Kwantificering van eiwitten met behulp van immuno-peptide Verrijking gekoppeld aan massaspectrometrie

Summary

Stabiele Isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antilichamen (SISCAPA) paren affiniteit verrijking van peptiden met stabiele isotoop verdunning massaspectrometrie (MRM-MS) voor kwantitatieve meting van peptiden te bieden als surrogaat voor hun respectievelijke eiwitten. Hier beschrijven we het protocol met behulp van magnetische deeltjes in een deels geautomatiseerde formaat.

Abstract

Er is een grote behoefte aan kwantitatieve bepalingen in het meten van eiwitten. Traditionele sandwich immunoassays, grotendeels beschouwd als de gouden standaard in kwantificatie, zijn geassocieerd met een hoge kosten, lange doorlooptijd, en zijn vol nadelen (bijv. heterofiele antilichamen, autoantilichaam interferentie, 'hook-effect'). ¹ Een alternatieve techniek is affiniteit verrijking van peptiden gekoppeld aan kwantitatieve massaspectrometrie, meestal aangeduid als SISCAPA (stabiele isotopen Normen en Capture door Anti-peptide antistoffen). ² In deze techniek, affiniteit verrijking van peptiden met een stabiele isotoop verdunning en detectie door de geselecteerde / meerdere monitoren reactie massaspectrometrie ( SRM / MRM-MS) biedt kwantitatieve meting van peptiden als surrogaten voor hun respectievelijke eiwitten. SRM / MRM-MS is goed ingeburgerd voor een accurate kwantificering van kleine moleculen ^{3, 4} en meer recentelijk is aangepast aan de concentraties van eiwitten te meten in plasma en cellysaten. ^5-7 Om kwantificatie van eiwitten te bereiken, zijn deze grotere moleculen verteerd tot component peptiden met behulp van een enzym, zoals trypsine. Een of meer geselecteerde peptiden waarvan de sequentie uniek is voor het doelwit eiwit in dat soort (dwz "proteotypic" peptiden) worden vervolgens verrijkt door het monster met behulp van anti-peptide antilichamen en gemeten als kwantitatieve stoichiometrische surrogaten voor eiwit-concentratie in het monster. Vandaar dat, gekoppeld aan stabiele isotoop verdunning (SID) methoden (dat wil zeggen een spiked-in stabiele isotoop gelabeld peptide-standaard), SRM / MRM kan worden gebruikt om concentraties van proteotypic peptiden te meten als surrogaat voor de kwantificering van de eiwitten in complexe biologische matrices. De assays hebben verschillende voordelen ten opzichte van traditionele immunoassays. De reagentia zijn relatief minder duur om te genereren, de specificiteit voor de analyt is uitstekend, de testen kunnen sterk worden gemultiplext, kan verrijking worden uitgevoerd vanaf nette plasma (geen uitputting vereist), en de techniek vatbaar is voor een breed scala aan eiwitten of wijzigingen van belang zijn. ^8-13 In deze video zien we de basis-protocol, zoals aangepast aan een magnetisch bolletje platform.

Protocol

Experimentele Procedure:

De test vereist synthetische peptiden en anti-peptide antilichamen. Geselecteerde peptiden moet uniek zijn om het eiwit van belang, bevat tussen de 8 en 22 aminozuren, en hebben voor zover bekend geen post-translationele modificaties. Methionine residu's zijn over het algemeen vermeden en peptiden die dibasische aminozuren (bijv. KK, KR, RR) zijn ongewenst. Voor deze techniek, is het gebruikelijk om een stabiele isotoop gemerkte peptiden te gebruiken als interne normen, waarin zware ⁽¹³ C en ¹⁵ N) gelabelde aminozuren aan het C-uiteinde van het peptide (dwz K of R label).

Het volgende protocol beschrijft een test ontwikkeld om de peptide GDSLAYGLR van de muis eiwit osteopontine te meten, met behulp van anti-peptide antilichamen verkregen uit Epitomics Inc (Burlingame, CA) en synthetische peptiden uit New England Peptide (Gardner, MA). Het protocol bestaat uit drie stappen (figuur 1): 1) Trypsine vertering van het complex eiwitmengsel, 2) Verrijking van peptiden 3) Analyse met behulp van massaspectrometrie. Het zal worden gedemonstreerd op een menselijk plasma monster verrijkt met de muis osteopontine eiwit.

1. Trypsine enzymatische spijsvertering en opruimen

1. Dooi 10 pi netjes plasma-fractie op nat ijs.
2. Bepaal de totale hoeveelheid eiwit concentratie door BCA assay en centrifugeer het monster op een zwevende deeltjes te verwijderen.
3. Pipet 10 pi aliquot van de opslag ervan buis naar een 1000 il deepwell plaat en dek af met Pierce-baar film.
4. Voeg 20 ul van verse 9M ureum / 30mm dithiothreitol (DTT) (uiteindelijke concentratie 6M ureum / 20mm DTT) aan elk monster.
5. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
6. Voeg 3 ul van verse 500 mM joodacetamide (laatste IAM 50mm) aan elk monster.
7. Incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
8. Voeg 257 ul van 100 mM Tris (pH 8) (verdunt ureum tot ~ 0,6 m).
9. Voeg 10 ul van trypsine stockoplossing (1 ug / ul, voor 01:50 enzym: substraat ratio).
10. Incubeer 37 ° C gedurende de nacht (12-16 uur).
11. Voeg 3 ul van nette mierenzuur (uiteindelijke concentratie van 1%).
12. Voeg stabiele isotoop standaard (meerdere normen worden toegevoegd als het uitvoeren van een multiplex assay, meestal is dit ongeveer 10 pi met 50-100 fmol van standaard isotopisch-gelabeld peptide).
13. Goed Was de Oasis cartridge plaat met 500 pl van 0,1% mierenzuur in 80% acetonitril, waarbij de flow-through. Herhaal dit 3 keer.
14. Equilibreren de cartridge plaat door het toevoegen van 500 pi van 0,1% mierenzuur in water, en gooi de doorstroming. Herhaal dit 4 keer.
15. Load verteren monsters aan de cartridge plaat en stel het vacuüm, zodat de stroom is erg traag.
16. Wassen met 500 pl van 0,1% mierenzuur in water, en gooi flow-through. Herhaal dit 3 keer.
17. Elueer peptiden door toevoeging van 2 x 500 pi van 0,1% mierenzuur in acetonitril 80% in 1000 ui deep-well plaat (niet ontdoen van de doorstroming).
18. Lyophilize (of speedvac) het eluaat. (Lyofilisatie is de beste methode)
19. Reconstitueer gedroogd peptiden door toevoeging van 50 ul PBS + 0.03% CHAPS.

2. Peptide immunoaffiniteit verrijking

1. Breng het monster tot standaard Kingfisher platen met 96 putjes.
2. Voeg 1 ug antilichaam en 1,5 pi Proteïne-G gecoate magnetische korrels per doel (het is optioneel om het antilichaam verknopen aan de kralen voorafgaand aan de toevoeging). Zorg ervoor dat kralen zijn goed geschorst door schudden of vortexen.
3. Bedek de plaat met folie.
4. Incubeer overnacht (12-16 uur) met zachte tuimelen om ervoor te zorgen kralen zijn opgeschort.
5. Centrifugeer plaat op 32 xg gedurende 5 seconden om een ​​vloeistof te verwijderen van de folie oppervlak.
6. Verwijder de folie te dekken.
7. Wassen en elutie van de kralen kunnen handmatig of op een geautomatiseerde manier worden uitgevoerd. Deze procedure beschrijft de stappen geautomatiseerd op een Kingfisher platform.
8. Was de bolletjes twee keer met 200 pi PBS + 0.03% CHAPS (1 minuut per wasbeurt).
9. Was de kralen een keer met 200 pi 1:10 verdunning van PBS + 0.03% CHAPS (1 minuut).
10. De peptiden worden geëlueerd in 25 uL van 5% azijnzuur + 0,03% CHAPS.
11. Plaats de elutie plaat op een magneet en breng het eluaat op een 96 wells-plaat, zorg ervoor dat u het overgebleven parels te dragen.
12. Bedek de plaat met een afdichting mat.
13. De plaat bevat het eluaat wordt geleverd aan de drievoudige quadrapole massaspectrometer voor analyse.

3. Analyse door meerdere reactie monitoring - massaspectrometrie

1. Overgangen voor SRM / MRM-analyse kan worden geselecteerd en geoptimaliseerd door het inbrengen van een 1 picomole per microliter oplossing van peptide norm in 30% acetonitrile/0.1% mierenzuur in de massaspectrometer van 0,5 pl / min. Zodra een stabiele spray is verkregen, het verzamelen van een MS / MS spectrum.
2. Overgangen zijn geselecteerd uit de MS / MS spectrum door het identificeren van three overvloedig fragment-ionen in een gebied van het spectrum met weinig ruis. Voor meervoudig geladen ionen peptide, de y-ion-fragmenten gedetecteerd bij m / z> voorloper van m / z zijn meestal het beste voor SRM / MRM assay ontwikkeling. Figuur 2 toont de MS / MS spectrum en de geselecteerde overgang ionen 476,3> 508,3, 579,3 , 692.4 (overgangen voor de zware stabiele isotoop standaard 481,3> 518,3, 589,3, 702,4 niet getoond) voor het peptide GDSLAYGLR.
3. Afhankelijk van het merk en model van de gebruikte massaspectrometer, zijn er meerdere parameters die kunnen worden geoptimaliseerd voor elke overgang. Hier hebben we optimaal de botsing energie van elke geselecteerde overgang gereageerd door de botsing van energie en bewaking van het niveau van het signaal. Een botsing energie van 25 werd gebruikt voor elke overgang.
4. Kortom, een typische configuratie voor SRM / MRM-analyse is als volgt: Mobiele fase (A) 0,1% mierenzuur; (B) 90% acetonitril / 0,1% mierenzuur, 0,3 x 5 mm C18 val kolom, 75 um ID x 15 cm C18 analytische kolom (Reprosil-Pur C18 AQ, 120 A ° porie). Het injectievolume is 10 pi en het monster is geladen voor 5 min bij 3% B bij een totaal debiet 3 pL / min en geëlueerd door een lineaire gradiënt 3-45% B op 300 tot 400 nL / min in 10 minuten. Voorwaarden op een 4000 QTrap (ABSCIEX, Foster City, CA) werden spuiten spanning 2.3kV, ionenbron temperatuur van 150 ° C, GS1 van 12, en gordijn gas 15.
5. Het monster wordt geanalyseerd door SRM / MRM door het injecteren van 10 pi van het monster. Peak gebieden worden geïntegreerd voor lichte en zware peptiden gebruik van het programma Skyline. ¹⁴ Bereken de piekoppervlakte ratio (PAR) van niet-gemerkt / gelabeld peptide in elk monster met behulp van de meest voorkomende overgang die vrij is van ruis, in dit geval, de y5 overgang (licht peptide 476,3> 579,3, zware standaard peptide 481,3> 589,3).

4. Representatieve resultaten:

Gemeten piekoppervlakken (licht endogeen peptide in vergelijking met spiked zware isotopisch-gelabeld peptide) bieden een kwantitatieve maat van de doelgroep peptide. Figuur 3 toont een voorbeeld chromatogram van lichte en zware peptiden in een SISCAPA verrijkte monster. Merk op dat lichte en zware peptiden elueren op hetzelfde moment en meerdere overgangen kunnen worden gecontroleerd voor elk peptide om de identiteit te bevestigen.

Figuur 1. Een schematisch overzicht van het SISCAPA proces. Een complex eiwitmengsel wordt verteerd in peptiden. Gerichte peptide analyten (endogeen analyt en een spiked stabiele isotoop-gelabelde interne standaard) wordt verrijkt met behulp van anti-peptide-antilichamen geïmmobiliseerd op Proteïne G-gecoate magnetische deeltjes. Na afsluiting, zijn de beoogde peptiden geëlueerd uit de magnetische deeltjes en geanalyseerd door middel van massaspectrometrie voor de kwantificering ten opzichte van de interne standaard.

Figuur 2. MS / MS spectrum van het peptide GDSLAYGLR met keuze uit drie fragmenten voor SRM / MRM overgangen.

Figuur 3. Voorbeeld chromatogrammen met de piek profiel van een lichte peptide analyt (rood) en de zware stabiele isotoop-gelabelde interne standaard (blauw). Chromatogrammen voor de y5 overgang van het licht peptide (476,3> 579,3) en zware gelabeld stabiele isotoop-norm (481,3> 589,3) wordt uitgezet in de tijd als ze elueren uit de chromatografie-systeem.

Discussion

De meest kritische stap in het protocol, zoals beschreven is het waarborgen van de kralen blijven goed gemengd tijdens de incubatieperiode. Het toestaan ​​van de kralen om zich te vestigen op de bodem van de put / flacon zal resulteren in een verhoogde variabiliteit. Het is ook belangrijk om spin-down vloeistof die kan blijven op de top van de goed / flacon na de incubatietijd. Reproduceerbare trypsine spijsvertering is ook kritisch. De procedure voor de spijsvertering hier beschreven is uitgebreid gebruikt in ons laboratorium in combinatie met SISCAPA, maar is het waarschijnlijk alternatieve methoden van de spijsvertering kunnen worden geoptimaliseerd voor een bepaalde set van target eiwitten ¹⁵ Elutie van vrije antilichaam niet interfereren met de detectie van de. peptide, waarschijnlijk omdat het antilichaam is uitgesloten van de kolom of elueert later dan de peptiden, maar het antilichaam kan worden verknoopt aan de Proteïne G kralen voorafgaand aan de affiniteit verrijking in grote experimenten of als vrij antilichaam wordt een probleem. We hebben ook vonden het nuttig om een ​​magneet onder het monster plaat op de autosampler evenals het wassen van de val kolom in de omgekeerde richting van de stroom (in vergelijking met het laden van) plaats om eventuele resten van kralen of deeltjes te verwijderen. In aanvulling op de magnetische kraal beschreven aanpak, kan de techniek ook worden aangepast aan een kolom formaat (dat wil zeggen affiniteitschromatografie). ^{12, 16}

Zodra de gebruiker is comfortabel met de algemene protocol, de techniek is ook vatbaar voor een aantal wijzigingen die de algemene test te verbeteren. ¹¹ Ten eerste is het mogelijk om meerdere analyten te analyseren in een enkele assay door het combineren van antilichamen in de verrijking stap (dwz multiplexing). De massaspectrometer is in staat om gelijktijdig te analyseren een groot aantal analyten. Ten tweede, het verhogen van het volume van de oorspronkelijke monster verbetert de gevoeligheid van de test.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het materiaal	Vennootschap	Catalogus nummer
1000ul Deep goed 96-well platen	Eppendorf	951032786
Oasis HLB 1 cc cartridge plaat, Sep-pak, 40 mg 96 wells plaat	Waters	186003966
Kingfisher 96 wells plaat	Thermo Fisher Scientific	97002540
Duidelijke 96 goed, witte muur plaat	Bio-Rad	HSP9601
Folie voor 96 wells-plaat	Excelscientific	12-169
Axymat Sealing mat voor 96 wells plaat	Axygen	521-01-151
X Pierce film	Sigma-Aldrich	Z722502
Kingfisher magnetische bead-processor met PCR magneet hoofd	Thermo Fisher Scientific	HSP 9601

Naam van het materiaal	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Ureum	Sigma Aldrich	U6031
Trizma basis	Sigma Aldrich	T1503
Dithiothreitol (DTT)	Doorboren	20291	"No-wegen dithiothreitol"
Joodacetamide (IAM)	Sigma Aldrich	I1149
Trypsine Gold	Promega	V5280
Eiwit G magnetische kralen, 2.8um	Invitrogen	10004D
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	Thermo Fisher Scientific	L5401
CHAPS	Thermo Fisher Scientific	28300
Mierenzuur	EMD	11670
Acetonitril	Thermo Fisher Scientific	A998-1
Azijnzuur	Sigma Aldrich	242853

Oplossing	Commentaar (optioneel)
100 mM Tris pH 8
9 M ureum / 30 mM DTT in 100 mM Tris (pH 8)	moet vers worden bereid elke keer
500 mM IAM in 100 mM Tris (pH 8)	moet vers worden bereid elke keer
Trypsine 1mg/ml in 100 mM Tris pH 8
Trypsine-remmer 1mg/ml in 100 mM Tris pH 8
Stabiele isotoop standaard mastermix
Anti-peptide antilichaam mastermix