Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

12.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2813

⸱

16 juli 2011

 ,  , 
1The Sprott Center for Stem Cell Research, Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa

In dit artikel

Samenvatting

Een Ex vivo Protocol om te rijpen menselijke rode bloedcellen uit hematopoietische stamcellen / voorlopers genereren is beschreven. Daarnaast beschrijven we een efficiënte lentivirale-delivery methode om knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire erythroid cellen. De efficiëntie van lentivirus gemedieerde gen delivery is aangetoond met behulp van GFP uiten van virussen.

Samenvatting

Erytropoëse is een veel gebruikte modelsysteem om celdifferentiatie te bestuderen. Tijdens de erytropoëse, pluripotente volwassen humane hematopoietische stamcellen (HSC) differentiëren in oligopotent voorvaderen, betrokken precursoren en rijpe rode bloedcellen 1. Dit proces wordt geregeld voor een groot deel op het niveau van genexpressie, waarbij specifieke transcriptiefactoren te activeren lijn-specifieke genen, terwijl gelijktijdig het onderdrukken van genen die specifiek zijn voor andere soorten cellen 2. Studies over transcriptiefactoren reguleren erytropoëse worden vaak uitgevoerd met behulp van mensen en muizen cellijnen die, vertegenwoordigen tot op zekere hoogte, erythroïde cellen bij gegeven stadia van differentiatie 3-5. Maar getransformeerde cellijnen kan slechts gedeeltelijk nabootsen erythroïde cellen en het belangrijkste is dat het niet mogelijk om een ​​begrijpelijk studie van de dynamische veranderingen die de vooruitgang als cellen ontstaan ​​door vele podia naar hun uiteindelijke erythroid lot. Daarom is een actuele uitdaging blijft de ontwikkeling van een protocol bij relatief homogene bevolking van de primaire HSC en erythroïde cellen te verkrijgen in verschillende stadia van differentiatie in hoeveelheden die voldoende zijn om genomics en proteomics experimenten uit te voeren.

Hier beschrijven we een ex vivo celkweek-protocol om erythroïde differentiatie te induceren van humane hematopoietische stam / voorlopercellen die zijn geïsoleerd van beide navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed of volwassen gemobiliseerd met G-CSF (leukaferese). Deze cultuur-systeem, in eerste instantie ontwikkeld door de Douay laboratorium 6, maakt gebruik van cytokines en co-cultuur op mesenchymale cellen na te bootsen het beenmerg micro-omgeving. Met behulp van deze ex vivo differentiatie protocol, zien we een sterke versterking van erytroïde voorouders, een inductie van differentiatie enkel ten aanzien van de erytroïde lijn en een volledige rijping van het stadium van enucleated rode bloedcellen. Zo, dit systeem biedt de mogelijkheid om het moleculaire mechanisme van transcriptionele regulatie als hematopoietische stamcellen vooruitgang langs de erytroïde lijn te bestuderen.

Studeren erytropoëse op het transcriptionele niveau vereist ook de mogelijkheid om over-express of knockdown specifieke factoren in primaire erythroid cellen. Hiervoor maken we gebruik van een lentivirus-gemedieerde gen-levering systeem dat zorgt voor de efficiënte infectie van zowel delende als niet-delende cellen 7. Hier laten we zien dat we in staat zijn om efficiënt te knockdown de transcriptiefactor TAL1 in primaire menselijke erythroid cellen. Daarnaast, GFP expressie toont een rendement van lentivirale infectie bijna 90%. Zo, onze-protocol zorgt voor een zeer nuttig systeem voor de karakterisering van de regulerende netwerk van transcriptiefactoren die controle erythropoiese.

Protocol

Deel I. ex vivo erythropoëse van menselijke hematopoëtische stam-/progenitorcellen

1. Isolatie van CD34+ humane hematopoëtische stam-/progenitorcellen

De menselijke CD34+ celpopulatie, die een mengsel bevat van hematopoëtische stamcellen (HSC's) en vroege progenitoren 8, wordt gewonnen uit navelstrengbloed, perifeer bloed gemobiliseerd met G-CSF (leukaferese) of beenmerg (Figuur 1-Stap 1). Ga direct naar stap 1.2 bij gebruik van navelstrengbloed of perifeer bloed. Begin bij stap 1.1 bij gebruik van beenmerg. Raadpleeg Tabel 1 voor reagentia en apparatuur.

Deze stap wordt uitgevoerd onder steriele omstandigheden (bijv. in een zuurkast) en bij RT, tenzij anders aangegeven.

  1. Bereid een enkelcellesuspensie van beenmerg voor:
    1. Resuspendeer het merg in 10 vol. RPMI 1640 mengandung 0,02% collagenase B en 100 U/ml DNase 1
    2. Meng voorzichtig op een schudplaat voor 45 min.
    3. Filter de cellen door een nylon gaas van 30μm.
  2. Isoleer mononuclear cells (MNCs) met lage dichtheid via Ficoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie:
    1. Verdun de bloed- of mergsuspensie met 2-4 vol. PBS mengandung 2% foetaal runder serum (FBS) en 2mM EDTA. N.B. Hogere volumes verhogen de zuiverheid van de MNCs.
    2. Breng in een conische buis van 50 ml voorzichtig 35 ml van de verdunde cellsuspensie aan over 15 ml Ficoll-paque. Centrifugeer bij 400g gedurende 30 min. in een swing-out rotor zonder rem.
    3. Aspireer de bovenste laag, waarbij de tussenliggende MNC-laag ongemoeid blijft.
    4. Overbreng de interfase-laag (bevattende MNCs) naar een nieuwe conische buis van 50 ml.
    5. Voeg PBS mengandung 2% FBS en 2 mM EDTA toe om deze buis te vullen, meng voorzichtig door de buis om te keren en centrifugeer bij 300g gedurende 10 min. bij RT. Verwijder het supernatant.
    6. Was het cellpellet nog 2 keer extra om bloedplaatjes te verwijderen. N.B. Deze stap verhoogt de zuiverheid van CD34+ cellen.
    7. Neem 20 μl van de cellsuspensie en breng dit over in een eppendorfbuisje. Voeg 200 μl Red Blood Cells Lysis Buffer toe (Tabel 1) en incubeer bij RT gedurende 2 min. Breng 18 μl van deze suspensie aan onder een hemocytometer en tel de genucleerde MNCs.
    8. MNCs kunnen direct worden gebruikt of worden ingevroren bij 108 cell/ml in celkweekmedium mengandung 10% DMSO en bewaard in vloeibare stikstof.
  3. Isoleer CD34+ cellen via positieve immunomagnetische selectie (Figuur 1-Stap 1)
    Wij gebruiken de CD34 Microbead Kit (bevattende een oplossing van Microbeads geconjugeerd aan monoclonale muizen-antilichamen tegen humaan CD34 en een oplossing van FcR Blocking Reagent mengandung humaan IgG) in combinatie met twee LS Mini-Macs kolommen, de autoMACS Running Buffer en een MiniMACS Separator (Tabel 1). Hieronder beschrijven we ons protocol uitgaande van 2,3x108 MNCs. Indien er andere aantallen cellen worden gebruikt, moeten de volumes dienovereenkomstig worden op- of afgeschaald. Bovendien kan voor maximaal 2x108 MNCs een MS MiniMacs kolom worden gebruikt in plaats van de LS MiniMacs kolom.
    Houd cellen en reagentia koud (4-8°C) om capping van antilichamen op het celoppervlak en aspecifieke celmarkering te voorkomen.
    1. Resuspendeer het pellet mengandung 2,3x108 MNCs in 690 μl Running Buffer (300 μl per 108 MNCs, waarbij 300 μl het minimale vereiste suspensievolume is) en breng dit over in een conische buis van 15 ml.
    2. Voeg 230 μl FcR Blocking Reagent toe.
    3. Voeg 230 μl CD34 MicroBeads oplossing toe.
    4. Meng goed met de hand en incubeer gedurende 30 min. bij 4°C.
    5. Was de cellen door 10 ml Running Buffer toe te voegen en centrifugeer bij 300g gedurende 10 min.
    6. Aspireer het supernatant volledig.
    7. Resuspendeer de cellen in 1,2 ml Running Buffer (gebruik 0,5 ml buffer per 108 MNCs). N.B. Het is belangrijk om een enkelcellesuspensie te verkrijgen vóór de magnetische scheiding. Indien nodig, breng de cellen door een nylon gaas van 30μm om celklonten te verwijderen.
    8. Bereid de LS-kolom voor door deze in het magnetische veld van een MiniMACS Separator te plaatsen.
    9. Spoel de kolom met 3 ml Running Buffer.
    10. Breng 1,2 ml van de cellsuspensie aan op de kolom.
    11. Verzamel de flow-through en gebruik deze om de opbrengst en zuiverheid van de CD34+ celisolatie te verifiëren. Vries alternatief de cellen in deze fractie in en bewaar ze in vloeibare stikstof. N.B. Deze fractie bevat ongemarkeerde cellen en kan ook enkele gemarkeerde CD34+ cellen bevatten die niet aan de kolom zijn gehecht.
    12. Was de kolom drie keer met 3 ml Running Buffer, combineer de wasstappen en gebruik deze fractie op dezelfde wijze als de bovenstaande flow-through fractie.
    13. Verwijder de kolom uit de magneet en plaats deze op een polypropyleen opvangbuis van 15 ml.
    14. Om de cellen te elueren, voegt u 5 ml Running Buffer toe aan de kolom en spoelt u de gemarkeerde CD34+ cellen onmiddellijk uit door de zuiger stevig in de kolom te duwen.
    15. Herhaal de kolomzuiveringsprocedure (stappen h tot n) door de cellen over een vers bereide LS-kolom te leiden. N.B. Dit verhoogt de zuiverheid van CD34+ cellen. Vanuit een suspensie van 2,3x108 MNCs geïsoleerd uit leukaferesis, verkrijgen we doorgaans 1,1x106 CD34+ cellen met een zuiverheid > 95±3% (Figuur 1-Stap 1).
    16. Vries de cellen in kweekmedium mengandung 10% DMSO in en bewaar in vloeibare stikstof of ga direct over naar stap 2).

2. Erythroïde differentiatie in celcultuur

CD34+ cellen worden gekweekt in aangevuld IMDM-medium met opeenvolgende toevoeging van hydrocortison en specifieke combinaties van cytokinen volgens een vierstaps-protocol aangepast naar 6 (Figuur 1-Stap 2). Gedurende de procedure wordt een reeks tests uitgevoerd om de celgroei en erythroïde differentiatie te verifiëren.

Het aantal CD34+ cellen dat nodig is om een cultuur te starten is variabel, afhankelijk van de schaal van het experiment. Doorgaans voeren we voor genexpressiestudies een kleinschalige cultuur uit, beginnend met 0,1x106 CD34+ cellen in 10 ml medium, waarbij kleine volumes worden gehandhaafd door gedurende de procedure extra cellen in te vriezen. Voor studies waarbij proteïne-extractie vereist is, worden culturen op grotere schaal uitgevoerd. Hier beschrijven we een grootschalig experiment waarbij we starten met ~7x106 CD34+ cellen geïsoleerd uit leukaferese.
Gedurende het gehele proces worden steriele omstandigheden gehanteerd. Zie Tabellen 1, 2 en 3 voor de reagentia.

  1. Reagentia voorbereiden
    1. Bereid het aangevulde IMDM-medium voor zoals beschreven in Tabel 2 en vries aliquots van 40 ml in bij -20°C (dit kan vooraf worden gedaan).
    2. Bereid stockoplossingen van hydrocortison en cytokinen voor zoals beschreven in Tabel 3.
  2. Stap 1: Dag 0-11
    Hematopoëtische cellen worden gekweekt in aangevuld IMDM-medium bevattend hydrocortison (HC), stem cell factor (SCF), interleukine 3 (IL-3) en erytropoëtine (EPO) (Tabel 3). MS-5 murine beenmergstromale cellen (Tabel 1) worden vermeerderd ter voorbereiding op stap 2.
    • Dag 0:
      1. Warm 120 ml aangevuld IMDM-medium voor en voeg HC, SCF, IL-3 en EPO toe (Tabel 3).
      2. Ontdooi 7x106 CD34+ cellen door de vial(s) eerst in een waterbad van 37°C te plaatsen. Voeg 1 ml voorverwarmd medium toe terwijl de cellen nog bevroren zijn en breng de cellen over naar een conische buis van 15 ml. Was de vial met 2 ml medium en breng dit over naar de buis van 15 ml.
      3. Voeg 6 ml medium toe aan de celsuspensie, meng door de buis om te keren en centrifuger bij 200 g gedurende 5 min.
      4. Aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml vers medium.
      5. Tel de levende cellen met een hemocytometer nadat 10 μl celsuspensie is gemengd met 10 μl Trypan Blue-oplossing (Tabel 1). NB: De celsterfte bedraagt ongeveer 25% tijdens het ontdooien, waardoor de concentratie levende cellen ~0,5x106 cel/ml moet zijn.
      6. Bewaar ongeveer 3 ml celsuspensie voor tests (zie paragraaf 6).
      7. Breng de resterende 7 ml over naar een T-175 fles en voeg 63 ml medium toe om 0,05x106 cel/ml in 70 ml te verkrijgen, en plaats de fles in een incubator bij 37°C.
    • Dag 1:
      1. Warm 85 ml MS-5 celkweekmedium voor: αMEM met Glutamax (Tabel 1), 10% FBS en 100 U/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine.
      2. Bereid drie ronde kweekschalen van 150mm x 25mm voor, elk gezaaid met 2x106 MS-5 cellen in 25 ml medium om 0,08x106 cel/ml te verkrijgen, en plaats deze in een incubator van 37°C. NB: De beste resultaten worden behaald met MS-5 cellen met een laag passagegetal (<20). Confluente culturen moeten worden uitgebreid door elke derde dag 1:5 te splitsen met trypsine bevattend 0,05% EDTA.
    • Dag 2:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst de benodigde cellen (d.w.z. ~20 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: Naar onze ervaring kan de celsterfte tijdens de eerste 2 dagen 30-50% overschrijden, waardoor de uiteindelijke concentratie van de cellen meestal dicht bij die van dag 0 ligt (Figuur 2).
      2. Vervang het MS-5 kweekmedium door 25 ml vers medium, waarbij wordt gegarandeerd dat niet-gehechte MS-5 cellen worden verwijderd.
    • Dag 4:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst de benodigde cellen (d.w.z. ~10 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: Op dit punt moeten de cellen zijn begonnen te prolifereren, met >75% levende cellen bij een concentratie van ~0,2x106 cel/ml. Cellen kunnen worden ingevroren bij 1-2x106 cel/ml in aangevuld IMDM-medium bevattend 10% DMSO en bewaard worden in vloeibare stikstof.
      2. Breng de resterende ~40 ml cultuur over naar een T-175 fles en voeg voldoende aangevuld IMDM-medium bevattend HC, SCF, IL-3 en EPO toe (Tabel 3) om een eindvolume van 150 ml te bereiken. NB: De celconcentratie moet ~0,05x106 cel/ml zijn.
      3. Breid de MS-5 cellen uit (die 60-70% confluent moeten zijn) door ze 1:5 te verdunnen in nieuwe ronde kweekschalen van 150mm x 25 mm met trypsine 0,05% EDTA. De uiteindelijke celconcentratie moet ~0,08x106 cel/ml zijn. NB: Meestal kan één schaal 5 keer worden uitgebreid, zodat u 15 schalen met MS-5 cellen bij ~0,08x106 cel/ml zou moeten hebben.
    • Dag 6:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: Cellen bevinden zich in een fase van hoge proliferatie en de celconcentratie moet ≤1,5x106 cel/ml worden gehouden. Als de celconcentratie hoger is, voeg dan vers aangevuld IMDM-medium toe bevattend HC, SCF, IL-3 en EPO.
    • Dag 7:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten. NB: Naar onze ervaring bereiken cellen op dag 7 meestal een dichtheid van 1,5x106 cel/ml.
      2. Voeg voldoende medium toe om een celconcentratie van ~0,8x106 cel/ml te handhaven. NB: Wij voegen gewoonlijk 100 ml vers aangevuld IMDM-medium toe bevattend HC, SCF, IL-3 en EPO om 245 ml cellen bij ~0,8x106 cel/ml te verkrijgen.
      3. Breid de MS-5 cellen uit (die 60-70% confluent moeten zijn) door ze 1:5 te verdunnen in T-175 flessen (in plaats van schalen) met trypsine 0,05% EDTA. De uiteindelijke celconcentratie moet ~0,08x106 cel/ml zijn. NB: Er moeten 61 flessen MS-5 cellen bij ~0,08x106 cel/ml worden voorbereid. Vries de resterende MS-5 cellen in en bewaar ze in vloeibare stikstof.
    • Dag 8:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~1x106 cel/ml zijn.
      2. Warm 2L aangevuld IMDM-medium voor dat alleen SCF en EPO bevat (Tabel 2 en 3).
      3. Oogst 200 ml hematopoëtische cultuur (bevattend ~200x106 cellen), centrifugeer bij 200 g gedurende 10 min., aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in 40 ml aangevuld IMDM-medium bevattend SCF en EPO.
      4. Verdeel de celsuspensie over 8 T-175 flessen (5 ml per fles) en voeg 245 ml aangevuld IMDM-medium bevattend SCF en EPO toe aan elke fles. NB: We hebben nu 8 flessen, elk bevattend 250 ml cellen bij 0,1x106 cel/ml.
      5. Resterende cellen (~40ml) op dag 8 kunnen worden ingevroren bij 1-2x106 cel/ml in aangevuld IMDM-medium bevattend 10% DMSO en bewaard worden in vloeibare stikstof.
    • Dag 10:
      1. Tel de hematopoëtische cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~1x106 cel/ml zijn.
  3. Stap 2: Dag 11-15
    Ongeveer de helft van de cellen wordt geoogst voor toekomstig gebruik (bijv. nucleaire extractie). De overige erytroïde cellen worden geco-cultiveerd op MS-5 cellen in aangevuld IMDM-medium bevattend EPO (Tabel 2 en 3). Erytroïde cellen moeten elke 3-4 dagen worden overgebracht naar een verse MS-5 laag.
    • Dag 11:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten. NB: De celdichtheid moet ~1,5x106 cel/ml zijn.
      2. Warm 1L 1xPBS, 400ml aangevuld IMDM-medium en 5L aangevuld IMDM-medium bevattend EPO (Tabel 2 en 3) voor bij 37°C.
      3. Reserveer een cultuurvolume gelijk aan 15x108 cellen (bijv. ~4 flessen van 250 ml elk) en ga verder naar e.
      4. Resterende cellen (bijv. 15x108) worden geoogst in conische buizen, gecentrifugeerd bij 450 g gedurende 10 min., geresuspendeerd in koude MS30-buffer (Tabel 5) bevattend 0,1mM DTT met een maximum van 108 cel/ml en bewaard bij -80°C na snap-freezing in vloeibare stikstof voor toekomstig gebruik (bijv. nucleair extract).
      5. Was 50 flessen confluente MS-5 cellen met telkens 20 ml 1xPBS en voeg onmiddellijk 80 ml vers aangevuld IMDM-medium bevattend EPO toe aan elke fles. NB: Vanwege het grote aantal flessen verwerken we 4 flessen tegelijk. We halen precies 4 flessen confluente MS-5 cellen uit de incubator, wassen ze met 1xPBS, voegen de 80 ml medium toe en plaatsen de flessen terug in de incubator. Wanneer alle flessen zijn voorbereid en teruggeplaatst, gaan we verder naar stap f. Vanwege het aantal flessen dat bij een grootschalige procedure moet worden verwerkt, is het voordelig om deze stappen door twee personen te laten uitvoeren die simultaan werken.
      6. Centrifugeer het equivalent van 15x108 erytroïde cellen in 4 conische buizen bij 450 g gedurende 10 min. en verwijder het supernatant.
      7. Was de 4 celpellets met telkens 100 ml aangevuld IMDM-medium.
      8. Resuspendeer elke celpellet in 250 ml aangevuld IMDM-medium bevattend EPO en verdeel 20 ml van deze celsuspensie over elk van de 50 flessen met MS-5 cellen en 80ml medium. NB: Bij deze stap moet u 50 flessen hebben met confluente MS-5 cellen bevattend 100 ml erytroïde cellen bij 0,3x106 cel/ml.
      9. Breid de resterende 11 flessen MS-5 cellen uit door ze 1:5 te verdunnen in T-175 flessen met trypsine 0,05% EDTA. De uiteindelijke celconcentratie moet ~0,08x106 cel/ml zijn. NB: Er moeten 55 flessen MS-5 cellen bij ~0,08x106 cel/ml worden voorbereid.
    • Dag 12:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~4 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~0,6x106 cel/ml zijn.
    • Dag 14:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~3 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~0,9x106 cel/ml zijn.
  4. Stap 3: Dag 15-18
    Sommige cellen worden geoogst voor toekomstig gebruik (bijv. nucleaire extractie). De overige erytroïde cellen worden geco-cultiveerd op MS-5 cellen in aangevuld IMDM-medium zonder cytokinen.
    • Dag 15:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten. NB: De celdichtheid moet ~1x106 cel/ml zijn.
      2. Warm 1L 1xPBS en 5L aangevuld IMDM-medium (Tabel 2) voor bij 37°C.
      3. Reserveer een cultuurvolume gelijk aan 10x108 cellen (bijv. ~10 flessen van 100 ml elk) en ga verder naar e.
      4. Resterende cellen (bijv. 40x108) worden geoogst en geresuspendeerd in koude MS30-buffer (Tabel 5) bevattend 0,1mM DTT voor toekomstig gebruik (zie Stap 2: Dag 11 punt d).
      5. Was 50 flessen confluente MS-5 cellen met telkens 20 ml 1xPBS en voeg onmiddellijk 80 ml vers aangevuld IMDM-medium toe aan elke fles.
      6. Centrifugeer het equivalent van 10x108 erytroïde cellen in 4 conische buizen bij 450 g gedurende 10 min. en verwijder het supernatant.
      7. Was de 4 celpellets met telkens 100 ml aangevuld IMDM-medium.
      8. Resuspendeer elke celpellet in 250 ml aangevuld IMDM-medium en verdeel 20 ml van deze celsuspensie over elk van de 50 flessen met MS-5 cellen en 80ml medium. NB: Bij deze stap moet u 50 flessen hebben met confluente MS-5 cellen bevattend 100 ml erytroïde cellen bij 0,2x106 cel/ml.
      9. Breid de resterende 5 flessen MS-5 cellen uit door ze 1:5 te verdunnen in T-175 flessen met trypsine 0,05% EDTA. De uiteindelijke celconcentratie moet ~0,08x106 cel/ml zijn. NB: Er moeten 20 flessen MS-5 cellen bij ~0,08x106 cel/ml worden voorbereid. Vries de resterende MS-5 cellen in en bewaar deze in vloeibare stikstof.
    • Dag 16:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~4 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~0,6x106 cel/ml zijn.
  5. Stap 4: Dag 18-26
    Erytroïde cellen worden 3-4 maal geconcentreerd om een finale concentratie van 5-7x106 cel/ml te verkrijgen en worden op een MS-5 laag gehouden om rijping mogelijk te maken. 10% FBS wordt toegevoegd aan het aangevulde IMDM-medium voor een betere bewaring van de gekweekte rode bloedcellen (cRBC's).
    • Dag 18:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~2 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid moet ~1,7x106 cel/ml zijn.
      2. Warm 300ml 1xPBS en 1,5L aangevuld IMDM-medium (Tabel 2) bevattend 10% FBS voor bij 37°C.
      3. Was 15 flessen confluente MS-5 cellen met telkens 20 ml 1xPBS en voeg onmiddellijk 80 ml vers aangevuld IMDM-medium toe aan elke fles.
      4. Centrifugeer erytroïde cellen (d.w.z. het equivalent van 85x108 cellen) bij 450 g gedurende 10 min., combineer en verdeel de pellet over 4 conische buizen.
      5. Resuspendeer elke celpellet in 75 ml aangevuld IMDM-medium bevattend 10% FBS en verdeel 20 ml van deze celsuspensie over elk van de 15 flessen met MS-5 cellen en 80ml medium. NB: Bij deze stap moet u 15 flessen hebben met confluente MS-5 cellen bevattend 100 ml erytroïde cellen bij 6x106 cel/ml.
      6. Breid de resterende 5 flessen MS-5 cellen uit door ze 1:5 te verdunnen in T-175 flessen met trypsine 0,05% EDTA. De uiteindelijke celconcentratie moet ~0,08x106 cel/ml zijn. NB: Er moeten 20 flessen MS-5 cellen bij ~0,08x106 cel/ml worden voorbereid. Vries de resterende MS-5 cellen in en bewaar deze in vloeibare stikstof.
    • Dag 20:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~1,5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid wordt gehandhaafd op ~1,5x106 cel/ml.
    • Dag 22:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~1,5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid wordt gehandhaafd op ~1,5x106 cel/ml.
      2. Vervang het medium en breng de erytroïde cellen over naar nieuwe lagen MS-5 cellen zoals beschreven voor dag 18.
    • Dag 24:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~1,5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid wordt gehandhaafd op ~1,5x106 cel/ml.
    • Dag 26:
      1. Tel de erytroïde cellen met Trypan blauw om dode cellen uit te sluiten, en oogst het benodigde aantal cellen (d.w.z. ~1,5 ml cultuur) voor tests (zie paragraaf 6). NB: De celdichtheid wordt gehandhaafd op ~1,5x106 cel/ml.
      2. Oogst niet-adherente, enucleerde en volledig hemoglobiniserende cRBC's. NB: Rijpe cRBC's kunnen worden bewaard in SAGM-medium (MacoPharma) bij 4°C tot een maand.
  6. Tests en representatieve resultaten
    De volgende tests worden uitgevoerd op de aangegeven dagen om de juiste celproliferatie en erytroïde differentiatie te verifiëren. De representatieve resultaten in de figuren zijn verkregen met behulp van CD34+ cellen geïsoleerd uit leukapherese.
    1. Cellen worden om de tweede dag geteld. Zie het representatieve resultaat van celproliferatie in Figuur 2.
    2. May-Grünwald Giemsa morfologische kleuring wordt om de tweede dag uitgevoerd met 0,05 x106 cellen voor dag 0 tot 8 en 0,2x106 cellen voor de overige dagen, volgens de instructies van de fabrikant van de Giemsa-kleuring (Tabel 1). Zie de representatieve resultaten in Figuur 3.
    3. Semisolide assays worden in dubbeltoets uitgevoerd om hematopoëtische progenitoren te meten om de tweede dag van dag 0 tot dag 12 met 0,01x106 cellen per assay, volgens de instructies van de fabrikant van het Methocult semisolide medium (Tabel 1). Zie de representatieve resultaten in Figuur 4.
    4. Analyse van de volgende celmarkers wordt om de tweede dag gedaan via FACS: CD34, CD36, CD71, GPA, LDS met 0,2 x106 cellen per assay. Zie de representatieve resultaten in Figuur 5.
    5. Hemoglobine wordt om de tweede dag gemeten via benzidine-kleuring. Zie de representatieve resultaten in Figuur 5.
    6. Genexpressie wordt bestudeerd via RT-qPCR of microarray na RNA-extractie uit 1x106 cellen. Zie de representatieve resultaten in Figuur 6B.

Opmerkingen over de resultaten:

Figuur 1 schetst het protocol voor ex vivo differentiatie van humane CD34+ cellen tot rijpe, hemoglobine-bevattende rode bloedcellen. Tijdens de erytroïde differentiatie zijn de cellen zeer proliferatief, zoals geïllustreerd door de ~8.000-voudige amplificatie in Figuur 2, die is verkregen met behulp van CD34+ cellen geïsoleerd uit leukaferese. CD34+ cellen geïsoleerd uit beenmerg zijn iets minder proliferatief met een ~6.000-voudige amplificatie, terwijl CD34+ cellen geïsoleerd uit navelstrengbloed een 50.000-voudige amplificatie kunnen bereiken. Cellen in specifieke differentiatiestadia vertonen herkenbare grootten en morfologieën, zoals weergegeven in Figuur 3. Let op het proces van enucleatie dat aan het einde van de differentiatie plaatsvindt, beginnend op Dag 20. Op Dag 26 hebben alle cellen hun kernen verloren (Figuur 3).

Kolonievormende assays, zoals getoond in Figuur 4, worden gebruikt om vroege en late hematopoëtische progenitoren te detecteren tijdens de eerste dagen van differentiatie (Dag 0 tot Dag 8). Naast erytroïde progenitoren (CFU-E en BFU-E) merken we op dat granulocyt-macrofaagprogenitoren (CFU-GM) significant vertegenwoordigd zijn binnen de vroege CD34+ cellen op Dag 0. Naarmate de differentiatie vordert, nemen de CFU-GM significant af, en op Dag 6 zijn ze volledig vervangen door erytroïde progenitoren BFU-E en CFU-E. Het is ook belangrijk op te merken dat van Dag 4 tot Dag 6 de vroege erytroïde progenitoren BFU-E geleidelijk worden vervangen door hun meer gedifferentieerde tegenhangers CFU-E. Tegen Dag 10 hebben erytroïde cellen hun kolonievormend vermogen in essentie verloren.

Ten slotte wordt de erythropoëse gemonitord aan de hand van de expressie van celoppervlaktemarkers, zoals weergegeven in Figuur 5. Let op: 1) het geleidelijke verlies van de hematopoëtische stamcel-/progenitormarker CD34; 2) de geleidelijke acquisitie en het verlies van de progenitormarker CD36; 3) de geleidelijke acquisitie en het verlies van de erytroïde progenitor- en reticulocytmarker CD71; en 4) de toename van de erytroïde precursor- en erytrocytmarker GPA. Andere markers voor erytroïde differentiatie omvatten hemoglobinesynthese vanaf dag 8 (gemeten via benzidinekleuring-Figuur 5) en cel-enucleatie vanaf dag 20, gemeten door het verlies van de DNA-kleuring LDS (Figuur 5). Ten slotte kan erytroïde differentiatie worden gemeten via RT-qPCR van moleculaire markers zoals de transcriptiefactor TAL1 (Figuur 6B) of de β-globinegenen (gegevens niet getoond).

Typisch levert 1 ml navelstrengbloed / leukaferese / beenmerg 0,35x105 / 0,5x105 / 1,1x105 CD34+ cellen, die theoretisch 1,7x109 / 0,4x109 / 0,7x109 rode bloedcellen kunnen produceren met respectievelijke proliferatiesnelheden van 50.000 / 8.000 / 6.000. Om aan het einde van de differentiatieprocedure 50x106 rode bloedcellen te verkrijgen, is ongeveer 50 ml kweekmedium nodig.

Deel II. Lentivirale knockdown tijdens ex vivo erytroïde differentiatie

Lentivirus is een middel bij uitstek voor genoverdracht in primaire menselijke cellen (zie bijvoorbeeld Amsellem et al. 9). Lentivirussen worden vaak gebruikt om genen van belang in primaire cellen uit te schakelen via de aflevering van gericht shRNA (zie bijvoorbeeld Laurenti et al. 10). In dit protocol richten we ons op de transcriptiefactor TAL1 in primaire menselijke erythroïde cellen. Een shRNA met een gescrambelde sequentie die niet overeenkomt met enig bekend gen wordt als negatieve controle gebruikt. GFP-expressie wordt gebruikt voor het evalueren van de transductie-efficiëntie.

1. Preparatie van lentivirale vectorpartikels

Om lentivirale deeltjes te verkrijgen, worden menselijke embryonale nier 293T-cellen gecotransfecteerd met drie plasmiden: één dat een tweede-generatie virusverpakkingssysteem bevat dat codeert voor HIV-1-genen met uitzondering van env, vpr, vif, vpu en nef (i.e. psPAX2); één dat codeert voor de envelop van het vesicular stomatitis G-pseudotyped virus (i.e. pMD2G); en één lentivirale vector die codeert voor het gen van interesse (i.e. pBLOCK-it6-DEST(shTal1) coderend voor TAL1 shRNA, pBLOCK-it6-DEST(shScr) coderend voor scrambled shRNA of pWPIP coderend voor GFP) (Tabel 4). Lentivirale deeltjes worden verzameld uit het supernatant van de celcultuur van de getransfecteerde 293T-cellen.

Om ongewenste infectie van cellen te voorkomen, voeren we alle lentivirale experimenten (bereiding van virussen en infectie) uit onder een speciale zuil die gescheiden is van andere celculturen. Daarnaast wordt afval dat is gegenereerd door lentivirussen apart afgevoerd. Tweede generatie lentivirussen die in dit protocol worden beschreven, zijn replicatie-incompetent en moeten worden behandeld als organismen van Biosafety Level 2. Sommige instellingen kunnen specifieke veiligheidsprocedures hebben met betrekking tot lentivirussen en we raden aan dat u de vastgestelde institutionele richtlijnen volgt.

Hier beschrijven we een protocol dat voldoende lentivirale deeltjes oplevert om 1 tot 2 miljoen primaire erytroïde cellen in elk stadium van differentiatie te infecteren. Volume-aanpassingen dienen te worden gemaakt bij het opschalen of afschalen. Raadpleeg Tabel 4 en 5 voor de reagentia.

  1. Transfectie van 293T-cellen met calciumfosfaat.
    1. Zaai één dag voor de transfectie 13.2 x 106 293T-cellen uit in 20 ml DMEM/High glucose-medium met 10% FBS en Pen/Strep in een 15-cm celkweekschaal. NB. Dit moet ervoor zorgen dat de cellen op de dag van de transfectie een confluentie van 70% bereiken. De beste resultaten worden behaald met 293T-cellen met een laag passagegetal (<20).
      Optioneel: schalen kunnen worden gecoat met type I collageen of Poly-L-lysine om de adhesie van 293T-cellen te verbeteren.
    2. Twee uur voor de transfectie wordt het medium van de 293T-cellen afgegezogen en worden er voorzichtig 20 ml vers medium toegevoegd, voorverwarmd op 37°C. NB: Wij starten de transfectie gewoonlijk aan het einde van de dag.
    3. Meng de volgende reagentia in een buisje van 5 ml:
      • 44.8 μg expressievector voor het gen van belang (bijv. shRNA of GFP; zie Tabel 4)
      • 13.35 μg pMD2.G envelope-vector.
      • 33.48 μg psPAX2 packaging-vector.
      • Voeg voldoende steriel H2O toe om het volume aan te vullen tot 1.116 ml.
    4. Voeg voldoende steriel H2O toe om het volume aan te vullen tot 1.116 ml.
    5. Voeg 109.8 μl CaCl2 2.5M toe en vortex om te mengen.
    6. Voeg in een conische buis van 50 ml 1.116 ml 2xHBS-buffer toe (Tabel 5).
    7. Voeg onder constante vortex-agitatie het DNA-mengsel druppelsgewijs toe aan de 2xHBS-buffer.
    8. Laat het precipitaat 20 min. vormen bij RT (niet langer dan 30 min.).
    9. Voeg de 2.3 ml oplossing druppelsgewijs toe aan de schaal met de 293T-cellen, zwenk voorzichtig en plaats de cellen gedurende 12-14 uur in een incubator op 37°C.
    10. De volgende ochtend vroeg wordt het medium afgegezogen en vervangen door 20 ml vers, op 37°C voorverwarmd medium.
  2. Oogsten en concentreren van het lentivirus
    1. Oogst achtenveertig uur na de transfectie 20 ml medium dat het lentivirus bevat en breng dit over in een conische buis van 50 ml.
    2. Voeg 20 ml op 37°C voorverwarmd medium toe aan de 293T-cellen en plaats deze terug in de incubator.
    3. Centrifugeer het virale supernatant 10 min. bij 450 g om celresten te verwijderen en breng dit over naar een nieuwe buis van 50 ml. Alternatief kan het supernatant door een 0.45μm filter worden geleid. Bewaar het geklaarde supernatant bij 4°C.
    4. Oogst vierentwintig uur later de resterende 20 ml medium. NB: Wij stellen vast dat de virustiters in beide oogsten ongeveer gelijk zijn, namelijk 1x 106 TU/ml.
    5. Om de virussen te concentreren, worden de virale supernatanten verdeeld over Beckman OptiSeal-buizen (gebruik 32.4 ml supernatant per buis) en gecentrifugeerd bij 100,000g gedurende 1.5u bij 4°C met een swing-out rotor. N.B. Alternatieve methoden om het virus-supernatant te concentreren zijn centrifugatie bij 47,000 g gedurende 2u of bij 3,000 g gedurende 8u. Vries het virus niet in vóór de concentratie. Bevriezing veroorzaakt neerslag van eiwitten, waardoor het moeilijk wordt om het virus opnieuw te suspenderen.
    6. Zuig direct na de ultracentrifugatie het supernatant langzaam af met een plastic pipet van 10 ml en gooi dit weg. NB: Wees voorzichtig om de pellet niet te verstoren, aangezien deze gemakkelijk van de buiswand kan loslaten. Na het weggooien van de eerste 5ml supernatant knippen wij gewoonlijk de bovenkant van de ultracentrifugebuis af om zoveel mogelijk supernatant te verwijderen; laat ongeveer 100-200 μl medium onderin de buis achter.
    7. Voeg 100 μl 1xPBS toe, laat de pellet 30 min. oplossen bij RT en resuspendeer door 15-20 keer op en neer te pipetteren. NB: Normaal gesproken verkrijgen wij ~200-300 μl geconcentreerd virus.
    8. De geconcentreerde lentiviruspreparatie wordt getitreerd op NIH3T3-cellen met behulp van een protocol van Invitrogen (Block-it lentiviral RNAi Expression System). NB: Wij verkrijgen gewoonlijk virustiters van 2 tot 10x108 transducing units (TU)/ml.
    9. Het virus kan nu worden gebruikt voor infectie (zie paragraaf 2) of in aliquoten worden verdeeld en bewaard bij -80°C voor maximaal 6 maanden. NB: Stel virussuspensies niet bloot aan meer dan één vries-dooi-cyclus. Virussen zijn stabiel gedurende 4-5u bij 37°C, 2-3 dagen bij RT of één week bij 4°C.

2. Lentivirale infectie van primaire erytroïde cellen voor genoverdracht

  1. Infectie
    Gekerneerde erytroïde cellen kunnen in elke fase van differentiatie efficiënt worden geïnfecteerd, mits een hoge MOI (multiplicity of infection) van 50-100 wordt gebruikt. Hier beschrijven we een typisch experiment waarbij lentivirussen die een TAL1- of scramble-shRNA tot expressie brengen, worden gebruikt om erytroïde cellen op dag 8 en 9 van differentiatie te infecteren met een MOI van 50 TU/cel. RNA wordt elke 24 uur geëxtraheerd om het niveau van TAL1 KD via RT-qPCR te verifiëren. GFP-expressie wordt parallel gemeten via FACS om de infectie-efficiëntie te evalueren (zie representatieve resultaten in Figuur 6).
    • Dag 0:
      1. Bereid drie conische buizen van 15 ml voor die elk 1x106 erytroïde cellen bevatten (bijv. één buis voor TAL1-knockdown, één buis voor scrambled negatieve controle, één buis voor GFP-expressiecontrole).
      2. Was de cellen met 5 ml gesupplemeerd IMDM-medium met SCF en EPO (zie Deel I), centrifugeer bij 200 g gedurende 5 min. en verwijder zoveel mogelijk supernatant.
      3. Voeg polybrene (Tabel 4) toe aan de geconcentreerde virusoplossing tot een eindconcentratie van 40 μg/ml.
      4. Voeg 100 μl geconcentreerd virus (bijv. 5x107 TU) met polybrene toe aan elke buis met erytroïde cellen.
      5. Incubeer gedurende 1 u in de incubator bij 37°C en meng elke 10 min. door tegen de wand van de buis te tikken. N.B. de infectie moet worden uitgevoerd in minimale hoeveelheden medium om maximale adsorptie van het lentivirus op de cellen mogelijk te maken. Bovendien zorgt mengen elke 10 min. voor een gelijkmatige distributie van het virus over de cellen.
      6. Voeg 900 μl gesupplemeerd IMDM-medium met SCF en EPO (Tabellen 2 en 3) toe aan elke buis.
      7. Overbreng elke sample naar een 6-well plaat en plaats deze gedurende 24 u in de 37°C incubator.
    • Dag 1: Oogst de cellen in afzonderlijke buizen van 15 ml, centrifugeer deze bij 200 g gedurende 5 min., verwijder het supernatant en herhaal de infectie (stappen b tot g hierboven).
    • Dag 2: Was de cellen en resuspendeer ze in gesupplemeerd IMDM met SCF en EPO op 0,2x106 cel/ml en ga verder zoals beschreven in Deel I.
  2. Representatieve resultaten
    Figuur 6A illustreert het protocol voor lentivirale infectie van primaire erytroïde cellen gevolgd door RNA-extractie. In één experiment hebben we erytroïde cellen geïnfecteerd met lentivirus dat een shRNA produceert gericht tegen de transcriptiefactor TAL1 of een scrambled controle 11. Figuur 6B laat zien dat we met succes 75% van de TAL1-transcripten in primaire erytroïde cellen hebben uitgeschakeld. Let ook op de toename van het TAL1-transcriptniveau van Dag 9 naar Dag 12 in de scrambled controle, wat het belang van deze transcriptiefactor tijdens erytroïde differentiatie onderstreept. In een ander experiment hebben we erytroïde cellen geïnfecteerd met lentivirus dat het GFP-eiwit tot expressie brengt. Figuur 6C laat zien dat drie dagen na infectie de meeste erytroïde cellen (87%) GFP tot expressie brengen, gemeten via fluorescentie onder de microscoop en FACS. Dit wijst op een hoge infectie-efficiëntie in primaire erytroïde cellen. We hebben eerder CD34+ cellen op Dag 0 geïnfecteerd met een vergelijkbare infectie-efficiëntie (gegevens niet getoond). De belangrijkste parameter voor efficiënte transductie van primaire cellen is het gebruik van een hoge MOI (d.w.z. geconcentreerde lentivirussen). Als een lage MOI wordt gebruikt (d.w.z. niet-geconcentreerd virus), zal de transductie-efficiëntie afnemen.

3. Representatieve resultaten

Diagram van positieve isolatie van CD34+ HSC's; immunomagnetische scheiding, serumvrije erytroïde differentiatie.
Figuur 1. Protocoloverzicht voor de isolatie en ex vivo erytroïde differentiatie van humane primaire hematopoëtische stam-/progenitorcellen. (Stap1) CD34+ cellen (zuiverheid van 95 ± 3%) worden geïsoleerd uit navelstrengbloed, beenmerg of met G-CSF gemobiliseerd humaan perifeer bloed (leukaferese) middels positieve immunomagnetische selectie. (Stap2) CD34+ cellen worden gekweekt in vloeibare cultuur volgens het aangegeven vierstappenprotocol.

Grafiek van celamplificatie; logaritmische schaal; cultuurdagen versus trendanalyse van celgroei.
Figuur 2. Celamplificatie tijdens het ex vivo erytroïde differentiatieprotocol. Resultaten zijn weergegeven op een logaritmische schaal. Representatieve resultaten verkregen met CD34+ cellen geïsoleerd uit leukaferesis.

Schema van de stadia van erytropoëse, microscopische beelden die de ontwikkeling van RBC's over 26 dagen volgen.
Figuur 3. Morfologische celanalyse tijdens ex vivo erytroïde differentiatie. Cellen zijn gekleurd met May-Grünwald-Giemsa-reagens op de aangegeven tijdstippen tijdens de differentiatie (vergroting x 40). HSC: hematopoëtische stam-/progenitorcellen; BFU-E: burst forming units – erythroid; CFU-E: colony forming units – erythroid; Pro EB: pro-erythroblasten; Baso EB: basofiele erythroblasten; Poly EB: polychromatofiele erythroblasten; Ortho EB: orthochromatische erythroblasten; RET: reticulocyten; RBC: rode bloedcellen.

Schema van semi-solide assay; groei van progenitorcellen CFU-GM, BFU-E, CFU-E; celculturedagen; beeldvergelijking.
Figuur 4. Colony-forming cell (CFC) assays voor de detectie en kwantificering van hematopoëtische progenitorcellen. Op de aangegeven tijdstippen werden 104 cellen uitgezaaid in een semi-solide methylcellulose-medium in aanwezigheid van recombinante humane cytokinen: rh SCF, rh GM-CSF, rh G-CSF, rh Il-3, rh EPO om de optimale groei van erytroïde progenitorcellen (BFU-E en CFU-E) en granulocyt-macrofaag-progenitorcellen (CFU-GM) te ondersteunen. BFU: burst forming units; CFU: colony forming units. Typische beelden van BFU-E en CFU-E worden ook getoond. Let op de roodbruine kleur als gevolg van hemoglobinisatie van BFU-E en CFU-E.

Grafieken van hematopoëtische differentiatie die celmarkers CD34, CD36, CD71, GPA, Benzidine, LDS in de loop van de tijd tonen.
Figuur 5. Kinetiek van hematopoëtische/erythroïde markers tijdens ex vivo erythroïde differentiatie. Op de aangegeven tijdstippen werden 2x105 cellen geoogst en geanalyseerd op expressie van de aangegeven markers via FACS (CD34, CD36, CD71, GPA en LDS) of via microscopie (Benzidine). De balken vertegenwoordigen de percentages positieve cellen. CD34: transmembraan glycoproteïne, aanwezig op menselijke hematopoëtische stam-/progenitorcellen; CD36: thrombospondine-receptor, aanwezig op progenitorcellen; CD71: transferrinereceptor, aanwezig op erythroïde progenitors en reticulocyten; GPA: glycophorine A, aanwezig op erythroïde precursoren en erytrocyten; Benzidine: hemoglobinekleuring; LDS: laser dye styryl, DNA-kleuring.

Tijdlijn van lentivirus shRNA-infectie, staafdiagram van TAL1 mRNA-expressie, GFP-microscopie, flowcytometrie.
Figuur 6. Lentivirale genoverdracht in primaire menselijke proerythroblasten. (A) Tijdlijn voor de inductie van TAL1-knockdown (KD) in primaire proerythroblasten met gebruik van het lentivirale genoverdrachtssysteem. (B) TAL1-knockdown werd gemedieerd door via lentivirus afgeleverd anti-Tal1 shRNA (TAL1 KD) of een scrambled controle-shRNA (Scr). De kinetiek van het TAL1 mRNA-transcriptniveau is gemeten via RT-qPCR. Het TAL1-transcript is uitgedrukt relatief aan 18S RNA. (C) Via lentivirus afgeleverd GFP werd getest met microscopie (linkerpaneel) of FACS (rechterpaneel). 87% van de cellen was GFP-positief.

4. Materialen

ReagensBronCatalogusnummer
RPMI 1640 SigmaR8758
Collagenase BRoche Applied Science11088807001
DNase ISigmaD5025-15KU
Pre-Separation Filters (30μm nylon mesh)Miltenyi Biotec Inc130-041-407
Ficoll-paque PLUS GE Healthcare Bio-Sciences17-1440-03
EasySep 10x Red Blood Cells Lysis BufferStemCell Technologies20120
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec Inc130-046-703
LS Mini-Macs columnsMiltenyi Biotec Inc130-042-401
autoMACS Running Buffer-MACS Separation BufferMiltenyi Biotec Inc130-091-221
MiniMACS SeparatorMiltenyi Biotec Inc130-042-102
Stromale cellen uit muisbeenmerg MS-5 (regelmatig testen op mycoplasma-contaminatie)DSMZACC 441
Trypan Blue-oplossing (0,4%)SigmaT8154
MEM Alpha+GlutaMAX Gibco Invitrogen 32571
Trypsine 0,05%/EDTAThermoScientific J101521
May Grunwald Giemsa Biostain Ready Reagents Ltd RRSP54
Methocult Colony-Forming Cell (CFC) Assays voor menselijke cellen StemCell Technologies 04044

Tabel 1.

ComponentStamoplossingVolume 600 ml
IMDMSigma I3390443,4 ml
Pen/Strept 1% (vol/vol)Gibco 103786ml
L-glutamine 4x10-3M200mM (Gibco 25030)12 ml
Inositol 40μg/ml4mg/ml (Sigma I5125)
bereiding: Los 28 mg poeder op in 7 ml IMDM en steriliseer door filtratie; stabiel gedurende 1 week bij 4°C.		6ml
Foliumzuur 10μg/ml1 mg/ml (Sigma F7876)
bereiding: Los 7 mg poeder op in 7 ml voorverwarmd IMDM en steriliseer door filtratie; stabiel gedurende 1 week bij 4°C. Voorverwarmen voor gebruik.		6ml
Monothioglycerol 1,6x10-4M0,16M (Sigma M6145)
bereiding: Los 10 μl van de 11,56M stamoplossing op in 712 μl IMDM en steriliseer door filtratie; stabiel gedurende 1 week bij 4°C.		0,6ml
IJzer(II)nitraat 90 ng/ml18μg/ml (Sigma 8508)
bereiding: Los 1,8 mg op in 1ml gedestilleerd water. Neem 0,1 ml, voeg 9,9 ml IMDM toe en steriliseer door filtratie; stabiel gedurende 1 week bij 4°C.		3ml
IJzer(II)sulfaat 900 ng/ml180 μg/ml (Sigma F8633)
bereiding: Los 18 mg op in 1ml gedestilleerd water. Neem 0,1 ml, voeg 9,9 ml IMDM toe en steriliseer door filtratie; stabiel gedurende 1 week bij 4°C.		3ml
Runder serumalbumine-Insuline-Transferrine (BIT)
20% (vol/vol)		StemCell Technologies 9500120 ml

Tabel 2.

ComponentStamoplossingVolume toe te voegen aan 100 ml gesupplemeerd IMDM (Tabel 2)
Hydrocortison (HC) 10-6 M10-4 M (Sigma H2270)
bereiding: Los 5mg poeder op in 1,03ml IMDM. Neem 0,1 ml, voeg 9,9 ml IMDM toe en steriliseer door filtratie. Stabiel gedurende 1 week bij 4°C.		1ml
Stem Cell Factor (SCF) 100ng/ml100 μg/ml (Cedarlane 4327-50)
bereiding: Los 50 μg poeder op in 500 μl PBS+0,1% BSA en steriliseer door filtratie. Maak aliquots van 100 μl en bewaar bij -20°C.		100 μl
Erytropoëtine (EPO) 3 IU/ml100 μg/ml equivalent van 12.000UI/ml (Feldan FB03-10-290)
bereiding: Los 50 μg poeder op in 500 ml PBS+0,1% BSA en steriliseer door filtratie. Maak aliquots van 25 ml en bewaar bij -20°C.		25 μl
Interleukine 3 (IL3) 5 ng/ml100 μg/ml (Feldan FB03-10-330)
bereiding: Los 10 μg poeder op in 100 μl PBS+0,1% BSA en steriliseer door filtratie. Maak aliquots van 5 ml en bewaar bij -20°C.		5 μl

Tabel 3.

ReagensBronReferentie
293T-cellen
(regelmatig testen op mycoplasma-contaminatie) 		ATCCCRL-11268
DMEM/High GlucoseThermoScientificSH30243.01
Hexadimethrinebromide (Polybrene)SigmaH9268-5G
OptiSeal ultracentrifugatiebuizenBeckman Coulter361625
psPAX2-plasmideAddgene (laboratorium van D. Trono)12260
pMD2.G-plasmideAddgene (laboratorium van D. Trono)12259
pBLOCK-it6-DEST (shTal1) plasmideTal1 shRNA-sequentie gekloneerd in het pBLOCK-it6-DEST-plasmide van InvitrogenPalii et al. EMBO J.
pBLOCK-it6-DEST (shScr) plasmideScrambled shRNA-sequentie gekloneerd in het pBLOCK-it6-DEST-plasmide van InvitrogenPalii et al. EMBO J.
pWPI-plasmideAddgene (laboratorium van D. Trono)12254

Tabel 4.

BufferBereidingEindconcentratie
2xHBS
  • 1.6 g NaCl
  • 1.3 g HEPES
  • 0.04 g Na2HPO4(7H2O)
  • Voeg Milli-Q water toe.
  • Stel de pH exact in op 7.11-7.13 door toevoeging van NaOH-oplossing en vul aan met Milli-Q water tot 100 ml.
  • Verfijn de pH naar 7.11-7.13.
  • Steriliseer door filtratie, maak aliquots van 10 ml en bewaar bij -200C
  • 280 mM
  • 100 mM
  • 1.5 mM
CaCl2
  • 2.77 g watervrij CaCl2
  • Los op in 10 ml Milli-Q water.
  • Steriliseer door filtratie, maak aliquots van 1 ml en bewaar bij -20°C
  • 2.5M
MS30
  • 25ml [2M] Tris pH8.0
  • 5ml [0.5M] EDTA
  • 300ml Glycerol
  • 50mM
  • 2.5mM
  • 30% (v/v)

Tabel 5.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een aantal methoden zijn eerder gebruikt om de cellen te differentiëren erythroïde in cultuur met een variabele mate van succes. Bijvoorbeeld, sommige protocollen zonder co-cultuur op de MS-5 maakt uitbreiding van erythroïde cellen, maar zijn niet efficiënt in het produceren van volledig rijpe enucleated rode bloedcellen 12-17. Terwijl andere methoden is het mogelijk een efficiënte enucleatie, is het ten koste van de proliferatie 18,19. De methode die we hier hebben gebruikt, in eerste instantie on...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken L. Douay en MC Giarratana (Universite Paris VI, Frankrijk) voor advies over de ex vivo erytroïde differentiatie, D. Allan en H. Atkins (Ohří, Canada) voor het leveren van bloedmonsters (verkregen in het kader van de Ottawa Hospital Research Ethics board # 2007804-01H), D. Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne) voor het verstrekken van de lentivirale vectoren en FJ Dilworth (Ohří, Canada) voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit project werd gefinancierd door een subsidie ​​CIHR (MOP-82813) om MBCGP is een ontvanger van een Ontario Research Fund Computational Regulomics Training Postdoctoraal Fellowship. MB houdt de Canada Research Chair in de regulatie van genexpressie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Referenties

  1. Orkin, S. H., Zon, L. I. Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132, 631-644 (2008).
  2. Kim, S. I., Bresnick, E. H. Transcriptional control of erythropoiesis: emerging mechanisms and principles. Oncogene. 26, (2007).
  3. Friend, C., Patuleia, M. C., De Harven, E. Erythrocytic maturation in vitro of murine (Friend) virus-induced leukemic cells. Natl Cancer Inst Monogr. 22, 505-522 (1966).
  4. Weiss, M. J., Yu, C., Orkin, S. H. Erythroid-cell-specific properties of transcription factor GATA-1 revealed by phenotypic rescue of a gene-targeted cell line. Mol Cell Biol. 17, 1642-1651 (1997).
  5. Lozzio, B. B., Lozzio, C. B., Bamberger, E. G., Feliu, A. S. A multipotential leukemia cell line (K-562) of human origin. Proc Soc Exp Biol Med. 166, 546-550 (1981).
  6. Giarratana, M. C. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  7. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Curr Protoc Neurosci. Chapter 4, (2006).
  8. Chao, M. P., Seita, J., Weissman, I. L. Establishment of a normal hematopoietic and leukemia stem cell hierarchy. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 73, 439-449 (2008).
  9. Amsellem, S., Ravet, E., Fichelson, S., Pflumio, F., Dubart-Kupperschmitt, A. Maximal lentivirus-mediated gene transfer and sustained transgene expression in human hematopoietic primitive cells and their progeny. Mol Ther. 6, 673-677 (2002).
  10. Laurenti, E. Inducible gene and shRNA expression in resident hematopoietic stem cells in vivo. Stem Cells. 28, 1390-1398 (2010).
  11. Palii, C. G. Differential genomic targeting of the transcription factor TAL1 in alternate haematopoietic lineages. EMBO J. 30, 494-509 (2011).
  12. Fibach, E., Manor, D., Oppenheim, A., Rachmilewitz, E. A. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood. 73, 100-103 (1989).
  13. Wada, H. Expression of major blood group antigens on human erythroid cells in a two phase liquid culture system. Blood. 75, 505-511 (1990).
  14. Sui, X. Erythropoietin-independent erythrocyte production: signals through gp130 and c-kit dramatically promote erythropoiesis from human CD34+ cells. J Exp Med. 183, 837-845 (1996).
  15. Panzenbock, B., Bartunek, P., Mapara, M. Y., Zenke, M. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro. Blood. 92, 3658-3668 (1998).
  16. Lindern, M. von The glucocorticoid receptor cooperates with the erythropoietin receptor and c-Kit to enhance and sustain proliferation of erythroid progenitors in vitro. Blood. 94, 550-559 (1999).
  17. Freyssinier, J. M. amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol. 106, 912-922 (1999).
  18. Malik, P. An in vitro model of human red blood cell production from hematopoietic progenitor cells. Blood. 91, 2664-2671 (1998).
  19. Carlile, G. W., Smith, D. H., Wiedmann, M. Caspase-3 has a nonapoptotic function in erythroid maturation. Blood. 103, 4310-4316 (2004).
  20. Mazurier, F. Rapid analysis and efficient selection of human transduced primitive hematopoietic cells using the humanized S65T green fluorescent protein. Gene Ther. 5, 556-562 (1998).
  21. Salmon, P. High-level transgene expression in human hematopoietic progenitors and differentiated blood lineages after transduction with improved lentiviral vectors. Blood. 96, 3392-3398 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van CD34-positieve cellenco-cultuur van stromale cellenlentivirus-infectieprotocolGFP-expressieanalyseRT-qPCR-knockdown-validatieTAL1-transcriptiefactorerytroïde differentiatieprotocol
Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.