Methodenartikel

Een In Vitro Systeem om Tumor latentie en de overstap naar metastatische groei Study

15.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/2914

⸱

11 augustus 2011

 , 
1Department of Biology, University of Haifa, 2Transgenic Oncogenesis and Genomics Section, Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

Een aangepaste 3-D in vitro systeem wordt gepresenteerd waarin de groei-eigenschappen van verschillende tumor cellijnen in gereconstitueerde basaalmembraan correleren met de slapende of proliferatieve het gedrag van de tumorcellen in een gemetastaseerd tweede locatie In vivo.

Samenvatting

Recidief van borstkanker volgt vaak een lange latente periode waarin er geen tekenen zijn van kanker, en metastasen kunnen niet klinisch zichtbaar worden pas vele jaren na het verwijderen van de primaire tumor en adjuvante therapie. Een waarschijnlijke verklaring van dit fenomeen is dat tumorcellen hebben metastasen gezaaid, zijn resistent tegen conventionele therapieën, en die slapend blijven voor lange tijd 1-4.

Het bestaan ​​van slapende kankercellen op secundaire sites is eerder beschreven als latente eenzame cellen die prolifereren noch noch ondergaan apoptose 5-7. Bovendien heeft deze eenzame cellen is aangetoond dat vanuit de primaire tumor te verspreiden in een vroeg stadium van de ziekte progressie 8-10 en groei gearresteerd in de patiënt beenmerg, bloed en de lymfeklieren 1,4,11 wonen. Daarom, begrijpen mechanismen die slaaptoestand of de overstap naar een proliferatieve toestand te reguleren is van cruciaal belang voor het ontdekken van nieuwe targets en interventies om terugkeer van de ziekte te voorkomen. Echter, het ontrafelen van de mechanismen tot regeling van de overgang van tumor slaap tot metastatische groei werd belemmerd door het gebrek aan beschikbare modelsystemen.

in vivo en ex vivo model systemen om metastatische progressie van de tumor cellen te bestuderen zijn eerder 1,12-14 beschreven. Maar deze model-systemen die niet in real time en in een high throughput manier mechanistische inzichten in wat leidt tot de opkomst van eenzame slapende tumorcellen te prolifereren als gemetastaseerde ziekte. We hebben recentelijk ontwikkelde een 3D in vitro systeem voor het model van de in vivo groei eigenschappen van cellen die ofwel sluimerend (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) of proliferatieve (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatische gedrag vertonen in vivo. Wij hebben aangetoond dat tumorcellen die ruststadia vertonen in vivo in een gemetastaseerd locatie rust blijven wanneer gekweekt in een drie-dimensionale (3D) basaal membraan extract (BME), terwijl de cellen zeer uitgezaaide in vivo gemakkelijk vermenigvuldigen in de 3D-cultuur na variabel, maar relatief kort periodes van rust. Belangrijk is dat door gebruik te maken van de 3D ​​in vitro model systeem hebben we laten zien voor de eerste keer dat de ECM samenstelling een belangrijke rol in het reguleren van de vraag of slapende tumorcellen zal overschakelen naar een proliferatieve staat en hebben dit bevestigd in in vivo studies 15-17 speelt. Vandaar dat het model systeem beschreven in dit rapport geeft een in vitro methode om het model tumor latentie en de studie van de overgang naar proliferatieve groei veroorzaakt door de micro-omgeving.

Protocol

1. Celcultuur het onderhoud van de slapende en uitgezaaide tumor cellijnen

  1. Grow slapende (D2OR / MCF7/K7M2-AS.46) en metastatische tumorcellen (D2A1 / MDA-MB-231 / K7M2) in 10 cm cultuur platen met Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) hoog glucose en 10% foetaal runderserum ( FBS) en antibiotica. Zodra de cellen te bereiken 70-80% confluentie, ga dan naar de volgende testen.

2. Celproliferatie assay van slapende (rust) en metastatische (prolifererende) tumor cellen gekweekt in een 3D-systeem BME

Het kweken van slapende / gemetastaseerde cellen in het 3D-systeem

  1. Dooi Cultrex groeifactor-gereduceerde Basement Membrane Extract (BME) in 4 ° C koelkast een nacht voor het uitvoeren van de test. Let op de BME moeten worden behandeld op ijs te allen tijde.
  2. Op de volgende dag, plaatst u een 96 wells plaat op een dienblad van ijs in een laminaire kap. Vacht elke well met een 50-100μl van ijskoude BME met behulp van een dispenser met een spuit. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen worden gevormd in de putten. Plaats de 96 wells-plaat bekleed met BME in een vochtige incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
  3. In de tussentijd aspireer de media uit de slapende en of metastatische tumorcellen (opgesteld in hoofdstuk 1). Spoel kweekplaten met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4 (PBS). Zuig het PBS en voeg 2 ml trypsine voorverwarmd bij 37 ° C, aan de cultuur platen. Incubeer de platen in een bevochtigde 5% CO 2 bij 37 ° C, gedurende 5 minuten.
  4. Overdracht cellen om een ​​15 ml conische buis met 5 ml DMEM hoge glucose aangevuld met 10% FCS en antibiotica en tel de cellen.
  5. Spin down het totale aantal cellen worden gekweekt in een weefselkweek centrifuge met een snelheid van 1500g, bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. In onze analyses maken we 2x10 3 cellen / putje voor elke cellijn of tijd te worden onderzocht. Dit kan echter variëren, afhankelijk van de gebruikte cellijnen.
  6. Voorzichtig het supernatans aspireren. Let op, in de meeste gevallen de pellet niet zichtbaar is. Daarom laten sommige media achter. Tik op de bodem van de 15 ml conische buis met uw vingers om ervoor te zorgen dat een schorsing van enkele cellen wordt verkregen. De pellet opnieuw te schorten DMEM lage glucose met antibiotica aangevuld met 2% FCS + 2% BME (assay media). 100 ul van de test media moeten worden toegevoegd voor elke 2x10 3 cellen. Vermaal de cellen vele malen met een 5 ml pipet om ervoor te zorgen dat een enkele celsuspensie wordt gehandhaafd.
  7. Plaat een 100μl van de cel mengsel per goed op de top van de 96 goed BME gecoate plaat. Voor achtergrondinformatie evaluatie (in paragraaf 2.8) plaat in aanvulling 100μl per putje van alleen de test media op de top van de 96 goed BME gecoate plaat. Incubeer de gekweekte platen met 96 putjes in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. De cellen moeten opnieuw worden gevoerd om de 4 dagen met de assay media.

Proliferatie assay:

  1. Proliferatie assay van de cellen: toe te voegen aan de putten op de gewenste tijdstippen 20 ul van de celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit. Incubeer in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C voor 2 uur. Met behulp van een Elisa Plate Reader opnemen van de absorptie bij 490nm. Voor achtergrondinformatie evaluatie en aftrekken, voeg 20μl van de celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit om putten vooraf gecoat met BME en alleen bedekt met assay media. Met behulp van een Elisa Plate Reader nemen de absorptie bij 490 nm.

3. Immunofluorescentie kleuring voor cell signaalmoleculen in slapende (latente) tumorcellen en / of gemetastaseerde (prolifererende) tumorcellen

Het kweken van slapende / gemetastaseerde cellen in het 3D-systeem voor immunfluorescence vlekken

* De volgende protocol is een wijziging van een 3D-cultuur protocol gepubliceerd door Debnath J et al. 18.

  1. Bereid BME zoals beschreven in paragraaf 2.1. De volgende dag: plaats een 8-kamer glazen schuif systeem op een tray van ijs in een laminaire kap. Coat elk goed met 50ul van ijskoude BME met behulp van een 200μl Pipetman. Zorg ervoor dat BME is gelijkmatig verdeeld en er geen luchtbellen worden gevormd in de putten. Plaats de 8 kamer glaasje gecoat met BME in een bevochtigde 5% CO 2 bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
  2. Oogst en slapende of metastatische cellen van sectie 1 en voor te bereiden op de cultuur zoals beschreven in paragraaf +2,3-+2,4. Verzamel het totale aantal cellen worden gekweekt in een 15 ml conische buis. We bereiden 5 x10 3 cellen / putje voor elke cellijn en tijdstip worden onderzocht. Spin down van de cellen in een weefselkweek centrifuge met een snelheid van 1500g, bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zorgvuldig aspireren de supernate. Merk op dat de pellet niet zichtbaar is, daarom achter te laten sommige media. Tik op de bodem van de 15 ml conische buis met uw vingers om ervoor te zorgen dat een enkele cel suspensie is verkregen.Resuspendeer de pellet met voedingsbodem media. 400μl van de test media moeten worden toegevoegd voor elke 5x10 3 cellen. Vermaal de cellen vele malen met 5 ml pipet. Deze stap is zeer belangrijk ervoor te zorgen dat de enkele celsuspensie wordt gehandhaafd.
  3. Plaat 400μl van de cel mengsel per goed op de top van elk van de acht kamers voorzien van BME. Incubeer de gekweekte 8 kamers glaasje systeem in een bevochtigde 5% CO 2 incubator bij 37 ° C. De cellen moeten opnieuw worden gevoerd om de 4 dagen met de assay media.

Immunofluorescentiekleuring:

  1. Op het gewenste tijdstip punten, zuigen de bovenste laag van de media en voeg 200μl van het fixeermiddel met 4% paraformaldehyde (PFA), 5% sucrose en 0,1% Triton X-100 en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Aspireren het fixatief en voeg 200μl van 4% PFA met 5% sucrose en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
  2. Zuig het fixeermiddel en voeg 400 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan elk putje. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zuig het PBS en voeg 400 μ PBS met 0,05% Tween 20 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Blokkeer het vaste cellen bij kamertemperatuur met 200μl van hetzij 10% ezel serum of met 3% BSA voor een uur (het blokkeren van oplossing te gebruiken moet empirisch worden bepaald voor elke primaire antilichaam).
  4. Aspireren de blockingbuffer en voeg 200μl van het primaire antilichaam (verdunning moet empirisch worden bepaald voor elke primaire antilichaam moet worden gebruikt). Verdun het primaire antilichaam in 10% ezel serum als 10% ezel serum werd gebruikt voor het blokkeren of verdunde primaire antilichaam in 3% BSA als 3% BSA blockingbuffer werd gebruikt. 'S nachts Incubeer met de primaire antistof bij 4 ° C.
  5. Aspireren het antilichaam, Was de putjes met 400μl PBS gedurende 15 minuten en tweemaal herhalen. Zuig het PBS en voeg 200μl van de ezel anti-respectieve-IgG geconjugeerd aan rhodamine rood (verdunning moet empirisch worden bepaald), hebben betrekking op de 8 kamer dia met aluminium folie en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
  6. Was de putjes met 400μl PBS (3x15 minuten per wasbeurt). Aspireren PBS. Gemonteerd met VECTASHIELD montage medium met DAPI. Droge dia's voor 40 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Dia's kunnen worden bewaard voor 1 week bij 4 ° C. Bewaar de dia's in het donker. Image dia's door confocale microscopie.

4. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van een proliferatie analyse van de slapende D2.0R en metastatische D2A1 tumorcellen in de 3D-cultuur is weergegeven in figuur 1A. D2.0R cellen zijn slapende (rust) door het gehele experimentele periode van 14 dagen cultuur terwijl de zeer uitgezaaide D2A1 cellen die slapend blijven slechts voor vier tot zes dagen, waarna ze beginnen te woekeren. Tijdens de eerste fase van slapende, vele cellen nog steeds eenzaam in de 3-D cultuur (Figuur 1B, dag 4), terwijl andere niet-prolifererende cellen vormen multi-cellulaire sferoïden. De overgang van D2A1 cellen van een slapende naar proliferatieve state in 3-D-cultuur (Figuur 1B; dag 12) wordt in verband gebracht met dramatische veranderingen in de morfologie van de cel. Daarom kan deze test gebruikt worden om welke factor test / s kunnen leiden tot slapende D2.0R cellen te komen uit hun slapende toestand en wat factor / s kan D2A1 cellen te voorkomen dat de overgang van hun slapende toestand. Figuur 2 is een voorbeeld van een agent het voorkomen van D2A1 cellen om de overgang van latente naar een proliferatieve toestand. Zoals geïllustreerd in figuur 2, behandelingen van D2A1 cellen met een specifieke remmer van myosine lichte keten kinase (ML-7) D2A1 cellen aangehouden in een slapende toestand.

Cell signaling in de slapende en prolifererende tumorcellen gekweekt in het 3D-systeem kan worden bestudeerd door immunofluorescentiekleuring voor mobiele signaalmoleculen. Zoals geïllustreerd in figuur 3 een aanzienlijke stijging van de myosine lichte keten fosforylatie in D2A1 cellen (rode vlekken), gevolgd door de reorganisatie van de F-actine filamenten vormen van stress-actine vezels (groene vlekken) treedt op tijdens de overgang van slaap (1-4 dagen) naar proliferatie (dag 7). Echter, het blokkeren van myosine lichte keten kinase-activiteit in D2A1 cellen door shRNA of specifieke drug (ML-7) behoudt D2A1 cellen in een slapende toestand en de resultaten in een inhibitie van myosine lichte keten fosforylatie en F-actine stress-fiber organisatie (figuur 4).

Figuur 1
Figuur 1. In vitro model om solitaire tumorcellen latentie en de overstap naar metastatische groei te bestuderen. A) Proliferatie van de slapende D2.0R en metastatische D2A1 in 3-D Cultrex BME, n = 8 (gemiddelde ± SE). Representatieve resultaten van drie experimenten (* p ≤ 0,05). B) Lichtmicroscopie beelden van D2.0R en D2A1 cellen gekweekt in 3-D Cultrex BME vergroting x20.Figuur aangepast van Barkan et al. 17.

Figuur 2
Figuur 2. Voorkomen dat de schakelaar van D2A1 cellen van slaap (rust) om de proliferatie in het 3D-cultuur systeem door remming van de myosine lichte keten kinase (MLCK). Tijdsverloop van D2A1 celproliferatie gekweekt in 3-D Cultrex BME, n = 8 (gemiddelde ± SE). Cellen werden behandeld (controle), of behandeld met een specifieke remmer van MLCK (ML-7, 5 uM) voor 48 uur begint op de cultuur dag 5. Figuur aangepast van Barkan et al. 17.

Figuur 3
Figuur 3. Myosine lichte keten fosforylering gevolgd door een F-actine reorganisatie bij de schakelaar van D2A1 cellen van latentie naar proliferatieve groei. D2A1 cellen werden gekweekt in 3-D Cultrex BME op 8 kamer glasplaatje. Cellen werden gefixeerd en gekleurd met DAPI (blauw) voor nucleaire lokalisatie, phalloidin (groen) voor f-actine en met een antilichaam tegen de gefosforyleerde vorm van myosine lichte keten (MLC-p) (rood), zoals aangegeven op verschillende tijdstippen. Samenvoegen van de f-actine, en de MLC-p verkleuring (geel). Expressie van MLC-p werd verhoogd tijdens de overgang van D2A1 cellen van latentie (dagen1-4) van proliferatieve groei (7 dagen), gevolgd door actine stress-fiber vorming (pijlen). Confocale microscopie, vergroting X63. Witte balk is gelijk aan 20 micron. Figuur aangepast van Barkan et al. 17.

Figuur 4
Figuur 4. . Remming van myosine lichte keten kinase (MLCK) gemedieerde f-actine stress-fiber-vorming in D2A1 cellen D2A1 Cellen werden niet behandeld (controle), of behandeld met remmer voor MLCK (ML-7, 5 uM), voor 48 uur begint op de cultuur dag 5, of behandeld met roerei of MLCK shRNA en gekleurd voor de gefosforyleerde vorm van myosine lichte keten (MLC-p) (rood), F-actine (groen), en de kernen (blauw). Samenvoegen van de f-actine, en de MLC-p verkleuring (geel). Confocale microscopie, vergroting X63. Witte balk is gelijk aan 20 micron.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De onderliggende mechanismen die tumorcellen behouden verspreid in een slapende toestand of resulteren in hun overgang naar metastatische groei blijven grotendeels onbekend. Dit fenomeen is zeer moeilijk om te studeren in menselijke patiënten 4,12 en weinig preklinische modellen werden ontwikkeld om dit probleem op te lossen. Toch hebben in vivo en ex-vivo model voor tumor rusttoestand gekenmerkt (beoordeeld in 1,12). Echter, de in vivo modellen voor tumor rusttoestand in...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd mede ondersteund door de intramurale Research Program van het National Cancer Institute.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het serum Vennootschap Catalogus nummer Reacties
DMEM hoge glucose Invitrogen 11965-118
DMEM lage glucose- Invitrogen 11885-092
Foetaal bovine serum (FBS) Invitrogen 10091-148
Groeifactor-gereduceerde 3-D Cultrex Basement Membrane Extract Trevigen Inc Eiwitconcentratie tussen 14-15mg/ml
D2.0R en D2A1 cellijnen 5,19
K7M2 en K7M2AS1.46 cellen 20
MCF-7 en MDA-MB-231 cellen van borstkanker ATCC
Een 8 kamer glazen schuif-systeem (Lab-TEK, Thermo wetenschappelijke) 177402
Celtiter 96 Waterige Een Oplossing celproliferatie assay kit Promega G3580
VECTASHIELD montage medium met DAPI Vector Laboratories Inc H-1200
Normaal ezel serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Elisa Plate Reader Bio-Tec Record 490nm
Confocale microscoop Zeiss-LSM-510 Vergroting X63

Referenties

  1. Aguirre-Ghiso, J. A. Models, mechanisms and clinical evidence for cancer dormancy. Nat Rev Cancer. 7, 834-846 (2007).
  2. Pantel, K., Woelfle, U. Micrometastasis in breast cancer and other solid tumors. J Biol Regul Homeost Agents. 18, 120-125 (2004).
  3. Naumov, G. N. Ineffectiveness of doxorubicin treatment on solitary dormant mammary carcinoma cells or late-developing metastases. Breast Cancer Res Treat. 82, 199-206 (2003).
  4. Klein, C. A. Framework models of tumor dormancy from patient-derived observations. Curr Opin Genet Dev. , (2010).
  5. Naumov, G. N. Persistence of solitary mammary carcinoma cells in a secondary site: a possible contributor to dormancy. Cancer Res. 62, 2162-2168 (2002).
  6. Townson, J. L., Chambers, A. F. Dormancy of solitary metastatic cells. Cell Cycle. 5, 1744-1750 (2006).
  7. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  8. Pantel, K. Differential expression of proliferation-associated molecules in individual micrometastatic carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 85, 1419-1424 (1993).
  9. Demicheli, R. Tumour dormancy: findings and hypotheses from clinical research on breast cancer. Semin Cancer Biol. 11, 297-306 (2001).
  10. Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med. 353, 793-802 (2005).
  11. Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol. 6, 339-351 (2009).
  12. Goss, P. E., Chambers, A. F. Does tumour dormancy offer a therapeutic target. Nat Rev Cancer. 10, 871-877 (2010).
  13. Mendoza, A. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120, 2979-2988 (2010).
  14. Naumov, G. N. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. J Natl Cancer Inst. 98, 316-325 (2006).
  15. Barkan, D. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  16. Barkan, D., Green, J. E., Chambers, A. F. Extracellular matrix: A gatekeeper in the transition from dormancy to metastatic growth. Eur J Cancer. , (2010).
  17. Barkan, D. Inhibition of metastatic outgrowth from single dormant tumor cells by targeting the cytoskeleton. Cancer Res. 68, 6241-6250 (2008).
  18. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  19. Morris, V. L. Mammary carcinoma cell lines of high and low metastatic potential differ not in extravasation but in subsequent migration and growth. Clin Exp Metastasis. 12, 357-367 (1994).
  20. Khanna, C. The membrane-cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med. 10, 182-186 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

3D celkweekrecidief van borstkankerbasaalmembraanextractcelproliferatie assaysluimerende tumorcellenmetastatische tumorcellenmyosin light chain

Gerelateerde artikelen