Methodenartikel

Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety

17.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2822

⸱

24 juli 2011

 , 
1Department of Cell Biology and Human Anatomy, School of Medicine, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

Lentivirussen zijn een waardevol onderzoeksinstrument voor het verkennen van genfunctie, maar onderzoekers kunnen wensen om de productie van pantropic bekende lentivirus codering of vermoede oncogenen te vermijden. Als alternatief, presenteren we een veiliger protocol voor het gebruik van ecotropic lentivirus op menselijke cellen aangepast aan de ecotropic receptor mSlc7a1 uit te drukken.

Samenvatting

Stem en tumor celbiologie studies vereisen vaak virale transductie van menselijke cellen met bekende of vermoedelijke oncogenen, het verhogen van de belangrijkste veiligheidsproblemen voor laboratorium personeel. Pantropic lentivirussen, zoals de veelgebruikte VSV-G pseudotype, zijn een waardevol instrument voor het bestuderen van genen de functie omdat ze transduceren vele soorten cellen, waaronder niet-delende cellen. Echter, kunnen onderzoekers willen de productie en centrifugeren van pantropic virussen coderen oncogenen als gevolg van hogere bioveiligheidsniveau handling-eisen en veiligheid te voorkomen. Een aantal krachtige oncogenen, zoals c-Myc en SV40 grote T antigen, is bekend dat de productie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPSC) te verbeteren. Alle andere bekende IPSC-inducerende genetische veranderingen (OCT4, SOX2, KLF4, NANOG, LIN28, en p53 verlies van functie) hebben ook links naar kanker, waardoor ze van de relatief hoge veiligheid zorg ook.

Hoewel deze kanker-gerelateerde virussen zijn nuttig in het bestuderen van cellulaire herprogrammering en pluripotentie, moeten ze veilig gebruikt worden. Om deze problemen bioveiligheid, demonstreren we een methode voor de transductie van menselijke cellen met ecotropic lentivirus, met extra nadruk op de lagere kosten en comfortabele bediening. Wij hebben ecotropic lentivirus met een voldoende hoge titer tot meer dan 90% van de transduceren receptor-expressie menselijke cellen blootgesteld aan het virus, het valideren van de effectiviteit van deze aanpak.

Lentivirus wordt vaak geconcentreerd door ultracentrifugatie, maar dit proces duurt enkele uren en kunnen produceren aërosolen besmettelijk voor de mens biomedische onderzoekers. Als alternatief, virale deeltjes kunnen meer veilig gesedimenteerd op cellen door complexvorming met chondroïtine sulfaat en polybreen (CS / PB). Deze techniek verhoogt de functionele virale titer tot 3-voudig in cellen die stabiel uitdrukken muriene retrovirus receptor, met een verwaarloosbare extra tijd en kosten. Transductie van menselijke dermale fibroblasten (HDFS) is maximaal verbeterd met behulp van CS / PB concentraties van ongeveer 4-maal lager dan de optimale waarde die eerder gerapporteerd voor kanker cellijnen, wat suggereert dat polymeerconcentratie moet worden getitreerd voor het doel celtype van belang. Wij zijn dan ook beschrijven het gebruik van methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) voor het testen van toxiciteit voor het polymeer in een nieuwe cel type. We observeren equivalent leefbaarheid van HDFS na het virale transductie met behulp van polymeer complexering of de standaard dosis van polybreen (PB, 6 ug / ml), wat aangeeft een minimale acute toxiciteit.

In dit protocol beschrijven we het gebruik van ecotropic lentivirus voor overexpressie van oncogenen in menselijke cellen, het verminderen van bioveiligheid risico's en het verhogen van de transductie tarief. We tonen ook aan het gebruik van polymeer complexatie aan transductie te verbeteren terwijl het vermijden van aërosolvormende centrifugeren van virale deeltjes.

Protocol

1. Productie, oogst en invriezen van lentivirus

  1. Raadpleeg de veiligheidsfunctionaris van uw instelling voordat u met dit protocol begint en volg de door hen aanbevolen veiligheidsrichtlijnen.
  2. Dag 1. Begin met gezonde, snel groeiende 293T-cellen voor de productie van het virus. Zaai de cellen uit met 5 x 106 cellen per 10 cm plaat. Gebruik antibioticumvrij 293T-medium (high-glucose DMEM met 10% FBS en 4 mM L-glutamine) voor de virusproductie.
  3. Dag 2. Transfect in de late namiddag de 293T-cellen als volgt (de opgegeven hoeveelheden zijn voor één 10 cm plaat). Laat alle reagentia opwarmen tot kamertemperatuur. Pipetteer 375 μl OptiMEM in een microcentrifugebuis en voeg vervolgens 25 μl Fugene HD toe. Zorg dat onverdunde Fugene de wand van de buis niet raakt.
  4. Meng in een microcentrifugebuis het volgende:
    • 5 μg transferplasmid (Slc7a1, targetvector of fluorescentiecontrolevector)
    • 3,75 μg packagingplasmid (pCMV-dR8.91 of psPax2)
    • 1,25 μg envelopplasmid (pMD2.G voor pantroop, pHCMV-EcoEnv voor ecotroop)
    • serumvrij OptiMEM tot 100 μl
  5. Voeg de twee buisjes samen en incubeer het mengsel 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticumvrij 293T-medium. Voeg het Fugene/plasmid-mengsel druppelsgewijs toe aan de plaat en incubeer dit gedurende de nacht bij 37°C, 5% CO2.
  7. Dag 3. Vervang het medium van de 293T-cellen door 10 ml vers antibioticumvrij 293T-medium. Ga voorzichtig te werk, omdat 293T-cellen slechts zwak hechten en kunnen loslaten wanneer medium te krachtig op de monolaag wordt gepipetteerd. Incubeer gedurende twee dagen in een bevochtigde incubator voor de virusproductie.
  8. Dag 5. Oogst het virus en filter dit met een 0,45 mm filter met lage eiwitbinding. Gebruik het direct of verdeel het in eenmalige aliquots en vries deze in bij -80°C. Bevroren pantrope en ecotrope virussen moeten respectievelijk na zes maanden en één maand bewaring opnieuw worden getitreerd.
  9. Titreer het virus als volgt, met gebruik van cellen die relatief vatbaar zijn voor transductie. Transduceer de cellen gedurende de nacht met het fluorescentiecontrolevirus met behulp van seriële verdunningen (bijv. 1:10, 1:100, 1:1000) in vers medium met 6 μg/ml PB. Vervang dit de volgende dag door vers medium. Geef de cellen na transductie twee dagen de tijd om het fluorescenteiwit tot expressie te brengen en bepaal vervolgens de fractie getransduceerde cellen via FACS. Bereken de titer in transforming units (TU) per ml, op basis van verdunningen die < 15% transductie opleveren om meervoudige transductie-events te minimaliseren.
    Formule voor titerberekening, vergelijking voor viruskwantificatie, wiskundige analyse in de virologie.

2. Transductie van menselijke doelcellen met de murine retrovirusreceptor Slc7a1

  1. Selecteer een multiplicity of infection (MOI) = 2 om te waarborgen dat de meeste cellen worden getransduceerd. Voor doelcellen die resistent zijn tegen transductie, zoals HDF's, is een hogere MOI vereist; wij verdunnen het virale supernatant slechts 1:2 om transductie van de meerderheid van de cellen te bereiken.
  2. Transduceer de doelcellen overnacht met viraal supernatant verdund in vers kweekmedium met 6 μg/ml PB, wat de transductie verhoogt door de elektrostatische interactie tussen het virus en de doelcel te verbeteren.1 Idealiter dient men een minimaal volume virus te gebruiken, zoals 1 ml voor een 35 mm plaat, omdat diffusie een beperkende factor is voor de transductie-efficiëntie.
  3. Kweek de cellen gedurende ten minste 48 uur na het verwijderen van het virus voordat ze worden getransduceerd met ecotroop virus, om voldoende expressie van de Slc7a1-receptor te waarborgen.
  4. (Optioneel) Indien gewenst is het mogelijk om blasticidine te gebruiken om te selecteren op stabiel getransduceerde cellen die Slc7a1 tot expressie brengen. Er moet vooraf een blasticidine-killcurve worden opgesteld om de laagste effectieve concentratie te bepalen, over het algemeen tussen 2 – 10 μg/ml, die alle niet-getransduceerde doelcellen binnen 7 dagen doodt. Schakel de getransduceerde cellen ongeveer 2 dagen na het verwijderen van het Slc7a1-virus over naar medium dat blasticidine bevat. Kweek de cellen gedurende 7 dagen in medium met blasticidine; op dat moment zullen alle resterende cellen de retrovirusreceptor stabiel tot expressie brengen, waarna ze kunnen worden getransduceerd met ecotroop virus en kunnen worden opgeslagen voor toekomstig gebruik als een stabiele Slc7a1-expressielijn.

3. Titratie van polymeercomplexen om toxiciteit te bepalen

  1. Dag 1. Zaai cellen uit met 5000 cellen/well in een 96-wellplaat, waarbij ten minste triplikaat wells per experimentele groep worden gebruikt. Neem niet-getransduceerde cellen in compleet medium op om een basiswaarde voor gezonde cellen te verkrijgen, evenals monsters bestaande uit cellen in serumvrij medium om groeistop te induceren als controle. Zaai parallel cellen uit in een geschikt formaat (zoals een 24-wellplaat) voor microscopische of FACS-gebaseerde analyse van de transductie-efficiëntie in elke experimentele conditie.
  2. Dag 2. Transduceer cellen in platen die zijn klaargezet voor zowel de MTT- als FACS-analyses met virus dat GFP codeert, bij een MOI van 0,5 om ~40% van de doelcellen te transduceren. Test variërende concentraties van CS/PB (bijv. 50, 100, 200, 400, 600 en 800 mg/ml van elke component), evenals 6 μg/ml PB, om de optimale hoeveelheden te bepalen. Genereer polymeercomplexen zoals beschreven in Deel 4, hieronder.
  3. Dag 3. Verwijder het virusbevattende medium en vervang dit door vers medium. Plaats de platen terug in een bevochtigde incubator.
  4. Dag 5. Analyseer de FACS-plaat om de transductie-efficiëntie bij elke polymeerconcentratie te bepalen.
  5. Dag 6. Verwijder het medium uit alle wells van de MTT-plaat en vervang dit door 100 μl MTT-oplossing (1 mg/ml MTT in compleet medium). Cultiveer gedurende drie uur in een bevochtigde incubator om de MTT te laten reduceren in de mitochondriën van metabool actieve cellen.
  6. Verwijder de MTT-oplossing en vervang deze door 200 ml MTT-oplosmiddel (0,1 N HCl, 0,1% Igepal CA-630 in isopropanol).
  7. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur of totdat al het paarse MTT-formazan-precipitaat is opgelost. Lees de absorbentie af op een microplate-reader bij 570 nm, waarbij de achtergrondmeting bij 690 nm wordt afgetrokken.
  8. Selecteer de optimale polymeerconcentratie die een maximale toename van de transductie oplevert, bepaald via FACS, met een minimaal effect op de metabole activiteit, bepaald via MTT. Voor HDFs hebben we 100 μg/ml CS/PB geselecteerd op basis van de gegevens getoond in de Representatieve Resultaten, hieronder.

4. Ecotrope transductie met polymeercomplexatie

  1. Bereid steriel gefilterde voorraadoplossingen van PB en chondroïtinesulfaat voor in water bij een concentratie van 20 mg/ml. Verdeel deze in aliquoten en bewaar ze bij -20°C.
  2. Pipetteer viraal supernatant in een microcentrifugebuisje en verdun dit met vers kweekmedium tot de gewenste eindconcentratie (bijv. een MOI van 2). Voeg opeenvolgend gelijke volumes PB en chondroïtinesulfaat toe (concentraties bepaald in stap 3 hierboven), waarbij het buisje na elke toevoeging wordt geschud om te mengen. Het virale mengsel wordt onmiddellijk troebel door de vorming van neerslag. Incubeer het virale mengsel 5 minuten bij kamertemperatuur om de vorming van complexen mogelijk te maken.
  3. Verwijder het medium van de receptor-expresserende doelcellen, vervang dit door het virale mengsel en incubeer dit gedurende de nacht bij 37°C, 5% CO2. Was na het verwijderen van het virale mengsel het celloppervlak twee keer met PBS om te helpen bij het verwijderen van virale complexen. Volledige verwijdering is niet noodzakelijk; we hebben geen nadelige effecten op de gezondheid van de cellen waargenomen door residuele polymeercomplexen.

5. Verificatie van de specificiteit van ecotrope transductie

  1. Bij de eerste productie van ecotroop virus is het vanuit veiligheidsoogpunt raadzaam om te verifiëren dat het virus niet in staat is om ongemodificeerde menselijke cellen te transduceren. Transduceer menselijke cellen gedurende de nacht met ecotroop lentivirus in een relatief hoge concentratie (slechts een 1 tot 2-voudige verdunning van het viraal supernatant in vers medium) met 6 μg/ml PB of een geoptimaliseerde CS/PB-concentratie.
  2. Verwijder het virushoudende medium en vervang dit door vers medium. Valideer na 2 dagen incubatie van de cellen de expressie van het transgen via FACS met behulp van fluorescente vectoren en/of via RT-PCR met transgeen-specifieke primers.

6. Representatieve resultaten:

Fig. 1A toont het proces voor de productie van lentivirus, en Fig. 1B toont de transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus, inclusief pre-transductie met de murine retrovirusreceptor Slc7a1. Voor het bepalen van de virustiter gebruiken we een menselijke rhabdomyosarcoom-cellijn die stabiel is getransduceerd met Slc7a1 (Slc-hRMS). Bij het gebruik van fluorescente controlevectoren om de transductie-efficiëntie te monitoren, bereiken we routinematig een transductie-efficiëntie van > 90% van Slc-hRMS met ecotroop virus, zoals weergegeven in Fig. 2A en 2B. Transductiesnelheden van HDFs zijn over het algemeen lager omdat de cellen niet met blasticidine zijn geselecteerd op receptor-expressie (Fig. 2C). Titers van ecotroop lentivirus zijn over het algemeen 10-20% van VSV-pseudotype virus wanneer gemeten op Slc-hRMS (Fig. 2D).

Eén vries-dooi-cyclus vermindert de titer van het ecotrope virus met 16 - 3%, wat gelijk is aan het titerverlies tijdens een enkele vries-dooi-cyclus van VSV-pseudotype virus (p > 0,05). In tegenstelling tot eerdere rapporten,2 observeren wij geen positief effect op de virustiter door flash-freezing in droogijs. In plaats daarvan bereiken we hogere titers na het ontdooien van beide pseudotypes door de buisjes met virus simpelweg in een -80°C vriezer te plaatsen (gegevens niet getoond).

De MTT-viabiliteitsassay maakt een gevoelige detectie van groeistop in doelcellen mogelijk. Transductie met virus plus concentraties CS/PB tot 800 μg/ml heeft geen effect op het metabolisme van HDF (Fig. 3A). Blootstelling aan CS/PB zonder virus heeft eveneens geen toxisch effect op de cellen (gegevens niet getoond). FACS-analyse van HDF's getransduceerd met virus plus verschillende concentraties CS/PB laat een verbetering van de transductie zien in vergelijking met PB alleen (Fig. 3B). De maximale verbetering treedt op bij 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), wat enkele malen lager is dan eerder gerapporteerde waarden.3 Daarom is het belangrijk om de omstandigheden te optimaliseren voor elk specifiek type doelcel.

Complexatie met CS/PB verhoogt de waargenomen titer ongeveer 3-voudig in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0,01). In de praktijk levert dit een groter effect op de transductie-efficiëntie op bij lage virusconcentraties dan bij hogere concentraties (Fig. 4B), wat zeer waarschijnlijk te wijten is aan meervoudig getransduceerde cellen en receptorverzadiging bij hogere virusconcentraties.

Transductie met ecotroop virus is specifiek voor cellen die de muis-retrovirusreceptor tot expressie brengen. Bij transductie van ongewijzigde menselijke cellen met ecotroop virus hebben we geen fluorescentie waargenomen die hoger was dan de niet-getransduceerde achtergrond, ongeacht of PB of CS/PB werd gebruikt, zoals weergegeven in Fig. 5A. Microscopisch gezien vertonen HDF's geen transductie in afwezigheid van de receptor (Fig. 5B), terwijl pre-transductie met de receptor resulteert in fluorescente cellen (Fig. 5C).

Diagram van het lentivirusproductieproces, met weergave van de transductie van 293T-cellen en de stadia van het virale supernatant.
Figuur 1. Schematisch overzicht van (A) het virusproductieproces en (B) transductie van menselijke cellen met een muis retrovirusreceptor, gevolgd door ecotroop lentivirus.

Flowcytometrie-grafieken, analyse van GFP+ celpercentage, fluorescentiemicroscopie, staafdiagram van virusitering.
Figuur 2. Hoogefficiënte transductie van menselijke cellen met ecotroop lentivirus dat GFP codeert. Cellen waren vooraf getransduceerd met de murine retrovirusreceptor Slc7a1. (A) Menselijke rhabdomyosarcoma-cellijn blasticidine-geselecteerd voor Slc7a1 (Slc-hRMS), getransduceerd (blauw) of niet-getransduceerd (roze) met GFP. (B) Fluorescente micrografie van ecotroop-getransduceerde Slc-hRMS (4X). (C) HDF's getransduceerd (blauw) en niet-getransduceerd (roze) met ecotroop GFP-lentivirus; cellen waren twee dagen vóór de ecotroope transductie getransduceerd met Slc7a1. (D) Iter van VSV-G pseudotypeerd en ecotroop lentivirus, gemeten op Slc-hRMS.

Effecten van polymeerconcentratie op GFP-expressie; grafieken van absorbentie, flowcytometrie en GFP%.
Figuur 3. Optimalisatie van chondroïtinesulfaat/polybrene (CS/PB) concentraties in humane dermale fibroblasten. (A) Viabiliteit van HDFs gemeten met een MTT-assay na transductie in de aanwezigheid van alleen PB of met variërende concentraties CS/PB. (B) Verbetering van de transductie-efficiëntie in HDFs door verschillende concentraties CS/PB, gemeten via FACS. (C) Kwantificering van de verbetering van de transductie, waaruit blijkt dat maximale transductie optreedt bij 100 μg/ml CS/PB.

Analyse van gentransductie-efficiëntie versus titer, staafdiagram en spreidingsdiagram, vergelijking van het polybrene-effect.
Figuur 4. Effect van 400 μg/ml CS/PB op de transductie van Slc-hRMS met ectotroop lentivirus. (A) Titerverbetering, en (B) factor van verandering in transductiesnelheid vergeleken met 6 μg/ml polybrene alleen.

Flowcytometrie GFP-intensiteitsgrafiek met fluorescentiemicroscopiebeelden die de verdeling van GFP+ cellen tonen.
Figuur 5. Gebrek aan ecotrope transductie van HDF's bij afwezigheid van de murine retrovirusreceptor Slc7a1. (A) FACS-plot van menselijke BJ-fibroblasten, niet-getransduceerd (roze) of getransduceerd (blauw) met ecotroop GFP-lentivirus, in beide gevallen in afwezigheid van receptor Slc7a1. Menselijke BJ-fibroblasten getransduceerd met ecotroop GFP-lentivirus, zonder (B) en met (C) pre-transductie met receptor Slc7a1 (4X).

Discussie

Recombinant ecotropic gammaretrovirus gebaseerd op Moloney murine leukemia virus (MLV) en zijn receptor mSlc7a1 zijn goed bestudeerd en op grote schaal beschikbaar, die al meer dan 20 jaar transgenen te leveren aan muizen cellen. Ecotropic gammaretrovirus is ook meer recent gebruikt om oncogenen te leveren aan menselijke cellen,. In het kader van cellulaire herprogrammering, het gebruik van mSlc7a1 op generatie van amfotrope virus herbergen menselijke oncogenen te voorkomen is goed ingeburgerd maar 4,5, lentivirus biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van gammaretrovirus in transduceren vuurvaste celpopulaties, 6 inclusief primaire cellen die vaak gewenst zijn doelen voor herprogrammering, omdat de lentivirale pre-integratie complex maakt transductie van niet-delende cellen. 7

Lentivirussen zijn geproduceerd met tientallen verschillende pseudotypes, waaronder MLV, in een poging om virus tropisme, toxiciteit en andere eigenschappen. 8 MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus is gebruikt om muizen cellen, 9 transduceren maar is zelden gebruikt op menselijke cellen te veranderen 10. Daarom het gebruik van de MLV-pseudogetypeerde ecotropic lentivirus te stellen als een veilige, kosteneffectieve en zeer efficiënte voertuig bekend is of vermoed oncogenen, met inbegrip van cellulaire herprogrammering factoren, te leveren aan menselijke cellen.

Het is van cruciaal belang op te merken dat dit protocol niet helemaal de noodzaak om te produceren en te gebruiken pantropic lentivirus te elimineren, maar eerder dit protocol scheidt het oncogen (s) van de pantropic virus, isolerende onderzoekers van potentiële self-inoculatie met kanker-gerelateerde virussen. Het eiwit mSlc7a1 en haar menselijke homoloog hSlc7a1 zijn alom uitgedrukt aminozuur transporteurs zonder bekende tumorgeniciteit of het vermogen om een selectieve groei voordeel op ontvangende cellen, waardoor 11 mSlc7a1 van een relatief laag risico voor opname in amfotrope virus. Deze extra stap kan met name nuttig zijn in laboratoria ontbreken gewijd virus of weefselkweek faciliteiten van het vereiste niveau van bioveiligheid.

In sommige situaties kan het mogelijk zijn om volledig te elimineren van het gebruik van pantropic virus door het transfecteren van de Slc7a1 plasmide direct in doelcellen, maar veel cellen die nuttig zouden zijn doelwit van deze techniek zijn ook ongevoelig zijn voor transfectie. Als alternatief, de mogelijkheid om te isoleren Slc7a1-getransduceerde cellen door blasticidine selectie houdt in dat VSV-G pseudogetypeerde lentivirus kan eenmaal worden gebruikt om een ​​voorraad van receptor-expressie cellen, waarna ecotropic virus routinematig gebruikt kunnen worden om deze cellen transduceren voor velen te genereren experimenten. Onderzoekers moeten altijd volgen hun institutionele veiligheid van richtlijnen voor het werken met een lentivirus, ongeacht de tropisme.

Titers van ecotropic virus bereikt met dit protocol zijn matig lager zijn dan VSV-virus pseudogetypeerde, over het algemeen 10-20% van de pantropic virus titer, in overeenstemming met eerdere studies. Negen Deze titers werden gemeten in menselijke cellen stabiel getransduceerd met Slc7a1, zodat de lagere waargenomen titer voor ecotropic virus kan gedeeltelijk te wijten aan verschillende expressie van de receptor-gen in target cellen. Niettemin, de virale titers bereikt in ons protocol zijn meer dan voldoende voor de meeste toepassingen en leiden tot transductie van de meerderheid van de cellen, in sommige gevallen> 90% van de cellen.

Centrifugatie-gebaseerde technieken worden vaak gebruikt om virale deeltjes concentreren. Echter, centrifugeren vereist verscheidene uren, genereert infectieuze aërosolen kunnen voortbrengen, en kan resulteren in een significant verlies van virale deeltjes. 12 Als een alternatief, complexatie met CS / PB kan worden gebruikt om transductie te verbeteren zonder dat virale tropisme. 3 Deze methode is snel (5 minuten ) en goedkoop ($ 0,03 per 10 ml virus), terwijl ongeveer een verdrievoudiging van de waargenomen titer. Geen speciale uitrusting of merkgebonden reagentia nodig zijn, en zagen we een minimale acute toxiciteit na blootstelling van HDFS aan CS / PB, in overeenstemming met eerder werk in andere cellijnen. 13 Een potentieel nadeel van dit protocol is dat een aantal microscopisch zichtbare polymeer complexen zich te houden aan de cellen voor meerdere dagen in de cultuur. We kunnen niet uitsluiten dat deze complexen, maar niet openlijk toxisch voor de cellen, kan meer subtiele effecten op cellulaire processen.

Hier hebben we beschreven een methode voor het veilig en efficiënt transducerende menselijke cellen met oncogene factoren. Deze aanpak moet worden van groot nut voor onderzoekers bestuderen van oncogenen en stamcelbiologie inclusief iPS cellen.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De financiering voor dit project werd verstrekt door het California Institute voor regeneratieve geneeskunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogus nummer Reacties
pLenti6/UbC/mSlc7a1 Addgene 17224 Murine MLV receptor
pMD2.G Addgene 12259 VSV-G envelop
pCMV-dR8.91 D. Trono lab 14 Verpakking plasmide (equivalent plasmide psPax2 is verkrijgbaar bij Addgene, Cat. Number 12260)
pHCMV-EcoEnv Addgene 15802 Ecotropic envelop
FUGW Addgene 14883 GFP controle plasmide
OptiMEM Invitrogen 31985
Fugene HD Roche 04 709 705 001
Hexadimethrine bromide (polybreen) Sigma-Aldrich H9268
Chondroïtinesulfaat natriumzout van haaienkraakbeen Sigma-Aldrich C4384
Blasticidine S Visser BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M2128
Igepal CA-630 Sigma-Aldrich I3021

Referenties

  1. Davis, H. E., Rosinski, M., Morgan, J. R., Yarmush, M. L. Charged polymers modulate retrovirus transduction via membrane charge neutralization and virus aggregation. Biophys J. 86, 1234-1242 (2004).
  2. Marino, M. P., Luce, M. J., Reiser, J. Small- to large-scale production of lentivirus vectors. Methods Mol Biol. 229, 43-55 (2003).
  3. Landazuri, N., LeDoux, J. M. Complexation of retroviruses with charged polymers enhances gene transfer by increasing the rate that viruses are delivered to cells. J Gene Med. 6, 1304-1319 (2004).
  4. Ohnuki, M., Takahashi, K., Yamanaka, S. Generation and characterization of human induced pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 4, 4A.2-4A.2 (2009).
  5. Hotta, A. EOS lentiviral vector selection system for human induced pluripotent stem cells. Nat Protoc. 4, 1828-1844 (2009).
  6. Reiser, J. Transduction of nondividing cells using pseudotyped defective high-titer HIV type 1 particles. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 15266-15271 (1996).
  7. Cullen, B. R. Journey to the center of the cell. Cell. 105, 697-700 (2001).
  8. Cronin, J., Zhang, X. Y., Reiser, J. Altering the tropism of lentiviral vectors through pseudotyping. Curr Gene Ther. 5, 387-398 (2005).
  9. Schambach, A. Lentiviral vectors pseudotyped with murine ecotropic envelope: increased biosafety and convenience in preclinical research. Exp Hematol. 34, 588-592 (2006).
  10. Koch, P., Siemen, H., Biegler, A., Itskovitz-Eldor, J., Brustle, O. Transduction of human embryonic stem cells by ecotropic retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 34, e120-e120 (2006).
  11. Yoshimoto, T., Yoshimoto, E., Meruelo, D. Molecular cloning and characterization of a novel human gene homologous to the murine ecotropic retroviral receptor. Virology. 185, 10-17 (1991).
  12. Cepko, C. Large-scale preparation and concentration of retrovirus stocks. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.12-Unit 9.12 (2001).
  13. Doux, J. M. L. e, Landazuri, N., Yarmush, M. L., Morgan, J. R. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum Gene Ther. 12, 1611-1621 (2001).
  14. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery. J Virol. 72, 9873-9880 (1998).

Herprints en machtigingen

Tags

Polymeercomplexatiechondro tinesulfaatpolybrenevirale transductieMTT assayfluorescentiemicroscopieFACS analyseverbetering van biosafetyhumane dermale fibroblasten
Transductie van menselijke cellen met Polymer-gecomplexeerd Ecotropic lentivirus voor Enhanced Biosafety
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.