Multi-foton Imaging van de tumorcel invasie in een orthotope Muis Model van Oral plaveiselcelcarcinoom

Samenvatting

Een uitgebreid overzicht van de technieken die betrokken zijn bij het genereren van een muismodel van orale kanker en kwantitatieve controle van de tumor invasie in de tong door middel van multi-foton microscopie van gelabelde cellen wordt gepresenteerd. Dit systeem kan dienen als een nuttig platform voor de moleculaire beoordeling en werkzaamheid van het geneesmiddel van anti-invasieve verbindingen.

Samenvatting

Loco-regionale invasie van hoofd-en halskanker is gekoppeld aan uitgezaaide risico en presenteert een moeilijke uitdaging in het ontwerpen en implementeren van behandeling van de patiënt strategieën. Orthotope muismodellen van orale kanker zijn ontwikkeld om de studie van de factoren die invloed te vergemakkelijken invasie en als modelsysteem voor het evalueren van anti-tumor geneesmiddelen dienen. In deze systemen, is de visualisatie van uitgezaaide tumorcellen in mondholte weefsels meestal uitgevoerd door een conventionele histologie, of met in vivo bioluminescente methoden. Een van de belangrijkste nadeel van deze technieken is de inherente onvermogen om nauwkeurig te visualiseren en te kwantificeren vroege tumorcel invasie die voortvloeien uit de primaire locatie in drie dimensies. Hier beschrijven we een protocol dat een uitgewerkt model voor het plaveiselcelcarcinoom van de tong (SCOT) met twee-foton beeldvorming om multi-lingual vectorial visualisatie van tumor zich laten combineert. Het OSC-19 hoofd en de nek tumor cellijn werd stabiel ontworpen om de F-actine bindende peptide LifeAct gefuseerd met het mCherry fluorescerend eiwit (LifeAct-mCherry) te drukken. Fox1 ^{nu / nu} muizen geïnjecteerd met deze cellen vormen een betrouwbare tumoren die het mogelijk maken de tong te worden gevisualiseerd door ex-vivo toepassing van twee-foton microscopie. Deze techniek maakt het mogelijk om orthotope visualisatie van de tumormassa en lokaal binnendringende cellen in tongen weggesneden zonder onderbreking van de regionale tumor micro-omgeving. Daarnaast, dit systeem zorgt voor de kwantificering van de tumorcel invasie door het berekenen van afstanden die cellen verplaatsen binnengevallen van de primaire tumor site. Algemene deze procedure voorziet een verbeterde model systeem voor het analyseren van factoren die bijdragen aan SCOT invasie en therapeutische behandelingen afgestemd op de lokale invasie en verre metastatische verspreiding te voorkomen. Deze methode heeft ook de potentie om uiteindelijk te combineren met andere beeldvormende modaliteiten in een in vivo setting.

Protocol

1. Cellijnen, Vector Constructie en Productie Lentivirale

1. Menselijk hoofd en nek tumorcellen lijnen (OSC19 of UMSCC1) werden gekweekt in volledige media bestaande uit DMEM (Cellgro cat # 50-003-PB) aangevuld met 10% foetaal runderserum FBS (Hyclone cat # SH30070.03), 1% penicilline / streptomycine (Cellgro cat # 30-002-CI), en 1% niet-essentiële aminozuren (Cellgro cat # 25-025-CI).
2. Voor de overdracht van het LifeAct-mCherry coderende sequentie in de pLL7.0 lentivirale vector, was de Sbf1 herkenningsplaats in de bovenliggende mCherry cDNA veranderd door de invoering van drie stille mutaties in de herkenningssequentie met behulp van plaats-gerichte mutagenese (Stratagene cat # 200518-5). De resulterende gewijzigde LifeAct-mCherry sequentie werd vervolgens PCR geamplificeerd met begeleidende EcoR1/Sbf1 sites en gesubkloneerd in pLL7.0 aan de pLL7.0-LifeAct-mCherry bouwen genereren.

2. pLL7.0-LifeAct-mCherry Virus Production

1. Virale productie werd uitgevoerd volgens de Lentivirale Expression Systems handleiding (System bio-versie 2-051018).
2. De verpakking cellijn 293T/17 cellen (ATCC CRL-cat # 11268) was gegroeid naar 40% confluentie in dezelfde volledige media die worden gebruikt voor SCCHH lijnen.
3. Cellen werden getransfecteerd met de pLL7.0-LifeAct-mCherry, psPAX2, en pVSV-G vectoren in een verhouding 03:02:01, respectievelijk met behulp van CalPhos (Clontech cat # 631312).
4. Na 24 uur werd de eerste media uit de transfectie vervangen door verse media.
5. Media werd dan verzameld en aangevuld om de 12 uur gedurende 72 uur en bewaard bij 4 ° C.

3. De productie van hoofd en hals cellijnen met Stable LifeAct-mCherry Expression

1. De verzamelde media werd gesponnen bij 2000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
2. Een ml verduidelijkt media met virus werd direct toegevoegd aan OSC19 of UMSCC1 cellen voor 12 uur. Cellen werden vervolgens gespoeld, en een extra mL van het virus werd toegevoegd voor een periode van 12 uur.
3. Cellen werden behandeld met media die 200mg/ml puromycine voor twee weken naar resistente kolonies te selecteren.
4. Overleven klonen werden visueel gescreend op LifeAct-mCherry expressie door fluorescentie microscopie. Individuele positieve kolonies werden typsinized met behulp van steriele 3mm klonen schijven (Fisher cat # 0790710A).
5. Positieve cellen werden aangehouden in media die 200mg/ml puromycine tot bevroren terug of worden gebruikt voor orthotope injectie.

4. Orthotope Tumor xenograft Formation

1. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met een protocol (09 tot 0821), goedgekeurd door de Universiteit van West Virginia Dierverzorging en gebruik Comite.
2. LifeAct-mCherry expressie tumorcellen werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd en 2,5 x 10 ⁴ cellen werden opnieuw gesuspendeerd in 50 uL complete media.
3. Tumorcellen werden geladen in een een ml injectiespuit bevestigd aan een 27 ½ gauge naald.
4. Vrouw athymische Fox1 ^{nu / nu} muizen leeftijd van 8 weken (Harlan Laboratories) werden verdoofd met een combinatie van 80mg/kg ketamine en xylazine 10mg/kg. Verdoofde muizen werden gehouden tussen 37-40 ° C op een verwarmingselement.
5. Met behulp van steriel pincet, was het puntje van de tong zachtjes pakte en voorzichtig getrokken uit de mondholte.
6. Cellen werden langzaam geïnjecteerd in een zijde van elke tong een bolvormige massa te creëren in de tong centrum, het vermijden van de linguale slagaders.
7. Muizen werden geïnjecteerd met 2.1mg/kg yohimbine en keerde terug naar de verwarming pad waar ze werden voor de 2-3 uur gecontroleerd tijdens het herstel van anesthesie.
8. Een keer nieuw leven ingeblazen, werden muizen geplaatst in steriele kooien met een zachte deeg transgene voeding (Bioserve cat # S3472).
9. Muizen werden gewogen om de 2-3 dagen en visueel gecontroleerd te worden op tumor ontstaan.

5. Voorbereiding van de muis Tongen voor Ex-vivo Imaging

1. Muizen herbergen tumoren op verschillende tijdstippen (meestal 2-4 weken post-injectie) werden gedood door de kooldioxide inademing.
2. Tongen werden geëxtraheerd, gespoeld met 1X PBS en verbonden aan een kant van een conventionele paraffine tissue inbedding cassette (StatLab Cat # H104,) met behulp van monofilament naaigaren van een lokale hobby winkel en een maat 8 naald.
3. Nadat de tongen werden geïmmobiliseerd, werd de hele cassette montage geplaatst in een 30mm weefselkweek schotel en ondergedompeld in 1X PBS.
4. Verwerkte tongen werden meteen gebruikt voor twee-foton excitatie microscopie.

6. Beeldvorming van tumoren Tongue met twee-foton microscopie

1. Tong cassettes werden ondergedompeld in een 60mm schotel met 1X PBS vastgezet in een speciaal ontworpen houder op een intrekbare cantilever arm (kamer naar het vliegveld, Siskiyou instrumenten) gepositioneerd onder de doelstelling van een rechtopstaande microscoop (Verplaatsbare Microscoop (MOM); Sutter Instruments).
2. Een 40X/0.8NA water te dompelen objectief werd direct die op of over zichtbare Tumof letsels. Tongen werden afgebeeld door twee-foton microscopie met de Ti: saffier laser (Mira, Coherent) intensiteit van 60 mW en input golflengte van 755 nm tot de mCherry signaal te optimaliseren.
3. Serial 1mm laser scanning beelden werden verzameld op een micrometer incrementele diepte over een totale weefsel diepte tussen 15 en 100 micrometer (afhankelijk van de tumor volume). Beelden werden vastgelegd met behulp van scanimage, een open source-programma op basis van de MATLAB-platform dat werd ontwikkeld door de Karel Svoboda laboratorium (Janelia Farms, HHMI). Scanimage genereert een twee-kanaals output van raster-scan patronen op de x / y galvanometrische scan spiegels controle, en tegelijkertijd legt een maximum vier-kanaals signaal ingang gelijktijdig uit fotomultiplicatorbuizen (PMT's) door middel van een data-acquisitie board (PCI-6610S , National Instruments). De PMT signalen worden versterkt door een laag geluidsniveau huidige voorversterkers (SR570, Stanford Research System) voordat wordt ingevoerd in de NI-DAQ board voor weergave op het beeldscherm. Scanimage verzamelt z-stack beelden door het beheersen van de z-as van de objectieve en verzamelt time-lapse beelden in een enkele of cyclus mode. Beelden werden opgeslagen in een enkel TIFF-bestand met 16 bit diepte.

7. Beeldanalyse met behulp van Amira Software

1. Amira beeldvorming voor tumor kwantificering: In Aimra software, open het TIFF-bestand bevat de set van de z-stack beelden.
2. Markeer de bestandsnaam, selecteren en toepassen van de Voltex functie om een ​​driedimensionale weergave te genereren. Een grote primaire tumor afbeelding met een aantal kleinere, los invasieve groepen (IG) van collectief vielen cellen is meestal zichtbaar in de gerenderde afbeelding (zie figuur 6A).
3. Het selecteren van de primaire tumor massa, selecteert u "Open Data", dan "etikettering", vervolgens "Label Field".
4. Drempeling de primaire tumor-selecteer alle z-stack afbeeldingen en bladert u door de beelden in de z-vlak aan de opname van alleen de primaire tumor massa te bereiken binnen de drie dimensies. Dit is meestal het grootste formaat afbeelding in het veld en staat deze vaak gesegmenteerd als de verbeelde wordt doorkruist door de z-vlak.
5. Gebruik de toverstaf / drempel functie op de achtergrond fluorescentie te corrigeren en te elimineren uit het beeld zonder waarbij een eventueel van de tumor signaal. Markeer de "Inside File" label en klik op de knop ⊕. Selecteer de "alle segmenten" in. Dit levert een gekleurde rand rond de thresholded primaire tumor gebied in ieder z-stack te verhogen.
6. Te selecteren GR, kies dan de "New"-functie. Selecteer een IG en zorg dat is niet geassocieerd met de primaire tumor door te bladeren door de z-vlak.
7. Selecteer "Alle Slices 'en klik op de knop ⊕. Hernoem het bestand (ex: IG 1)
8. Herhaal de drempelmethode procedure in 7.4 en de accentuering stap in 7.5 voor de vastgestelde IG. Kies een kleur anders is dan de kleur die wordt gebruikt om de primaire tumor massa aan te duiden.
9. Herhalen als nodig is voor elke extra IG het hele beeld, scannen via het z-vlak te zorgen dat alle GR worden aangeduid. Met behulp van verschillende kleuren voor elk geïdentificeerd IG helpt in de toekomst identificatie op de afbeelding.
10. Zodra de primaire tumor en alle GR zijn geselecteerd, "Segmentation" uit het pulldown menu te selecteren, selecteer dan "Material Statistics". Dit zorgt voor het volume meet als de X, Y en X tumor kern coördinaten voor de primaire tumor, om afstanden van GR te berekenen van het centrale tumor punt.
11. Met de volumes berekend, bepalen van de afstand voor elke IG van de centrale kern van de primaire tumor. Selecteer "Segmentatie" en vervolgens "Materiaal Statistics". Deze stap berekent alle afmetingen in pixels. Om te zetten pixels tot micrometers op basis van de kalibratie van de microscoop doelstelling en eventuele extra stijgingen van vergroting (dat wil zeggen; zoom functies). Voor de microscoop en de instellingen gebruikt in deze experimenten werd de 40X objectief gebruikt zonder zoom, het geven van een kalibratie van 1 pixel = 0,298 micrometer. Gegevens importeren in een Excel spreadsheet, welke parameters geeft voor de primaire tumor in drie dimensies (X1, Y1, Z1) en voor elke IG (ex: X2, Y2, Z2 voor de eerste IG).
12. De binnengevallen afstand in microns voor elke IG van het centrum van de primaire tumor wordt berekend met de formule √ ((X2-X1) ² + (Y2-Y1) ² + (Z2-Z1) ^2).
13. De tumor invasieve index (T _I) wordt berekend volgens de formule T _I = N _T x V _T x D _T, waarbij N _T = het totaal aantal GR in het beeld, V _T = het totale volume van alle GR, D _T = totale afgelegde afstand van alle invasieve groepen uit het centrum van de primaire tumor.

8. Drie dimensionale renderings met Nikon NIS-Elements-software

1. Drie dimensionale renderings met meer topografische details kunnen worden gegenereerd door het importeren van de oorspronkelijke 16-bits monochrome TIFF-bestanden van de gehele tumor afbeelding in de Nikon NIS-Elements-softwarepakket (Nikon, Melville, NY). Selecteer "File", dan "ND", dan "Create ND bestand van File Sequence". Selecteer de TIFF z-series image stack en geef de juiste stapgrootte.
2. Kalibreer de ND document in het xy-vlak. Geef de grootte van een pixel met behulp van een handmatige kalibratie.
3. Kies de "Volume View". Gebruik de "HQ" functie om extra sneetjes in de z-vlak te berekenen voor een hogere kwaliteit. In de "3D Renderer Settings", gebruik dan de "Advanced Renderer" met een kwaliteit van de "Ultra High Details" en "Full Resolution". Kies "Alpha Blending" het accentueren van de tumor oppervlakken.
4. Optimaliseer de drie-dimensionale afbeelding voor een presentatie. Zoom in op de tumor en de bijbehorende GR en gewas als nodig is. Draai het beeld in de xyz vliegtuigen en pas de Luts.
5. Leg de afbeelding voor een presentatie. Selecteer "Bewerken-Weergave maken Snapshot (8 bit RGB)". Naam en dienovereenkomstig te slaan bestand.

9. Representatieve resultaten

Figuur 1. Algemene schematische illustreren belangrijke stappen in orthotope tong tumor de productie en de in situ twee foton beeldvorming.

Figuur 2. Injectie van LifeAct-mCherry expressie OSC19 cellen die in de muis tong.

Figuur 3 resectie tumor-bevattende muis tong voorbereid voor twee photon imaging.

Figuur 4. Oriëntatie van een tumor-bevattende tong in positie op een twee foton microscopie klaar voor de beeldvorming.

Figuur 5. Vertegenwoordiger schermafdruk van scanimage tonen ruwe data-acquisitie van de eerste twee-foton beeld.

Figuur 6. Image analyse en kwantificering van tumor invasie in een orthotope OSC19 tumor. Vertegenwoordiger screen shot beelden van Amira Voltex rendering (A) en een enkele thresholded z-sectie (B) met de primaire primaire tumor beschreven in het paars, invasieve groep 1 (IG-1) die in blauw, IG-2 die in rood en IG -3 geschetst in het groen als een voorbeeld van de identificatie procedure. Pijlpunten duiden GR in (A) en (B). C. Plots van het volume ten opzichte van binnengevallen afstand voor acht afzonderlijke GR gebruikt om de tumor invasie index (Ti) te berekenen.

Figuur 7. Vertegenwoordiger beelden van tumoren en tumoren groepen binnengevallen van dit protocol vergeleken met beelden van een conventionele IHC aanpak. A. paraffine deel van een hele muis tong drager zijn van een UMSCC1 orthotope tumor. Immunohistochemische kleuring werd uitgevoerd met behulp van conventionele procedures, met een primair antilichaam tegen de SCCHH-specifieke cel marker emmprin (Zymed; cat # 34 tot 5.600) op 1:1000 verdunning en gevisualiseerd met behulp van de OmniMap DAB anti-Rb detectie kit (Ventana cat # 760 -149), gevolgd door ijzer hematoxyline kleuring. Beelden omvat de totale oppervlakte tong werden individueel verzameld op 4x vergroting op een Olympus ZX70 Provis microscoop met een Optronics MicroFire CCD-camera en gereconstrueerd met behulp van de StereoINvestigator imaging-pakket (MBF Bioscience). De tumor is duidelijk op de tong tip. Een vergrote streek met aanduiding van de invasieve front en de individuele tumorcel groepen (pijlpunten) wordt getoond in (B). C. Nikon NIS-Elementen weergave van een vertegenwoordiger OSC19 tumor. Verbeterde contour detail en duidelijke visualisatie van de GR (pijlpunten), is evident. Bars in alle beelden = 100 micrometer.

Discussie

Orthotope muismodellen nuttig zijn gebleken voor het bestuderen van vele aspecten van hoofd-en halskanker ^1,2. We hebben samen een gevestigde orthotope systeem van SCOT ³ met twee-foton microscopie beeldvorming van mCherry-gemerkte cellen als een systeem om het begin van de gebeurtenissen van hoofd en nek tumorcel invasie te bestuderen. In deze procedure hebben we geconstateerd dat cellen kan lekken van de plaats van de tumor injectie, vooral bij muizen zes weken of jonger wegens onvoldoende tong grootte. We maken gebruik van oudere muizen om dit probleem te voorkomen. De grotere tong grootte met oudere muizen helpt ook bij het vermijden van breuk van een linguale slagader en overmatige bloedingen uit de tong. Tumor te nemen is sterk verbeterd wanneer de tong zwelt dramatisch op de plaats van eerste injectie. Deze zwelling verdwijnt binnen een uur of twee als de ingespoten vloeistof is geabsorbeerd. Groei van de tumor lijkt evident een tot twee weken na de injectie met het aangegeven geïnjecteerde cel nummer als een kleine witte bult op de tong oppervlak. We stellen ook vast dat bij de 40X objectief gebruikt in onze studies hier gepresenteerd, kunnen we niet individuele tumorcellen te onderscheiden maar GR identificeren als invasieve cel clusters die de typische wijze van SCCHH invasie samenvatten.

Tot op heden dit model wordt veelvuldig gebruikt voor het testen van de rol van specifieke moleculen evenals verscheidene anti-tumor drugs op SCOT groei van een invasie, met de werkzaamheid gemeten door cervicale lymfe gecontroleerd knooppunt metastasering met behulp van IHC-of bioluminescente methoden ^4-7. Tumoren gevormd in dit systeem manifest dicht bij de tong oppervlak (Figuur 7), die de toepassing van twee-foton microscopie op het beeld gehele tumoren in situ als invasief multi-cellulaire clusters. De procedure kan ook worden gebruikt om tumor invasie te visualiseren met cellulaire resolutie. Twee-foton microscopie is eerder gebruikt om experimentele behandelingen voor hoofd-hals kanker in orthotope ^8,9 en ^8,10 xenograft modellen te bestuderen. Er zijn echter twee belangrijke verschillen tussen deze rapporten en onze protocol. De eerste, deze studies maken gebruik van extracellulaire labels te richten / hoofd en de nek tumor cellen te identificeren, mogelijk beperken detectie alleen tumorcellen met ruime toegang tot de circulatie. Ten tweede invasie van tumorcellen dicht bij de primaire plaats die waarschijnlijk recapituleert vroeg uitgezaaide activiteit niet was beoordeeld als een experimentele parameter. Ons protocol biedt de mogelijkheid om tumorcel invasie rechtstreeks te kwantificeren op enig moment tijdens de progressie van de tumor in de muis tongen. Terwijl de hier beschreven methode beschrijft de procedure met behulp van ontleed tongen, we zijn op dit moment in het proces van aanpassing van deze methode om de afbeelding tumor invasie in levende muizen voor gebruik in combinatie met bioluminescentie gelijktijdig te volgen begin van de invasie, de lokale betrokkenheid van de lymfeklieren en metastasen op afstand in de hetzelfde dier. Wijzigingen in het protocol voor in vivo beeldvorming vereisen het ontwerpen van een passend tijdstip voor het plaatsen en onderhouden van muizen tijdens beeldvorming, evenals een praktisch systeem om de mondholte van verdoofde muizen goed spoelen tijdens de beeldvorming procedure. Eenmaal geoptimaliseerd, zullen deze aanpassingen bieden de mogelijkheid om de rol van de potentiële pro-invasieve moleculen en het testen van anti-invasieve verbindingen op de lokale invasie en nog veel meer op afstand uitgezaaide betrokkenheid bij dieren gedurende langere perioden te bestuderen.