Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Samenvatting

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Samenvatting

Op grond van ontwikkelingen in de next generation sequencing technologie, hebben we toegang tot nieuwe genoomsequenties bijna dagelijks. Het tempo van deze voorschotten aan het versnellen is, met de belofte een grotere diepte en breedte. In het licht van deze buitengewone ontwikkelingen, de behoefte aan snelle, parallel methoden om de functie van een gen te definiëren wordt steeds belangrijker. Collecties van genoom-brede deletiemutanten in gisten en E. coli hebben gediend als werkpaarden voor de functionele karakterisering van gen-functie, maar deze aanpak is niet schaalbaar, de huidige gen-deletie benaderingen vereisen elk van de duizenden genen die een genoom te worden verwijderd en gecontroleerd bestaan. Pas nadat dit werk voltooid is kunnen we nastreven high-throughput fenotypering. In de afgelopen tien jaar heeft ons laboratorium verfijnd een portfolio van concurrerende, geminiaturiseerde, high-throughput genoom-brede analyses die uitgevoerd kunnen worden in parallel. Dit parallellisatie is mogelijk door het opnemen van DNA 'tags', of 'barcodes,' in elke mutant, met de barcode die als een proxy voor de mutatie en men kan de barcode overvloed maatregel mutant fitheid te beoordelen. In deze studie willen we de kloof tussen de DNA-sequentie en de streepjescode mutant collecties te vullen. Om dit te bereiken introduceren we een gecombineerde transposon verstoring-barcoding aanpak die zich opent parallel barcode assays voor nieuw gesequenced, maar slecht gekarakteriseerd microben. Ter illustratie van deze aanpak presenteren we een nieuw Candida albicans streepjescode verstoring van het verzamelen en beschrijven hoe zowel de microarray-gebaseerde en de volgende generatie sequencing-gebaseerde platforms kunnen worden gebruikt voor het verzamelen van 10.000 - 1000000 gen-gen en drug-gen interacties in een enkel experiment.

Protocol

1. Achtergrond informatie

Er zijn verschillende manieren om mutanten die barcode labels dragen genereren. De huidige gouden standaard is de gist KnockOut (YKO) collectie gemaakt door een consortium van laboratoria en voltooid in 2002 ^1. Sinds de oorspronkelijke YKO werd geïntroduceerd, andere gist collecties zijn gegenereerd, in verschillende stam achtergronden, met behulp van over-expressie constructen, en in andere microben zoals E. coli ^2. In parallel, is de inspanning om barcode shRNA bibliotheken te creëren procedure snel, en in feite, veel van de ontwerpprincipes voor deze zoogdieren collecties zijn overgenomen uit gist. Om te demonstreren hoe barcode transposons kan een snelle, breed toepasbare strategie voor het creëren van een systematische mutant collecties, richten we ons op een collectie hebben we onlangs in de mens pathogene schimmel, Candida albicans. Ons werk op Candida was gebaseerd op het succes van de barcode-schermen in S. cerevisiae, en wordt hier gebruikt als een voorbeeld organisme. Het monster protocol, kan met kleine aanpassingen worden gebruikt om een ​​organisme dat kan worden gekweekt in suspensie cultuur scherm. Omdat weinig organismen over de vereiste hoge tarieven van transformatie en efficiënte mitotische recombinatie die nodig is om een perfecte deletiemutanten te maken, dus hebben we een protocol ontwikkeld dat transposon mutagenese gebruikt in vitro mutagenize een genomische DNA-bibliotheek en vervolgens getransformeerd deze barcode genomische fragmenten in Candida albicans ^{3 , 4.} Geïnspireerd door het succes van de originele YKO collectie en zijn rol in de fundamentele ontdekkingen over de aard van gen-netwerken ^5-8, genoom-brede haploinsufficiency ^9, drugs doelwit en het werkingsmechanisme ^10,11, en ​​de wezenlijkheid van alle genen in het genoom ¹² verwachten we verbreding van deze aanpak naar andere microben zal zeer vruchtbaar.

Het protocol hieronder gaat ervan uit dat de gewenste mutant collectie is gemaakt (bijv. YKO of Candida albicans verstoring collectie) en is beschikbaar als afzonderlijk gearchiveerd stammen. Voor een gedetailleerde beschrijving van de stam de bouw te zien ^1,13,14.

2. Combineer individuele mutanten in een pool

1. Laat een week om samengevoegde cel monsters (kan voor onbepaalde tijd worden opgeslagen bij -80 ° C) te genereren.
2. Ontdooi de bevroren glycerol voorraden voor de stammen van belang volledig, maar laat je niet cellen blijven ontdooid voor> 2 uur.
3. Steriliseren een 96-pin goed hulpmiddel, Dompel de pen tool in water om de resterende cellen, gevolgd door twee dips in 70% ethanol baden (bijv. pipetpunt doos deksels), vlam de pen tool en afkoelen gedurende 1 minuut te verwijderen. Zorg ervoor dat de vlam pin gereedschap uit de buurt van de ethanol baden. Het niveau van de ethanol baden hoger mag zijn dan het niveau in het waterbad om te zorgen dat alle carry-over cellen zijn gevlamd en verwijderd. Vervang het water om de 4-6 pinnings.
4. Steek de steriele 96-pin goed gereedschap in een ontdooide 96-well plaat, zacht zwenken en overdracht cellen om een ​​Nunc Omni lade met YPD-agar inclusief de juiste antibioticum. Groeien kolonies tot het bereiken van maximale grootte bij 30 ° C (2-3d). Voor het behoud van platen, vinden we het meest handig om vier platen met 96 putjes te consolideren op een enkele Omni-tray met ~ 384 stammen.
5. Na de kolonies zijn gegroeid, noteer eventuele ontbrekende of traaggroeiende foklijnen en Repin deze op ~ 2X de cel massa als de rest van de stammen.
6. Werken in een microbiologie omgeving (met een vlam en steriele laboratoriumartikelen, overstroming plaat met 5-10 ml media, weken voor 5 min en resuspendeer kolonies met een cel spreader. Giet de vloeistof plus cellen in een 50 ml conische centrifugebuis, en voeg glycerol aan 15% of DMSO tot 7% ​​(vol / vol).
7. Meet de OD ₆₀₀ van het zwembad en aan te passen (door verdunning of centrifugeren) tot een uiteindelijke concentratie van 50 OD ₆₀₀ / ml met media die 15% glycerol of 7% DMSO.
8. Aliquot in 40 ul volumes in PCR-strip buizen en vriezen bij -80 ° C.

3. Experimentele zwembad groei

Deze procedure is beschreven in figuur 1.

1. Dooi zwembad porties (in PCR-buisjes) op ijs. Als u geen robotica, ga dan naar stap 5.
2. Onmiddellijk te verdunnen (gently!) het zwembad in de media met drugs of de staat van de keuze, enten op een OD ₆₀₀ van 0,0625 in een totaal volume van 700 ul in een 48-well plaat. Ten minste een geschikt oplosmiddel controle op de plaat. Voor experimenten die verder gaan dan 5 generaties van groei (zowel wil zeggen meer dan 1), vul aangrenzende putten met media of de staat van keuze, maar geen cellen.
3. Afdichting met een plastic plaat afdichting, als de conditie vereist aërobe groei (bv. niet-fermenteerbare koolstofbronnen), een 21 gauge naald te gebruiken om doorboren van de gaten in het membraan afdichting naar de zijkant van elke well.
4. Groeien in een spectrofotometer, schudden bij 30 ° C met een experimenteel determinantenned schudden regime (bv. schudden 14 min. op de hoogste instelling (of temperatuur-gecontroleerde shaker), lees waterputten, weer schudden). Een deel van de celsuspensie kan worden geoogst door de robot en opgeslagen op een koude plaat op de robot dek op door de gebruiker gedefinieerde generatie tijdstippen, meestal 5, 10, 15 en 20 generaties van groei. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, voor meer informatie contact opnemen met C. Nislow of G. Giaever).
5. Voor het handmatig celgroei, inoculeren een 50 ml cultuur op een start OD ₆₀₀ van de 0.002 in een 250 ml cultuur kolf. Schudden bij 30 ° C bij 250 rpm tot de cellen een definitief OD ₆₀₀ van 2,0 (voor Saccharomyces of Candida) voor ~ 10 generaties van groei. Extra generaties van groei kan worden verkregen door verdunnen cellen bij een OD600 van 2,0 naar 0,02 in een frisse fles.
6. Oogst tenminste ~ 2 OD ₆₀₀ eenheden van de cellen voor elk monster / tijd-punt in de Safe-Lock microcentrifugebuizen.

Let op: Altijd verzamelen van een beginnend cel monster (dat wil zeggen een "T0 tijdstip") naar de eerste stam vertegenwoordiging in elke nieuw gecreëerde pool te beoordelen door het toevoegen van 1-2 OD ₆₀₀ van zwembad direct uit de vriezer aliquots naar een 1,5 ml tube en verwerking, zoals beschreven hieronder.

4. Genomic DNA-extractie, PCR en micro-array hybridisatie of sequencing

1. Zuiver genomisch DNA van ~ 2 OD ₆₀₀ van cellen met de Zymo Research YeaStar kit volgens instructies van de fabrikant (Protocol I bij gebruik van gist DNA), of een andere geschikte methode die specifiek zijn voor het organisme van de rente (standaard fenol / chloroform extractie gevolgd door alcohol neerslag werkt goed voor diverse microben). Als u de YeaStar kit, het DNA in plaats daarvan elueren met 300 pi van 0.1X TE van de 60 ul van 1X TE gespecificeerd in het protocol. Genomisch DNA kan onbeperkt worden bewaard bij -80 ° C.
2. Instellen van twee PCR-reacties voor elk monster, een voor de uptags en ​​een voor de downtags, met de reactieomstandigheden als volgt: 33 pl DDH ₂ O, 6 pl 10X PCR-buffer zonder MgCl _2, 3 ul 50 mM _MgCl2, 1,2 ui 10 mM dNTPs, 1,2 ul 50 uM Omhoog of Omlaag primer mix, 0,6 ul 5 U / pl Taq polymerase, ~ 0,1 pg genomisch DNA in 15 ui. Totaal volume is 60 pl. Thermocycle onder de volgende voorwaarden: 94 ° C 3 min, 30 cycli van 94 ° C 30s, 30s 55 ° C, 72 ° C 30 seconden, dan 72 ° C 3 minuten, en houdt bij 4 ° C. Controleer de resulterende PCR-producten op een gel, een 60 bp product voor zowel PCRs wordt verwacht voor amplicons gebruikt voor hybridisatie en 130bp voor amplicons voor barcode sequencing). De PCR-producten kunnen vervolgens worden opgeslagen bij -80 ° C voor onbepaalde tijd.
3. Voorverwarmen van de hybridisatie oven temperatuur tot 42 ° C en het opzetten van een bad met kokend water en ijs emmer met een ijs-water slurry.
4. Pre-nat de arrays door langzaam te vullen met 120 ul 1X hybridisatiebuffer.
5. Incubeer in het hybridisatiebuffer bij 42 ° C en 20 rpm gedurende 10 minuten.
6. Bereid 90 pi hybridisatie mix per monster, plus een extra als een buffer, als volgt: 75 pl 2X hybridisatiebuffer, 0,5 ul B213 controle-oligonucleotide (0,2 fm / ul), 12 pl gemengde oligonucleotiden (12:05 / ul), 3 pl 50X Denhardt's oplossing) in lock-top 0,5 ml buizen.
7. Voeg 30 il uptag PCR en 30 ul PCR downtag tot 120 ul hybridisatie mix voor een totaal volume van 150 ul. Kook 2 minuten en zet in ijs-water gedurende minstens 2 minuten. Kort voorafgaand draaien de buizen te gebruiken.
8. Verwijder de pre-hybridisatie buffer van de arrays en voeg 90 ul hybridisatie / PCR-mix. Om te voorkomen dat verdamping, bedek de array afdichtingen met een Tough-Spot. Hybridiseren voor 16 uur bij 42 ° C, 20 rpm.
9. Vers voor te bereiden 600 pi biotine etikettering mix per monster plus een extra, als volgt: 180 ul 20X SSPE, 12 ul 50X Denhardt's, 6 pl 1% Tween 20 (vol / vol), 1 ui 1 mg / ml streptavidine-phycoerythrin, 401 pl DDH ₂ O. Bewaar alle streptavidine-PE monsters in het donker. Aliquot 600 pi in 2 ml buizen. Verwijder Tough-Spots van chips.
10. Verwijder langzaam hybridisatie mix uit de arrays met een pipet en vul microarrays met 120 ul Was A. Prime de Affymetrix vloeistofcomponenten station.
11. Was de arrays met behulp van een Affymetrix vloeistofcomponenten station volgens de instructies van de fabrikant, met behulp van "Gene-Flex_Sv3_450" protocol met de volgende wijzigingen: 1 extra stap met Wash A (1 cyclus, 2 mixen) voor de kleuring, Wash B temperatuur 42 ° C in plaats van 40 ° C, vlek bij 42 ° C in plaats van 25 ° C. Het is ook mogelijk om de post hybridisatie te wassen, de biotine kleuring, en de post vlekken wassen handmatig in te voeren (zie p. 396 in referentie 15). Na vloeistofcomponenten operaties, voert u het vloeistofcomponenten station "SHUTDOWN_450" protocol.
12. Na het wassen, controleren of er geen luchtbellen aanwezig zijn. Indien nodig voeg langzaam 90 pl Was A en pipet totdat de luchtbellen verdwijnen. Als er merken of smudges de array oppervlak, het reinigen van de glazen venster met isopropanol en een niet-pluizende tissue. Van toepassing zijn verse Tough-Spots op de pakkingen / septa en plaats van de arrays in de scanner.
13. Scannen in een Affymetrix GeneArray scanner op een emissie golflengte van 560 nm.

5. Array analyse (zie figuur 2 voor de verkregen een voorbeeld van het gebruik van de Candida albicans verstoring collectie)

1. Uitschieter maskeren: Omdat de Affymetrix TAG4 array bevat vijf herhalingen van elke barcode te vullen verspreid willekeurig elke barcode sonde die afwijkt van de duplo's kunnen worden gemaskeerd en weggegooid. Om dit te doen, voor elke array functie die lijkt op een uitschieter op basis van het signaal worden vergeleken met de 4 andere replica van deze functie, onze software onderzoekt eerst de vijf kenmerken die de verdachte uitschieter omringen, het produceren van een matrix van 25 functies met de verdachte functie in het centrum. Als> 13/25 probes in deze regio van elk van hun individuele hun bijgesneden repliceren gemiddelde (het gemiddelde van de middelste drie duplo, met uitzondering van de hoogste en laagste repliceert) verschillen met meer dan 10%, wordt deze sonde dan verwijderd uit verdere analyse. Omdat dergelijke uitschieters zijn meestal het gevolg van post-hybridisatie wassen inconsistenties, we uitbreiden of "pad" van de regio waarin verdachte probes. Pad dergelijke sondes door alle sondes binnen een straal van 5-probe, zoals gedefinieerd door ((x _{1-x 2)} ² + _(y-1 y ₂₎ ^{2) ½} <6 waarbij x _1, x _2, y _1, en y ₂ zijn de x-en y-coördinaten voor de twee functies. Tot slot, gooi kenmerken waarvoor standaarddeviatie (inbegrepen in de. Cel-bestand voor Affymetrix arrays) van functie pixels / gemiddelde functie pixels. Na het verwijderen van uitschieters, het gemiddelde van de intensiteit van waarden voor alle overige herhalingen.
2. Het verwijderen van onbruikbare tags: Tags met een lage intensiteit waarden geven van slechte kwaliteit van de resultaten en moet worden verwijderd. Een definitieve uitsluiting cutoff voor deze lage intensiteit sondes kunnen als volgt worden berekend:
   1. Voor elke behandeling-control paar arrays, berekenen log ₂ ((i _{c-b g)} / (i _{t-b g))} voor elke tag, waarbij i _c is de controle-intensiteit, i _t is de intensiteit van de behandeling, en b _g is de gemiddelde intensiteit van de niet-toegewezen tag sondes.
   2. Koppel de uptag en downtag ratio's door stam en voor elke tag-paar, de minimale intensiteit van de twee tags te nemen in de twee steekproeven. Sorteer de verhouding tussen paren van dit minimum intensiteit.
   3. Gebruik een schuifraam grootte van 50 op de gerangschikte verhouding tussen paren, het berekenen van de correlatie van uptag en downtag verhouding tussen paren in het venster. Bereken ook het gemiddelde van de minimum intensiteiten berekend in de vorige stap.
   4. Schuif het venster met 25 paren, en herhaal de vorige stap totdat alle paren zijn gekruist.
   5. Plot van de gemiddelde minimum intensiteit ten opzichte van de uptag-downtag correlatie voor alle ramen.
   6. Kies tenslotte een intensiteit drempel; over het algemeen gebruiken we de intensiteit van de waarde waar de correlatie het eerst boven de 80% van zijn maximale niveau. Vlag en te verwijderen uit de verdere analyse geen labels onder deze cutoff.
3. Verzadiging correctie: Omdat elke functie op de barcode microarray kan verzadigd raken, het signaal op de TAG4 array is niet lineair gerelateerd aan tag concentratie. Om te corrigeren voor deze verzadiging volgen het protocol zoals beschreven in referentie ^16.
4. Array normalisatie: Voor elke array, afzonderlijk normaliseren van de uptags en downtags. Om kwantiel normaliseren, rang van de waarden die zijn verkregen van elk array voor uptags en downtags in volgorde van toenemende intensiteit. Te betekenen normaliseren voor elke set van uptags en downtags, delen door het gemiddelde. Het gemiddelde normalisering van alle arrays is een tweede stap na het transformeren van de ruwe data om de gemiddelde van elk array.
5. Berekening van de gevoeligheid van scores voor de controle-behandeling vergelijkingen: Om in te loggen _twee ratio's als een metrische van gevoeligheid te gebruiken: Voor elke stam, bereken log ₂ ((μ _{c-b g)} / (μ _{t-b g)),} waarin μ _c is de gemiddelde intensiteit voor de controle monsters, μ _t is de gemiddelde intensiteit voor de behandeling monsters, en b _g is de gemiddelde intensiteit van de niet-toegewezen sondes. Stammen met een positieve log ₂ verhouding zijn gevoelig voor de behandeling, en die die resistent zijn tegen negatieve log ₂ ratio's.

6. Het beoordelen van de geschiktheid van barcode giststammen door sequencing

1. Isoleer DNA uit het verwijderen zwembaden zoals beschreven voor microarrays.
2. Amplify elke 20-mer uptag barcode met composiet-primers uit de sequenties van de gemeenschappelijke barcode primers en de sequenties die nodig zijn voor hybridisatie met de Illumina doorstroomcel (zie tabel van de Illumina primers en figuur 3 voor een schema van de amplicon). Dezeprimers gebruikt kan worden ontzout zonder extra zuivering. PCR is uitgevoerd in 100μL, met behulp van Invitrogen Platinum PCR Supermix (cat. nr. 11306-016) met de volgende voorwaarden: 95 ° C / 3 min; 25 cycli van 94 ° C/30 sec, 55 ° C/30 sec, 68 ° C/30 sec, gevolgd door 68 ° C/10 min.
3. Zuiveren het PCR-product (~ 130bp) met Qiagen MinElute 96 UF PCR Purification Kit (cat. nr. 28.051).
4. Na de PCR zuivering, kwantificeren DNA met de Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (Cat No Q32853). Vertrouw niet op 260/280 lezingen!
5. Normaliseren DNA concentratie 10μg/ml en zwembad gelijke volumes van genormaliseerde DNA.
6. Apart gebundeld DNA op een 12% polyacrylamide TBE gel voor 3-4 uur afhankelijk van de gebruikte spanning.
7. Vlek gels met ethidiumbromide (SYBR Green moet zo goed werken) gedurende 30 minuten.
8. Zoek de band van de rente op een lange golf UV lichtbak (het dragen van het gezicht), knip het uit en haalde het DNA met behulp van de crush en genieten methode ¹⁷ gevolgd door ethanolprecipitatie.
9. Controleer of de juiste maat DNA (130bp) is geïsoleerd en dat primers zijn verwijderd met behulp van de Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA-kit (Cat No 5067 tot 4.626).
10. Voorbeeld sequencing:
    1. Illumina GAIIx platform:
       1. Genereer clusters op een single-Lees doorstroomcel met behulp van de CBOT en Single-Read Cluster Generation Kit (Cat No GD-300-1001). Voor Read 1, UP-en DOWN-tag aangepast sequencing primers zijn samengevoegd op een 100um voorraad concentratie en toegevoegd aan een strip-buis (0.6μL van elk 100um sequencing primer in 120 ul HT1). Recept SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 wordt gebruikt om de R1 clusters te genereren.
       2. Sequencing van de Genome Analyzer IIx. Na 18 sequencing cycli, is het gepaarde-end module gebruikt om de gesynthetiseerde eerste onderdeel strip en de doorstroomcel rehybridize met behulp van de Illumina R1 (hieronder). Clusters worden geregenereerd en de sequentie ervan gedurende 5 cycli van de index-tag vast te leggen.
11. De Index tag volgorde wordt gebruikt om bin sequenties in experimentele bakken.
12. Binnen elke experimentele bak, zijn de gist barcode sequenties geteld op een totaal aantal punten te geven voor elke barcode.
13. Tellingen zijn kwantiel genormaliseerd zodat elk experiment heeft dezelfde tellen distributie. Naar analogie met barcode microarray experimenten fitness, fitness defect ratio's voor elke stam worden berekend en uitgedrukt als de log _twee verhouding (controle / behandeling). Positieve fitness defect scores betekenen een daling van de stam overvloed tijdens de behandeling met geneesmiddelen en suggereren dat de wild-type versie van het gen verwijderd in die stam is vereist voor weerstand tegen die drug of remmer.

Let op: Gezien Bar-seq als een alternatief voor de reeks hybridisatie. Met de kosten van high-throughput sequencing af, met behulp van high-throughput sequencing als een uitlezing van tag overvloed wordt steeds haalbaar is en in veel gevallen, is meer kosteneffectief ^18. Op deze manier is het geamplificeerde PCR-product direct gemeten als 'telt' in plaats van als signaal intensiteit als gehybridiseerd aan een array. Dit voorkomt valse negatieven en positieven die voortvloeien uit tag kruisbesmetting, verzadiging, of problemen die voortvloeien uit een zeer hoge of zeer lage signaal intensiteit. Bovendien kunnen meerdere experimenten voorafgaand worden gecombineerd om sequencing door de toevoeging van een 4-8 base DNA-index ^19. Omdat de gist barcodes zijn 20 bp, een enkel, 2-step lezen van 26-28 bases vangt zowel de multiplex-index en een unieke barcode, waardoor extreme 100 + multiplexing. Op het moment van dit schrijven, Bar-seq biedt een kostenvoordeel ten opzichte van Bar-code microarrays, en bovendien, Bar-seq is inherent flexibel zodanig dat als het aantal gelezen / run toeneemt, het niveau van de multiplexing kan oplopen tot een verdere daling kosten . Verschillende "mid-capaciteit" sequencers van alle grote fabrikanten platform zal verder democratiseren Bar-seq, met sequencing waarschijnlijk het uitlezen van de keuze te worden.

Dit protocol is ook gevalideerd op de Illumina HiSeq2000.

Een uitstekende demonstratie van het gebruik van Bar-seq om een fundamentele biologische vraag in Saccharomyces cerevisiae groei controle adres wordt gepresenteerd in een recente studie van Gresham et al.. ^{20 personen} die schets een aantal belangrijke experimentele opzet en interpretatie richtlijnen.

7. Validatie van gepoolde screening gegevens

De resultaten van een functional genomics scherm moet worden geverifieerd met behulp van de individuele stammen in geïsoleerde cultuur. Omdat elk experiment verschillen in termen van het aantal gevoelige stammen, het selecteren van het aantal kandidaat-stammen te bevestigen is enigszins willekeurig. Als een gids, de rangschikking van de meest gevoelige stammen van het log _twee ratio of z-score en het testen van de top 25-50% van de kandidaten (die meestal vertaald tot 2-3 standaard deAfwijkingen van het gemiddelde van alle stammen in het zwembad) is een goede balans tussen kosten en baten. Individuele bevestigingen kan worden uitgevoerd in een fles, maar we het uitvoeren van deze tests voor vijf generaties van de groei in platen met 96 putjes met behulp van een beginnend inoculum van 0,06 OD ₆₀₀ in 100 ul van media in een trillende spectrofotometer, metingen om de 15 minuten (zie figuur 4) .

8. Representatieve resultaten

Zodra een genoom-brede scherm is voltooid en de arrays zijn genormaliseerd en het gedrag van elke stam in vergelijking met een controle behandeling (bijvoorbeeld door het vergelijken van microarray intensiteiten of sequencing tellingen / stam) de gegevens zijn het meest gemakkelijk gemanipuleerd in een Excel-bestand met de genen volgorde van de log2 verhoudingen van controle / experiment. Op deze manier, hoe groter de negatieve log2 ratio, des te meer gevoelig dat bepaalde stam is om de test staat. Deze Excel-bestanden kunnen worden uitgezet in een verscheidenheid van grafische software pakketten. We vinden het eenvoudigste tot de log2 ratio's op de Y-as en het gen of de ORF namen op de X-as plot. In het voorbeeld getoond in Figuur 2a, is zo'n een perceel van clotrimazol behandeling (een bekende anti-schimmelmiddel) getoond. Alle spanning die beduidend gevoelig zijn voor behandeling met een log2 verhouding van 2 zijn gemarkeerd in het rood, en we zouden in het algemeen veel van dergelijke stammen te controleren in de individuele groei testen van elke mutant in de aanwezigheid van dezelfde concentratie van de drug. In dit voorbeeld zijn vier stammen gemarkeerd, NCP1, ERG2 en 2 onafhankelijke allelen van ERG11, de bekende eiwit doelstelling van clotrimazol. Elk van deze vier genen is direct betrokken bij de biosynthese van ergosterol, het gist equivalent van cholesterol. Bijvoorbeeld, NCP1 codeert voor een NADP-cytochroom P450 reductase dat betrokken is bij de biosynthese van ergosterol en die is gekoppeld en coördinerend geregeld met ERG11. Dit voorbeeld benadrukt het feit dat de bekende drug target (ERG11) is dat in deze onpartijdige scherm, evenals verschillende andere belangrijke onderdelen van het doel weg. Tot slot, een aantal van de geselecteerde genen in het rood te vertegenwoordigen genen die betrokken kunnen zijn bij de biosynthese van ergosterol of in verschillende biologische processen. Zoals hierboven vermeld, moet elke stam gedetecteerd als gevoelig in een samengevoegde scherm worden gecontroleerd als de gevoeligheid in de individuele groei test. In het voorbeeld in figuur 2b, zijn vier stammen bevestigd gevoelig te zijn voor clotrimazol op basis van hun verminderde groei ten opzichte van de wild-type stam, BWP17. Deze individuele groeicurven benadrukken een belangrijk kenmerk van een dergelijke samengevoegde gen-drug-schermen, dat is de absolute rang van een bepaalde stam niet noodzakelijk overeen met de exacte hoogte van de gevoeligheid. Bovendien ook figuur 2b van de waarde van het hebben van meerdere allelen voor elk gen, in dit geval aangetoond, hebben de twee ERG11 verstoring mutanten enigszins verschillende gevoeligheden. Correleren de aard van deze storingen met de mate van gevoeligheid kan zorgen voor extra inzicht geven in de drugs werkingsmechanisme.

Figuur 1. Workflow voor het gepoolde groei assay en barcode detectie. Culturen zijn geënt met ontdooid monsters van samengevoegde cellen (stap 1), en vervolgens gekweekt voor het gewenste aantal generaties (stap 2) hetzij robot (optie A) of handmatig (Optie B). Cellen worden geoogst door centrifugeren (stap 3) en genomische DNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de geoogste cellen (stap 4), zijn uptags en downtags onafhankelijk van elkaar versterkt (stap 5), en gehybridiseerd op een array (stap 6a of opeenvolgende direct stap 6b).

Figuur 2. Sample gegevens die op bepaalde punten van het protocol. (A) Sample gegevens van screening resultaten (aangepast van ^13). Het zwembad van gelabelde mutanten werd geteeld voor 20 generaties in de aanwezigheid van clotrimazol en DMSO (controle). Log ₂ ratio (controle-intensiteit / intensiteit van de behandeling) werd berekend en uitgezet als functie van de genen. Zeer gevoelige stammen (rood) inclusief de bekende doelstelling van clotrimazol, ERG11p. Merk op dat deze test vaak andere gevoelige mutanten onthult in aanvulling op de werkelijke de verbinding van de doelgroep. Over het algemeen zijn deze mutanten zijn die welke synthetisch handelen met het doel, die deel uitmaken van een algemene stress / respons op de behandeling, of valse positieven die niet te bevestigen. (B) Voorbeeld van de bevestiging gegevens (aangepast van ^13). De resultaten van de samengevoegde groei testen kunnen worden gevalideerd door het kweken van de stam in de individuele cultuur en vergeleken met wild-type groei (zwart).

Figuur 3. Opbouw van het amplicon geproduceerd uit gepoold barcode assays voor microarray hybridisatie of Barcode sequencing. De amplicon geproduceerd voor iedere mutant in de collectie bevat homologie met het genoom voor de integratie (blauwe gebieden label ATG en TAA), unieke barcodes (met het label AG en aangegeven door een zwarte streep). Voor microarray hybridisatie, zijn de blauwe gemeenschappelijke primers gebruikt om een ​​60bp probe versterken voor microarray hybridisatie. Voor de barcode sequencing, worden uitgebreid primers gebruikt in de PCR-reactie, bestaande uit sequenties die coderen voor de Illumina adapter (rode balk), en de index van 6bases cross-luiken) en de blauwe gemeenschappelijke primer voor de stroomopwaartse primer, en hetzelfde composiet primer (minus van de zes basis-index) voor de tweede primer.

Figuur 4. Individuele groei assays voor 1) prescreening verbindingen tegen wild-type gist naar een geschikte dosis voor genoom-brede screening en 2 te bepalen) bevestigt zo de resultaten van het gehele genoom schermen. (A) Een 96 goed vlakke bodemplaat is gevuld met 100 ul van celsuspensie op een OD van 0.062. Elk goed kan bevatten dezelfde stam (voor de dosis-bepaling) of andere stam en drug combinaties (voor bevestiging assays). 2 pi van de verbinding (meestal opgelost in DMSO) wordt toegevoegd en de cellen worden gekweekt met constante schudden gedurende 16-20 uur bij 30 ° C. De uiteindelijke concentratie van DMSO mag niet meer dan 2%. In dit voorbeeld, in elk putje van de plaat de groeicurve is uitgezet in zwart tegen een perceel van de controle-groeicurve in het rood. (B) Hogere resolutie afbeelding van een aantal prescreens verkregen met een voorbeeld drug overlay op de top van elkaar. In deze titratie serie, is een IC _10-15 verkregen met de paarse dosis en passend zou zijn voor verwijdering profiling (HIP HOP en). Als gevolg van de niet-lineariteit bij hogere optische dichtheden, moet Tecan (of een soortgelijke plaat reader) ODS worden gekalibreerd met behulp van die verkregen met een "traditionele" 1mm path-lengte cuvet.

Discussie

Hier hebben we aangegeven een protocol dat, met een bescheiden wijziging, gemakkelijk kan worden aangepast aan een breed scala van bestaande collecties van de barcode mutant verzamelingen van verschillende micro-organismen om gecodeerde mutant collecties aan te maken. We benadrukken dat terwijl we hebben gemeld een protocol over de gelabelde transposon mutagenese voor de pathogene gist C. albicans, een zeer gelijkaardig protocol kan worden aangepast aan een breed scala van eencellige schimmels. Gewijzigd, dit protocol werkt goed in bacteriën ^13, en momenteel collecties voor een aantal extra schimmel-en bacteriële genoom van zijn in aanbouw. Op dit moment is deze test biedt de enige uitgebreide, genoom-brede onpartijdige scherm voor gen-kleine molecule interacties. Een bijzonder aantrekkelijke eigenschap van de test is dat er geen voorkennis van het gen of kleine molecule is vereist. Despite de omvang en kracht van deze testen, is hun overdraagbaarheid naar andere laboratoria werden enigszins gehinderd door de investering en de informatica-instrumenten voor de analyse van de resultaten. Met de goedkeuring van een volgende generatie opeenvolging uitlezing in combinatie met krachtige tools voor analyse, verwachten we de goedkeuring ervan te verhogen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Antibiotica	Verkoper en catalogusnummers
Carbenicilline	Sigma, part # C1613
Kanamycine	Sigma, part # K1876
spectinomycine	Sigma, part # S0692
Chlooramfenicol	Sigma, part # C0378
DNA Clean-up en concentratie kits
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen, onderdeel # 27106
HiSpeed ​​Plasmid Maxi Kit	Qiagen, onderdeel # 12663
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen, onderdeel # 28106
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen, onderdeel # 28704
PCR en electroforese reagentia
Taq DNA-polymerase (Mg-vrij) Buffer	New England Biolabs, part # M0320L
Deoxynucleotide oplossing te mengen	New England Biolabs, part # N0447L
25 mM MgCl 2	Sigma, part # 63036
Agarose, laden kleurstof, en nucleïnezuur vlek die geschikt zijn voor gel-elektroforese	Verschillende
10X TAE buffer	Sigma, part # T8280
1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen, part # 10787026
YPD bouillon
10 g gistextract	Sigma, part # Y1625
20 g Bacto pepton	BD Biosciences, part # 211677
20 g dextrose	Sigma, part # D9434
Labware
Meerkanaalspipetten (1000, 200, en 20 pi)	Verschillende
Wegwerp pipetteren reservoirs	Verschillende
15 en 50 ml centrifugebuizen	Verschillende
96 - en 384-Well Deep Well Platen	Axygen Scientific, part # P-2 ml-SQ-CS & P-384240SQCS
96-well-en 384-wells PCR-platen en afdichting film	Verschillende
Plaat roller voor het afdichten van multi-well platen	Sigma, part # R1275
30 ° C en 37 ° C schudden incubators voor het kweken van bacteriën en gist op platen en in tubes	Verschillende
In vitro transposon mutagenese
EZ-Tn5 transposase	Epicentre Biotechnologie, part # TNP92110
High-throughput transformatie
Seqprep 96 HT Plasmid Prep Kit	Edge Biosystems, onderdeel # 84359
polyethyleenglycol, moleculair gewicht 3350	Verschillende
lithium-acetaat	Sigma, part # 517992
6-well platen, steriel	Corning, part # 3335
50 mg / ml uridine	Sigma, part # U3750
100X Tris-EDTA-buffer-oplossing	Sigma, part # T9285
1X TE/0.1M LiOAc	Verschillende
zalm testis DNA	Sigma, part # 1626
Groei van de barcode collecties
48-wells-platen, als de groei culturen in platen	Greiner, part # M9437
Zelfklevende plaat afdichtingen	ABgene, part # AB-0580
200 ml cultuur flessen	Verschillende
Spectrofotometer waarmee absorptie	Verschillende
Temperatuur-gecontroleerde shaker voor 250 ml flesjes of schudden spectrofotometer	Verschillende
Safe-Lock microcentrifugebuis, 2 mL	Eppendorf, part # 0030 120.094
Hybridisatie apparatuur
Hybridisatie Oven 640	Affymetrix, part # 800138
GeneChip fluïde Station 450	Affymetrix, part # 00-0079
GeneArray Scanner 3000	Affymetrix, part # 00-0212
Bad met kokend water met drijvende rek	Verschillende
Hybridisatie verbruiksartikelen
Genflex Tag 16K Array v2	Affymetrix, part # 511331
Denhardt's Solution, 50x concentreren	Sigma, part # D2532
Streptavidine, R-phycoerythrin conjugaat (SAPE)	Invitrogen, part # S866
Safe-Lock microcentrifugebuis, 0,5 ml	Eppendorf, part # 0030 123.301
Teeny Tough-Spots	Diversified Biotech, part # LTTM-1000
0,5 M EDTA	BioRad, part # 161-0729
10% Tween	Sigma, part # T2700
MES vrij zuur monohydraat	Sigma, part # M5287
MES natriumzout	Sigma, part # M5057
5 M NaCl	Sigma, part # 71386
20X SSPE	Sigma, part # S2015
Moleculaire biologie kwaliteit water	Sigma, part # W4502
Hybridisatie Primers	Verschillende leveranciers (standaard ontzouten)
Uptag	5 'GATGTCCACGAGGTCTCT 3'
Buptagkanmx4	5 'biotine-GTCGACCTGCAGCGTACG 3'
Dntag	5 'CGGTGTCGGTCTCGTAG 3'
Bdntagkanmx4	5 'biotine-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3'
B213	5 'biotine-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3'
Uptagkanmx	5 'GTCGACCTGCAGCGTACG 3'
Dntagkanmx	5'GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 '
Uptagcomp	5'AGAGACCTCGTGGACATC 3 '
Dntagcomp	5'CTACGAGACCGACACCG 3 '
Upkancomp	5'CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 '
Dnkancomp	5'CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 '
Sequencing Primers: Illumina Platform	Diverse leveranciers
UpTag Forward (100um)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3'
UpTag Reverse (100um)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3'
DownTag Forward (100um)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA CTT GCT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3'
DownTag Reverse (100um)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T NNNNN CGG TGT CGG TCT CGT AG 3 `
Lees een UP-tag seq primer (100um)	5 'GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3'
Lees een DOWN-tag seq primer (100um)	5 'CGG TGT CGG TCT CGT AG 3'
Lees 2 Index Sequencing primer (standaard Illumina R1 primer) (100um)	5 'AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CCG CTT ATC T 3'
Extra Sequencing Reagentia / Equipment
Qiagen MinElute 96 UF PCR zuivering Kit	Qiagen, onderdeel # 29051
Vacuümpomp	Elke leverancier
Macherey-Nagel Vacuum Manifold	Macherey-Nagel, een deel # 740 681
Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen, part # Q32853
Invitrogen Qubit assay buizen	Invitrogen, part # Q32856
40% acrylamide plus 1% N, N'-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1	Bio Rad, part # 161-0148
Tris Base	Sigma, part # T1503-1KG
Boorzuur	Sigma, part # B6768-500G
0,5 M EDTA, pH 8,0	Teknova, part # E0306
Ammoniumpersulfaat	Sigma, part # A3678-25G
TEMED	Bioshop, part # TEM001.25
Ethidiumbromide oplossing	Bioshop, part # ETB444.10
0,5 M Ammoniumacetaat	Teknova, part # A2000
10 mM magnesiumacetaat tetrahydraat	Sigma, part # M0631-100G
1 mM EDTA, pH 8,0	Zie 0,5 M EDTA, pH 8,0
Ethanol	Verschillende
Natriumacetaat, pH 5,2	Teknova, part # S0297
Snelheid vacuum	Verschillende
Single-Lees Cluster Generation Kit	Illumina, part # GD-300-1001
36c Sequencing Kit v4	Illumina, part # FC-104-4002

10X TBE recept

Bedragen	Reagentia
108 gram	Tris Base
55 gram	Boorzuur
40ml	0,5 M EDTA (pH 8,0)
Voeg dH 2 O tot 1L markeren

12% polyacrylamide gel recept

Volumes	Reagentia
5,8 ml	40% acrylamide plus 1% N, N'-methyleen-bis-acrylamide, 37.5:1
12 ml	dH 2 O
2 ml	10X TBE
140 ul	10% ammoniumpersulfaat
Totaal volume: 20ml

Uptag primer mix:

Resuspendeer Uptag en Buptagkanmx4 elk in DDH ₂ O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C.

Downtag primer mix:

Resuspendeer Dntag en Bdntagkanmx4 elk in DDH ₂ O bij 100 uM, meng in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke concentratie van 50 uM elk. Bewaren bij -20 ° C.

Gemengde oligonucleotiden:

Resuspendeer elk van de volgende acht oligo (standaard ontzout) in DDH ₂ O bij 100 uM:
Uptag, Dntag, Uptagkanmx, Dntagkanmx, Uptagcomp, Dntagcomp, Upkancomp, Dnkancomp.
Meng een gelijk volume van de acht oligonucleotiden voor een uiteindelijke concentratie van 12,5 uM elk.

12X MES voorraad:

Voor 10 ml en los op 0,7 g MES vrije zuur monohydraat en 1,93 g MES natriumzout in 8 ml moleculaire biologie kwaliteit water. Na het mengen goed, controleer de pH en pas als dat nodig is om een ​​pH 6,5-6,7. Voeg water toe tot een totaal volume van 10 ml. Filter steriliseren en bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht (bv, wikkel de buis in folie). Vervangen als oplossing wordt zichtbaar geel of na 6 maanden.

2X hybridisatiebuffer:

Voor 50 ml, meng 8,3 ml van 12X MES voorraad (vanaf 2.9.14), 17,7 ml 5 M NaCl, 4,0 ml van 0,5 M EDTA, 0,1 ml 10% Tween 20 (vol / vol), en 19,9 ml gefilterd DDH ₂ O. Filter steriliseren.

Was A: Meng 300 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 699 ml DDH ₂ O. Filter steriliseren.
Was B: Mix 150 ml 20X SSPE, 1 mL 10% Tween (vol / vol), 849 ml DDH ₂ O. Filter steriliseren.

Barcode sequencing primers

In UP-tag primer sequenties van de 5 'staart (vet) zijn Illumina specifieke adapter sequenties opgenomen in de F-en R-primer. De variabele sequentie (cursief) staat voor de 5-mer indexering tag gebruikt in de multiplexen / index read-out. De drie 'staart (onderstreept) vertegenwoordigt de gemeenschappelijke primer aan weerszijden van de uptag barcode en is nodig om de gist barcodes te versterken.

In DOWN-tag primer sequenties van de 5 'staart is identiek aan 5' staart van UP-tag primers (Illumina specifieke volgorde), maar de drie 'staart (onderstreept) wordt vervangen door de gemeenschappelijke primers die worden gebruikt om het versterken DOWN- tag barcodes.