Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

Samenvatting

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Samenvatting

Stem en tumor celbiologie studies vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, het verhogen van de belangrijkste veiligheidsproblemen voor laboratorium personeel. Pantropic lentivirussen, zoals de veelgebruikte VSV-G pseudotype, zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van genen de functie omdat ze transduceren vele soorten cellen, waaronder niet-delende cellen. Echter, kunnen onderzoekers willen de productie en centrifugeren van pantropic virussen coderen oncogenen als gevolg van hogere bioveiligheidsniveau handling-eisen en veiligheid te voorkomen. Een aantal krachtige oncogenen, zoals c-Myc en SV40 grote T antigen, is bekend dat de productie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) te verbeteren. Alle andere bekende IPSC-inducerende genetische veranderingen (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, en p53 verlies van functie) hebben ook links naar kanker, waardoor ze van de relatief hoge veiligheid zorg ook.

Hoewel deze kanker-gerelateerde virussen zijn nuttig in het bestuderen van cellulaire herprogrammering en pluripotentie, moeten ze veilig gebruikt worden. Om deze problemen bioveiligheid, demonstreren we een methode voor de transductie van menselijke cellen met ecotropic lentivirus, met extra nadruk op de lagere kosten en comfortabele bediening. Wij hebben ecotropic lentivirus met een voldoende hoge titer tot meer dan 90% van de transduceren receptor-expressie menselijke cellen blootgesteld aan het virus, het valideren van de effectiviteit van deze aanpak.

Lentivirus wordt vaak geconcentreerd door ultracentrifugatie, maar dit proces duurt enkele uren en kunnen produceren aërosolen besmettelijk voor de mens biomedische onderzoekers. Als alternatief, virale deeltjes kunnen meer veilig gesedimenteerd op cellen door complexvorming met chondroïtine sulfaat en polybreen (CS / PB). Deze techniek verhoogt de functionele virale titer tot 3-voudig in cellen die stabiel uitdrukken muriene retrovirus receptor, met een verwaarloosbare extra tijd en kosten. Transductie van menselijke dermale fibroblasten (HDFS) is maximaal verbeterd met behulp van CS / PB concentraties van ongeveer 4-maal lager dan de optimale waarde die eerder gerapporteerd voor kanker cellijnen, wat suggereert dat polymeerconcentratie moet worden getitreerd voor het doel celtype van belang. Wij zijn dan ook beschrijven het gebruik van methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) voor het testen van toxiciteit voor het polymeer in een nieuwe cel type. We observeren equivalent leefbaarheid van HDFS na het virale transductie met behulp van polymeer complexering of de standaard dosis van polybreen (PB, 6 ug / ml), wat aangeeft een minimale acute toxiciteit.

In dit protocol beschrijven we het gebruik van ecotropic lentivirus voor overexpressie van oncogenen in menselijke cellen, het verminderen van bioveiligheid risico's en het verhogen van de transductie tarief. We tonen ook aan het gebruik van polymeer complexatie aan transductie te verbeteren terwijl het vermijden van aërosolvormende centrifugeren van virale deeltjes.

Protocol

1. Productie, oogsten en invriezen van lentivirus

1. Raadpleeg de veiligheidsfunctionaris van uw instelling voordat u met dit protocol begint en volg de door hen aanbevolen veiligheidsrichtlijnen.
2. Dag 1. Begin met gezonde, snelgroeiende 293T-cellen voor de productie van het virus. Zaai de cellen uit in een dichtheid van 5 x 10⁶ cellen per 10 cm plaat. Gebruik antibioticavrij 293T-medium (hoog-glucose DMEM met 10% FBS en 4 mM L-glutamine) voor de virusproductie.
3. Dag 2. Transfect in de late namiddag de 293T-cellen als volgt (de opgegeven hoeveelheden zijn voor één 10 cm plaat). Laat alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur. Pipetteer 375 μl OptiMEM in een microcentrifugebuisje en voeg vervolgens 25 μl Fugene HD toe. Zorg dat onverdunde Fugene de wand van het buisje niet raakt.
4. Meng in een microcentrifugebuisje het volgende:
   • 5 μg transferplasmide (Slc7a1, targetvector of fluorescentie-controlevector)
   • 3,75 μg verpakkingsplasmide (pCMV-dR8.91 of psPax2)
   • 1,25 μg envelopplasmide (pMD2.G voor pantropisch, pHCMV-EcoEnv voor ecotropisch)
   • serumvrij OptiMEM tot 100 μl
5. Combineer de twee buisjes en incubeer het mengsel 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
6. Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticavrij 293T-medium. Voeg het Fugene/plasmide-mengsel druppelgewijs toe aan de plaat en incubeer dit overnacht bij 37°C, 5% CO₂.
7. Dag 3. Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticavrij 293T-medium. Doe dit voorzichtig, omdat 293T-cellen slechts zwak hechten en kunnen loslaten wanneer medium te krachtig op de monolaag wordt gepipetteerd. Incubeer gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator voor virusproductie.
8. Dag 5. Oogst het virus en filter dit met een 0,45 mm filter met lage eiwitbinding. Gebruik het direct of verdeel het in eenmalige aliquots en vries deze in bij -80°C. Bevroren pantropisch en ecotropisch virus moet respectievelijk na zes maanden en één maand opslag opnieuw getitreerd worden.
9. Titreer het virus als volgt, met cellen die relatief vatbaar zijn voor transductie. Transduceer de cellen overnacht met het fluorescentie-controlevirus met behulp van seriële verdunningen (bijv. 1:10, 1:100, 1:1000) in vers medium met 6 μg/ml PB. Vervang het medium de volgende dag door vers medium. Geef de cellen na transductie twee dagen de tijd om het fluorescerende eiwit tot expressie te brengen en bepaal vervolgens het fractie aandeel getransduceerde cellen via FACS. Bereken de titer in transformerende eenheden (TU) per ml, gebaseerd op verdunningen die < 15% transductie opleveren om meervoudige transductiegebeurtenissen te minimaliseren.
   

2. Transductie van menselijke doelcellen met de murine retrovirusreceptor Slc7a1

1. Kies een multiplicity of infection (MOI) = 2 om ervoor te zorgen dat de meeste cellen worden getransduceerd. Voor doelcellen die resistent zijn voor transductie, zoals HDF's, is een hogere MOI vereist; wij verdunnen het virale supernatant slechts 1:2 om transductie van de meerderheid van de cellen te bereiken.
2. Transduceer de doelcellen gedurende de nacht met viraal supernatant verdund in vers kweekmedium met 6 μg/ml PB, wat de transductie verhoogt door de elektrostatische interactie tussen het virus en de doelcel te verbeteren.¹ Idealiter dient men een minimaal volume virus te gebruiken, zoals 1 ml voor een plaat van 35 mm, omdat diffusie een beperkende factor is voor de transductie-efficiëntie.
3. Kweek de cellen ten minste 48 uur na het verwijderen van het virus voordat ze worden getransduceerd met ecotroop virus, om voldoende expressie van de Slc7a1-receptor te waarborgen.
4. (Optioneel) Indien gewenst is het mogelijk om blasticidine te gebruiken voor selectie van stabiel getransduceerde cellen die Slc7a1 tot expressie brengen. Er moet vooraf een blasticidine kill-curve worden opgesteld om de laagste effectieve concentratie te bepalen, over het algemeen tussen 2 – 10 μg/ml, die alle niet-getransduceerde doelcellen binnen 7 dagen doodt. Ongeveer 2 dagen na het verwijderen van het Slc7a1-virus worden de getransduceerde cellen overgezet naar medium dat blasticidine bevat. Kweek de cellen gedurende 7 dagen in medium met blasticidine, waarna alle overgebleven cellen de retrovirale receptor stabiel tot expressie zullen brengen; op dat moment kunnen ze worden getransduceerd met ecotroop virus en kunnen ze worden opgeslagen voor toekomstig gebruik als een stabiele Slc7a1-exprimerende lijn.

3. Titratie van polymeercomplexen om toxiciteit te bepalen

1. Dag 1. Plaats cellen uit in een 96-wells plaat met een dichtheid van 5000 cellen/well, waarbij ten minste drie replica-wells per experimentele groep worden gebruikt. Neem niet-getransduceerde cellen in volledig medium op om een basiswaarde voor gezonde cellen te verkrijgen, evenals monsters bestaande uit cellen in serumvrij medium om groeistop te induceren als controle. Plaats parallel cellen uit in een passend formaat (zoals een 24-wells plaat) voor microscopische of FACS-gebaseerde analyse van de transductie-efficiëntie voor elke experimentele conditie.
2. Dag 2. Transduceer cellen in platen die zijn klaargezet voor zowel de MTT- als FACS-analyses met een virus dat GFP codeert, bij een MOI van 0,5 om ~40% van de doelcellen te transduceren. Test verschillende concentraties CS/PB (bijv. 50, 100, 200, 400, 600 en 800 mg/ml van elke component), evenals 6 μg/ml PB, om de optimale hoeveelheden te bepalen. Genereer polymeercomplexen zoals beschreven in Deel 4, hieronder.
3. Dag 3. Verwijder het virusbevattende medium en vervang dit door vers medium. Plaats de platen terug in een bevochtigde incubator.
4. Dag 5. Analyseer de FACS-plaat om de transductie-efficiëntie bij elke polymeerconcentratie te bepalen.
5. Dag 6. Verwijder het medium uit alle wells van de MTT-plaat en vervang dit door 100 μl MTT-oplossing (1 mg/ml MTT in volledig medium). Kweek drie uur lang in een bevochtigde incubator zodat MTT gereduceerd kan worden in de mitochondria van metabolisch actieve cellen.
6. Verwijder de MTT-oplossing en vervang deze door 200 ml MTT-oplosmiddel (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanol).
7. Incubeer twee uur lang bij kamertemperatuur of totdat al het paarse MTT-formazanprecipitaat is opgelost. Lees de absorbentie af op een microplate reader bij 570 nm, waarbij de achtergrondwaarde bij 690 nm wordt afgetrokken.
8. Selecteer de optimale polymeerconcentratie die een maximale verbetering van de transductie oplevert, bepaald via FACS, met een minimaal effect op de metabolische activiteit, bepaald via MTT. Voor HDFs hebben we 100 μg/ml CS/PB geselecteerd op basis van de gegevens getoond in de Representatieve Resultaten, hieronder.

4. Ecotrope transductie met polymeercomplexatie

1. Bereid steriel gefilterde voorraadoplossingen van PB en chondroïtinesulfaat voor in water bij een concentratie van 20 mg/ml. Verdeel deze in aliquoten en bewaar ze bij -20°C.
2. Pipetteer viraal supernatant in een microcentrifugebuisje en verdun dit met vers kweekmedium tot de gewenste eindconcentratie (bijv. een MOI van 2). Voeg vervolgens opeenvolgend gelijke volumes PB en chondroïtinesulfaat toe (concentraties bepaald in stap 3 hierboven), waarbij het buisje na elke toevoeging kort wordt geschud om te mengen. Het virale mengsel wordt onmiddellijk troebel door de vorming van precipitaten. Incubeer het virale mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van complexen mogelijk te maken.
3. Verwijder het medium van de receptor-expresserende doelcellen, vervang dit door het virale mengsel en incubeer dit gedurende de nacht bij 37°C en 5% CO2. Was na het verwijderen van het virale mengsel het celoppervlak twee keer met PBS om te helpen bij het verwijderen van virale complexen. Volledige verwijdering is niet noodzakelijk; we hebben geen nadelige effecten op de gezondheid van de cellen waargenomen door residuele polymeercomplexen.

5. Verifiëren van de specificiteit van ecotrope transductie

1. Bij de eerste productie van ecotroop virus is het vanuit veiligheidsoogpunt raadzaam te verifiëren dat het virus niet in staat is om ongemodificeerde menselijke cellen te transduceren. Transduceer menselijke cellen gedurende de nacht met ecotroop lentivirus in een relatief hoge concentratie (slechts een 1 tot 2-voudige verdunning van het viraal supernatant in vers medium) met 6 μg/ml PB of een geoptimaliseerde CS/PB-concentratie.
2. Verwijder het virushoudende medium en vervang dit door vers medium. Valideer na 2 dagen incubatie van de cellen de expressie van het transgen via FACS met behulp van fluorescente vectoren en/of via RT-PCR met transgeenspecifieke primers.

6. Representatieve resultaten:

Fig. 1A toont het proces van lentivirusproductie, en Fig. 1B toont de transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus, inclusief pre-transductie met de muizen retrovirusreceptor Slc7a1. Voor het bepalen van de virustiter gebruiken we een menselijke rhabdomyosarcom-cellijn die stabiel is getransduceerd met Slc7a1 (Slc-hRMS). Bij het gebruik van fluorescente controlevectoren om de transductie-efficiëntie te monitoren, bereiken we routinematig een transductie-efficiëntie van > 90% van Slc-hRMS met ecotroop virus, zoals getoond in Fig. 2A en 2B. De transductiesnelheden van HDF's zijn over het algemeen lager omdat de cellen niet met blasticidine zijn geselecteerd op receptor-expressie (Fig. 2C). Titers van ecotroop lentivirus bedragen over het algemeen 10-20% van VSV-pseudotypisch virus wanneer gemeten op Slc-hRMS (Fig. 2D).

Eén vries-dooi-cyclus vermindert de titer van het ecotrope virus met 16 - 3%, wat gelijk is aan het titerverlies tijdens een enkele vries-dooi-cyclus van VSV-pseudotypisch virus (p > 0,05). In tegenstelling tot eerdere rapporten,² observeren we geen positief effect op de virustiter door flitsbevriezing in droogijs. In plaats daarvan bereiken we hogere titers na ontdooiing van beide pseudotypen door de buisjes met virus simpelweg in een vriezer van -80°C te plaatsen (gegevens niet getoond).

De MTT-viabiliteitsassay maakt een gevoelige detectie van groeistop in doelcellen mogelijk. Transductie met virus plus concentraties CS/PB tot 800 μg/ml heeft geen effect op het metabolisme van HDF (Fig. 3A). Blootstelling aan CS/PB zonder virus heeft eveneens geen toxisch effect op de cellen (gegevens niet getoond). FACS-analyse van HDF's getransduceerd met virus plus diverse concentraties CS/PB laat een verbetering van de transductie zien in vergelijking met PB alleen (Fig. 3B). De maximale verbetering treedt op bij 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), wat enkele malen lager is dan eerder gerapporteerde waarden.³ Daarom is het belangrijk om de condities te optimaliseren voor elk specifiek type doelcel.

Complexatie met CS/PB verhoogt de waargenomen titer in Slc-hRMS ongeveer 3-voudig (Fig. 4A, p < 0,01). In de praktijk resulteert dit bij lage virusconcentraties in een groter effect op de transductie-efficiëntie dan bij hogere concentraties (Fig. 4B), wat zeer waarschijnlijk te wijten is aan meervoudig getransduceerde cellen en receptorverzadiging bij hogere virusconcentraties.

Transductie met ecotroop virus is specifiek voor cellen die de murine retrovirusreceptor tot expressie brengen. Bij transductie van ongemodificeerde menselijke cellen met ecotroop virus hebben we geen fluorescentie waargenomen die groter was dan de achtergrond van niet-getransduceerde cellen, ongeacht of er PB of CS/PB werd gebruikt, zoals getoond in Fig. 5A. Microscopisch gezien vertonen HDF's geen transductie in afwezigheid van de receptor (Fig. 5B), terwijl pre-transductie met de receptor resulteert in fluorescerende cellen (Fig. 5C).

Figuur 1. Schematisch overzicht van (A) het virusproductieproces en (B) transductie van menselijke cellen met de muizen-retrovirusreceptor, gevolgd door ecotroop lentivirus.

Figuur 2. Hoog-efficiënte transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus coderend voor GFP. Cellen werden vooraf getransduceerd met de muize retrovirusreceptor Slc7a1. (A) Menselijke rhabdomyosarcoma-cellijn blasticidine-geselecteerd voor Slc7a1 (Slc-hRMS), getransduceerd (blauw) of niet-getransduceerd (roze) met GFP. (B) Fluorescentie-micrografie van ecotroop-getransduceerde Slc-hRMS (4X). (C) HDF's getransduceerd (blauw) en niet-getransduceerd (roze) met ecotroop GFP lentivirus; cellen werden twee dagen vóór de ecotrope transductie getransduceerd met Slc7a1. (D) Titer van VSV-G gepseudotypiseerd en ecotroop lentivirus, gemeten op Slc-hRMS.

Figuur 3. Optimalisatie van chondroïtinesulfaat/polybrene (CS/PB) concentraties in menselijke dermale fibroblasten. (A) Viabiliteit van HDF's gemeten met MTT-assay na transductie in aanwezigheid van alleen PB of met variërende concentraties CS/PB. (B) Verbetering van de transductie-efficiëntie in HDF's door verschillende concentraties CS/PB, gemeten via FACS. (C) Kwantificering van de transductieverbetering, waaruit blijkt dat maximale transductie optreedt bij 100 μg/ml CS/PB.

Figuur 4. Effect van 400 μg/ml CS/PB op de transductie van Slc-hRMS met ectotroop lentivirus. (A) Verbetering van de titer, en (B) factorverandering in de transductiesnelheid vergeleken met 6 μg/ml polybrene alleen.

Figuur 5. Gebrek aan ecotrope transductie van HDF's bij afwezigheid van de murine retrovirusreceptor Slc7a1. (A) FACS-plot van BJ humane fibroblasten, niet-getransduceerd (roze) of getransduceerd (blauw) met ecotroop GFP-lentivirus, in beide gevallen in afwezigheid van receptor Slc7a1. BJ humane fibroblasten getransduceerd met ecotroop GFP-lentivirus, zonder (B) en met (C) pre-transductie met receptor Slc7a1 (4X).

Discussie

Recombinant ecotropic gammaretrovirus gebaseerd op Moloney murine leukemia virus (MLV) en zijn receptor mSlc7a1 zijn goed bestudeerd en op grote schaal beschikbaar, die al meer dan 20 jaar transgenen te leveren aan muizen cellen. Ecotropic gammaretrovirus is ook meer recent gebruikt om oncogenen te leveren aan menselijke cellen,. In het kader van cellulaire herprogrammering, het gebruik van mSlc7a1 op generatie van amfotrope virus herbergen menselijke oncogenen te voorkomen is goed ingeburgerd maar ^4,5, lentivirus biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van gammaretrovirus in transduceren vuurvaste celpopulaties, ⁶ inclusief primaire cellen die vaak gewenst zijn doelen voor herprogrammering, omdat de lentivirale pre-integratie complex maakt transductie van niet-delende cellen. ⁷

Lentivirussen zijn geproduceerd met tientallen verschillende pseudotypes, waaronder MLV, in een poging om virus tropisme, toxiciteit en andere eigenschappen. ⁸ MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus is gebruikt om muizen cellen, ⁹ transduceren maar is zelden gebruikt op menselijke cellen te veranderen ^10. Daarom het gebruik van de MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus te stellen als een veilige, kosteneffectieve en zeer efficiënte voertuig bekend is of vermoed oncogenen, met inbegrip van cellulaire herprogrammering factoren, te leveren aan menselijke cellen.

Het is van cruciaal belang op te merken dat dit protocol niet helemaal de noodzaak om te produceren en te gebruiken pantropic lentivirus te elimineren, maar eerder dit protocol scheidt het oncogen (s) van de pantropic virus, isolerende onderzoekers van potentiële self-inoculatie met kanker-gerelateerde virussen. Het eiwit mSlc7a1 en haar menselijke homoloog hSlc7a1 zijn alom uitgedrukt aminozuur transporteurs zonder bekende tumorgeniciteit of het vermogen om een selectieve groei voordeel op ontvangende cellen, waardoor ¹¹ mSlc7a1 van een relatief laag risico voor opname in amfotrope virus. Deze extra stap kan met name nuttig zijn in laboratoria ontbreken gewijd virus of weefselkweek faciliteiten van het vereiste niveau van bioveiligheid.

In sommige situaties kan het mogelijk zijn om volledig te elimineren van het gebruik van pantropic virus door het transfecteren van de Slc7a1 plasmide direct in doelcellen, maar veel cellen die nuttig zouden zijn doelwit van deze techniek zijn ook ongevoelig zijn voor transfectie. Als alternatief, de mogelijkheid om te isoleren Slc7a1-getransduceerde cellen door blasticidine selectie houdt in dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirus kan eenmaal worden gebruikt om een ​​voorraad van receptor-expressie cellen, waarna ecotropic virus routinematig gebruikt kunnen worden om deze cellen transduceren voor velen te genereren experimenten. Onderzoekers moeten altijd volgen hun institutionele veiligheid van richtlijnen voor het werken met een lentivirus, ongeacht de tropisme.

Titers van ecotropic virus bereikt met dit protocol zijn matig lager zijn dan VSV-virus pseudogetypeerde, over het algemeen 10-20% van de pantropic virus titer, in overeenstemming met eerdere studies. ^Negen Deze titers werden gemeten in menselijke cellen stabiel getransduceerd met Slc7a1, zodat de lagere waargenomen titer voor ecotropic virus kan gedeeltelijk te wijten aan verschillende expressie van de receptor-gen in target cellen. Niettemin, de virale titers bereikt in ons protocol zijn meer dan voldoende voor de meeste toepassingen en leiden tot transductie van de meerderheid van de cellen, in sommige gevallen> 90% van de cellen.

Centrifugatie-gebaseerde technieken worden vaak gebruikt om virale deeltjes concentreren. Echter, centrifugeren vereist verscheidene uren, genereert infectieuze aërosolen kunnen voortbrengen, en kan resulteren in een significant verlies van virale deeltjes. ¹² Als een alternatief, complexatie met CS / PB kan worden gebruikt om transductie te verbeteren zonder dat virale tropisme. ³ Deze methode is snel (5 minuten ) en goedkoop ($ 0,03 per 10 ml virus), terwijl ongeveer een verdrievoudiging van de waargenomen titer. Geen speciale uitrusting of merkgebonden reagentia nodig zijn, en zagen we een minimale acute toxiciteit na blootstelling van HDFS aan CS / PB, in overeenstemming met eerder werk in andere cellijnen. ¹³ Een potentieel nadeel van dit protocol is dat een aantal microscopisch zichtbare polymeer complexen zich te houden aan de cellen voor meerdere dagen in de cultuur. We kunnen niet uitsluiten dat deze complexen, maar niet openlijk toxisch voor de cellen, kan meer subtiele effecten op cellulaire processen.

Hier hebben we beschreven een methode voor het veilig en efficiënt transducerende menselijke cellen met oncogene factoren. Deze aanpak moet worden van groot nut voor onderzoekers bestuderen van oncogenen en stamcelbiologie inclusief iPS cellen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	Murine MLV receptor
pMD2.G	Addgene	12259	VSV-G envelop
pCMV-dR8.91	D. Trono lab 14		Verpakking plasmide (equivalent plasmide psPax2 is verkrijgbaar bij Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic envelop
FUGW	Addgene	14883	GFP controle plasmide
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	Roche	04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (polybreen)	Sigma-Aldrich	H9268
Chondroïtinesulfaat natriumzout van haaienkraakbeen	Sigma-Aldrich	C4384
Blasticidine S	Visser	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT)	Sigma-Aldrich	M2128
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021