. De baarmoeder hoorns worden verwijderd in een Petri-schotel met ijs-koud kweekmedium of vlekken buffer.
3. Embryo's worden verwijderd uit elke baarmoeder en de foetale lever wordt ontleed. Een dissectiemicroscoop is vereist voor embryonale dag 12,5 (E12.5) of jonger.
4. Levers kan mechanisch worden gescheiden door pipetteren in buffer, en zijn individueel verwerkt in platen met 96 putjes, of samen gebundeld, afhankelijk van de experimentele eisen.
5. Een foetale lever op E13.5 heeft ~ 10 ⁷ cellen. Cellen worden twee keer gewassen in de kleuren van buffer en geresuspendeerd bij 1-2 x 10 ⁶ cellen / ul 200 monster voor flowcytometrische analyse.

5. Antilichaam kleuring voor flowcytometrie

1. Bereid een primair antilichaam kleuringen pre-mix te worden gebruikt voor alle monsters, behalve voor controle monsters, met de volgende:
   • ChromePure Rabbit IgG (Jackson, 015-000-003), tot een uiteindelijke concentratie van 200μg/ml. Controleer de voorraad concentratie op de fles (het kan verschillen). Dit wordt gebruikt om Fc-receptoren te blokkeren in muizencellen, alternatieve soorten die gebruikt kunnen worden voor deze muis zijn IgG of rat IgG. Soort keuze wordt bepaald door de mogelijke aanwezigheid in de kleuringsprotocol van secundaire antilichamen gericht tegen de primaire rat / muis / konijn antilichamen, in welk geval deze soorten kunnen niet worden gebruiktd als blokkerende antilichamen. Als alternatief kan 5% konijn serum ook worden gebruikt in plaats van gezuiverd IgG. Een ander alternatief is het gebruik van monoklonale antilichamen of Fab fragmenten gericht op de muis Fc-receptoren. De basis-protocol hieronder bevat geen secundaire antilichamen IgG en dus van een van de drie soorten worden gebruikt.
   • CD71-FITC, verdund 1:200 (voorraad 0.5mg/ml, BD-Biosciences, 553266)
   • Ter119-PE, verdund 1:200 (voorraad 0.2mg/ml, BD-Biosciences, 553673)
   • Eventuele aanvullende antilichamen die zijn gericht aan het oppervlak epitopen van belang, zoals antilichamen die gericht zijn op Fas of FasL (zie ^1,2). Meng voorzichtig het antilichaam oplossing door het buisje om 2-3 keer.
2. Voeg 200 ul van de pre-mix om elke cel monster en voorzichtig resuspendeer de cellen.
3. Bereid controle cel monsters als volgt:
   • 'Onbesmet': deze cellen worden achtergelaten in vlekken buffer en vormen de achtergrond autofluorescentie van de cellen.
   • 'Single kleur' ​​controls: een dergelijke controle is nodig voor elk antilichaam / kleur die wordt gebruikt in het protocol. De cellen in deze controles zijn ofwel gekleurd met een direct geconjugeerd primair antilichaam, of met zowel een primair antilichaam en een geconjugeerd secundair antilichaam. Deze controles worden gebruikt om te corrigeren voor spectrale overlap tussen de kanalen.
   • 'Fluorescence minus one' (FMO) controles: een dergelijke controle is nodig voor elk antilichaam / kleur in het protocol: cellen zijn gekleurd met alle kleuren / antilichamen in het protocol, behalve voor de kleur / antilichaam waarvoor dit is de FMO te controleren. De FMO controle voor een bepaald kanaal biedt de ware achtergrond voor dat kanaal. Het kan ook niet-specifiek antilichaam van hetzelfde isotype en geconjugeerd met dezelfde fluorescentie merk niet als het te testen antilichaam (isotype controle).
4. Incubeer monsters en relevante controles in het primaire antilichaam vlek op het ijs voor 45 'tot 1 uur in het donker (zet aluminium folie op het ijs-bak).
5. Aan het einde van de incubatie, wassen van de cellen door het toevoegen van 3 ml van vlekken buffer aan elk monster buis en spin voor 3 'naar 5' op ongeveer 400 xg bij 4 ° C. Bij gebruik van platen met 96 putjes, was de cellen drie keer in een volume van 200 pi.
6. Indien relevant, van toepassing secundair antilichaam vlek. Toe te passen en was als voor de eerste antilichaam vlek.
7. Indien relevant, is een vlek met Annexine V, aangelegd aan het einde van de incubatie, met behulp van een HEPES buffer zoals in de instructies van de fabrikant. Deze vlek wordt toegepast gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, of voor een uur op het ijs.
8. Cellen zijn opnieuw opgeschort voor flow-cytometrie analyse in kleuroplossing die een cel-DNA ondoordringbare kleurstof, om dode cellen te sluiten. Verschillende DNA-kleurstoffen zijn beschikbaar, waaronder propidiumjodide, 7-amino-actinomycine D (7AAD), of DAPI. De keuze uit onder deze is afhankelijk van de beschikbare kanalen, gelet op de kanalen voor specifieke antilichaam kleuring genomen, en kanalen beschikbaar op de flow-cytometer. 7AAD wordt verkregen uit BD-Biosciences (559.925) en gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Voor DAPI kleuring, maak een voorraad van 1mg/ml in dimethylformamide (DMF) uit poeder (Roche, Cat # 236276), te houden bij -20 ° C en verdun 1:10.000 tot 1:15,000 in vlekken buffer.

6. Flow-cytometric sorteren

1. Cellen zijn gelabeld met antilichamen tegen CD71, Ter119, afstamming markers, en een levensvatbaarheid kleurstof zoals beschreven voor flow-cytometrische analyse (hoofdstuk 5). Cel concentratie tijdens de etikettering kan worden verhoogd tot 5 x 10 ⁷ / ml.
2. Meng een gelijk volume van elk van de volgende antilichamen tegen de afstamming master mix te maken:
   • FITC Rat anti-muis-CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553848
   • FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2, BD Pharmingen 553087
   • FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11, BD Pharmingen 553061
   • FITC Rat Anti-Mouse CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557396
   • FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G en Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5, BD Pharmingen 553126
   • Gebruik de master mix op 1:80 (Dit komt overeen met 1:400 verdunning van elke individuele antilichaam aandelen, die allemaal 0,5 mg / ml).
3. Gebruik lage druk sorteren voorwaarden en brede sproeiers. Voor de Aria (BD Biosciences) gebruiken we 100 μ mondstuk, 20 psi druk.
4. Collectie buffer: PBS met toegevoegde 20% foetaal runderserum.
5. Het controleren van de zuiverheid van de gesorteerde populaties, re-run een kleine hoeveelheid van elk monster in een buffer die een levensvatbaarheid kleurstof bevat (7AAD of iets dergelijks).

7. Representatieve resultaten:

CD71/Ter119 kleuring van volwassen beenmerg of de milt identificeert een ontwikkelingsstoornis opeenvolging van vier subsets, gelabeld ProE, EryA, EryB en EryC (figuur ¹⁾ 1. Morfologisch, deze komen overeen met steeds meer volwassen erytroblasten. Figuur 1 illustreert de gating sequentie op de data-analyse fase, die zeer klein evenement (met inbegrip van kernen, rode bloedcellen), geaggregeerde cellen en dode cellen ontdoet.

Expressie van cel-oppervlakte-eiwitten kunnen gelijktijdig worden gemeten voor elk van deze subsets, door de toevoeging van de relevante antistoffen op hetzelfde tijdstip als Ter119 en CD71 vlekken. Figuur 1 toont een voorbeeld van een cel-oppervlakte-expressie van de dood receptor Fas ^1. Deze meting werd uitgevoerd bij muizen geïnjecteerd met Epo, of in de controle muizen geïnjecteerd met een zoutoplossing. Het is duidelijk dat Epo Fas expressie onderdrukt in de EryA bevolking in vivo ^1.

Expressie van intracellulaire eiwitten of celcyclus status kan ook worden gemeten voor cellen in elke subset. Figuur 2 illustreert vertegenwoordiger celcyclus analyse van de vers geoogste beenmergcellen. Deze metingen vereisen, in aanvulling op het celoppervlak kleuring met CD71 en Ter119, de fixatie en permeabilisatie van cellen voor intracellulaire etikettering (zie Overleg sectie).

In foetale lever, zijn niet-erythroïde cellen eerst uitgesloten door gating over 'Lin-' cellen die negatief zijn voor CD41, Mac-1, Gr-1, B220 en CD3 (figuur 3). De overige cellen zijn onderverdeeld in 6 subgroepen, S0 tot S5. De precieze patroon van de cellen in de foetale lever is afhankelijk van de embryonale leeftijd (zie Overleg sectie). Een vertegenwoordiger celcyclus analyse van de S3 subset in E13.5 foetale lever wordt getoond (figuur 4).

Figuur 1 De CD71/Ter119 erytroïde subsets in muis-milt A. Poortsignalen strategie:.. Miltcellen werden verwerkt en voorzien van antilichamen gericht tegen CD71, Ter119 en Fas. Deze figuur toont de analyse-strategie naar aanleiding van de data-acquisitie stap. Ik histogram toont alle verworven evenementen. De diagonale poort vertegenwoordigt gebeurtenissen die dreigen te worden enkele cellen, met uitzondering van doubletten of grotere aggregaten. Cellen in deze poort worden verder geanalyseerd in histogram II. Hier heel kleine evenementen, waarschijnlijk kernen of puin, zijn uitgesloten. De gated cellen worden getoond in histogram III, waar DAPI-positieve cellen, die waarschijnlijk membraan-permeabel apoptotische cellen, zijn uitgesloten van verdere analyse. Histogram IV toont de resulterende populatie van levensvatbare milt cellen. De PROe poort bevat CD71 ^hoge Ter119 ^{intermediaire} cellen. Ter119 ^hoge cellen worden verder geanalyseerd in het histogram V. Hier CD71 ^hoge cellen worden onderverdeeld in minder volwassen, grote 'EryA' erytroblasten (CD71 ^hoge Ter119 ^hoge FSC ^hoog) en kleinere, meer volwassen 'EryB' erytroblasten (CD71 ^hoge Ter119 ^hoog FSC ^laag) . De meest volwassen erythroblast deelverzameling is EryC (CD71 ^lage Ter119 ^hoog FSC ^laag). Histogram VI toont het celoppervlak Fas expressie, met name in de EryA subset, in muizen in de basale toestand (geïnjecteerd met zoutoplossing), en muizen geïnjecteerd met een enkele dosis van Epo. Kleuring met Fas antilichaam werd gelijktijdig uitgevoerd met de CD71/Ter119 vlekken. B. Cytospin voorbereidingen van cellen gesorteerd van elk van de aangegeven subsets. Cellen werden gekleurd met Giemsa en met diaminobenzidine, de laatste genereert een bruine vlek met hemoglobine. Cytospin gegevens werd oorspronkelijk gepubliceerd in Liu et al.., Blood. 01 juli 2006, 108 (1) :123-33. Epub 2006 09 maart.

Figuur 2. Celcyclus analyse van CD71 ^hoge Ter119 ^hoog erytroblasten in de muis beenmerg. Muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met BrdU en milt of beenmerg waren 30 tot 60 minuten later geoogst. Cellen werden vast en gepermeabiliseerd en in aanvulling op gekleurd CD71 en Ter119, werden gekleurd voor BrdU incorporatie in hun DNA repliceren met een monoklonaal antilichaam gericht tegen BrdU (fixatie, permeabilisatie en BrdU-kleuring protocol werd volgens de fabrikant instructie). BrdU-positieve cellen in de S-fase van de cyclus. Interfase cellen zijn BrdU-negatief en kan worden opgelost in de G1 of G2 / M fase, met behulp van de DNA-kleurstof 7AAD.

Figuur 3 CD71/Ter119 erytroïde subsets in de muis foetale lever A. Poortsignalen strategie:.. Foetale lever cellen werden gelabeld voor CD71, Ter119, en een cocktail van FITC-gelabelde antilichamen gericht op niet-erytroïde afkomst markers ('Lin'). Levensvatbare cellen (7AAD-negatieve) werden geanalyseerd op Lin meningsuiting en de Lin-cellen worden verder onderverdeeld in de S0 tot S5 erythroid subsets. Jonger, is E13 foetale lever bestaat uit minder volwassen erytroblasten, blijkt uit de afwezigheid van cellen in het volwassen S4/S5 subsets. B. Cytospin voorbereidingen van cellen gesorteerd van elk van de aangegeven subsets. Cellen werden gekleurd met Giemsa en met diaminobenzidine, de laatste genereert een bruine vlek met hemoglobine. Cytospin gegevens was oorspronkelijk published in Pop et al., PLoS Biol 8 (9):. e1000484. doi: 10.1371/journal.pbio.1000484.

Figuur 4. Celcyclus analyse van de foetale lever erytroïde subsets. Zwangere muizen werden geïnjecteerd met BrdU, en foetale levers werden 30 tot 60 minuten later geoogst, vaste, gepermeabiliseerde, en gekleurd met antilichamen tegen CD71, Ter119 en BrdU. Celcyclus status van de S3-cellen wordt getoond.

Discussion

De flow-cytometrische methodiek maakt gelijktijdig onderzoek van alle cellulaire functie die kunnen worden gedetecteerd met een fluorescentie-geconjugeerd specifiek antilichaam of ligand, waaronder celoppervlaktemerkers, eiwitexpressie, overleving van de cel signaleren met behulp van fosfo-specifieke antilichamen ³ en celcyclus status. Deze metingen kunnen worden gedaan in elk van een aantal van de differentiatie-fase specifieke subgroepen, in het kader van vers geïsoleerde erytropoëtische weefsel. Deze metho...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer
Fas-biotine	BD Pharmingen	554256
Streptavidine-APC	Molecular Probes	S868
40 micrometer steriele cel zeef	Fisherbrand	22363547
Polystyreen ronde bodem buizen voor FACS kleuring	BD Falcon	352008
U-bodem 96 wells plaat	BD Falcon	353910
ChromePure Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	015-000-003
CD71-FITC (voorraad 0.5mg/ml)	BD-Biosciences	553266
Ter119-PE (voorraad 0.2mg/ml)	BD-Biosciences	553673
7AAD	BD-Biosciences	559925
DAPI poeder	Roche	236276
FITC Rat anti-muis-CD41 MWReg30	BD Pharmingen	553848
FITC Rat Anti-Mouse CD45R/B220 RA3-6B2	BD Pharmingen	553087
FITC Rat Anti-Mouse CD411b/Mac-1 M1/70	BD Pharmingen	557396
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G en Ly-6C (Gr-1) RB6-8C5	BD Pharmingen	553126
FITC Hamster Anti-Mouse CD3e 145-2C11	BD Pharmingen	553061
APC BrdU Flow kit	BD Pharmingen	557892
Annexine V-biotine	BD Pharmingen	556418