High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Samenvatting

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. De methode is gebaseerd op een eenvoudige visuele uitlezing van substraat degradatie, vereist geen enzymen zuivering, en is zeer schaalbaar. Dit maakt het mogelijk om een ​​snelle screening van grote bibliotheken van enzym varianten.

Samenvatting

Cellulase enzymen (endoglucanasen, cellobiohydrolasen, en β-glucosidase) hydrolyseren cellulose in de component suikers, die op zijn beurt kan worden omgezet in brandstof alcoholen ^1. Het potentieel voor enzymatische hydrolyse van cellulosehoudende biomassa om duurzame energie te bieden heeft op meer inspanningen om cellulasen engineer voor een economische productie van brandstoffen ^2. Van bijzonder belang zijn schimmel cellulasen ^3-8, die al industrieel gebruikt voor voedingsmiddelen en textiel verwerken.

Het identificeren van actieve varianten onder een bibliotheek van mutant cellulasen is cruciaal voor het engineeringproces, actief mutanten kan verder worden getest op verbeterde eigenschappen en / of onderworpen aan extra mutagenese. Efficiënte engineering van schimmel cellulasen werd belemmerd door een gebrek aan genetische tools voor inheemse organismen en door de moeilijkheden in de uiting van de enzymen in heterologe gastheer. Onlangs Morikawa en collega's ontwikkelden een methode voor het uitdrukken in E. coli de katalytische domeinen van endoglucanasen uit H. jecorina ^3,9, een belangrijke industriële schimmel met de capaciteit om cellulasen in grote hoeveelheden afscheiden. Functionele E. coli expressie is ook gemeld voor cellulasen van andere schimmels, waaronder Macrophomina phaseolina ¹⁰ en Phanerochaete Chrysosporium ^11-12.

We presenteren een methode voor high throughput screening van schimmels endoglucanase activiteit in E. coli. (Fig 1) Deze methode maakt gebruik van de gemeenschappelijke microbiële kleurstof Congo rood (CR) te visualiseren enzymatische afbraak van carboxymethylcellulose (CMC) door de cellen kweken op vast medium. De activiteit test vereist goedkoop reagentia, minimale manipulatie, en geeft eenduidige resultaten zones van afbraak ('halo') op de kolonie site. Hoewel een kwantitatieve meting van de enzymatische activiteit kan niet worden bepaald door deze methode, hebben we ontdekt dat Halo grootte correleert met een totale enzymatische activiteit in de cel. Verdere karakterisering van de individuele positieve klonen zal bepalen, ten opzichte van eiwitten fitness.

Traditionele bacteriële hele cel CMC / CR-activiteit assays ¹³ te betrekken gieten agar met CMC op kolonies, die onderworpen is aan kruisbesmetting, of incuberen culturen in CMC agar putten, die minder vatbaar is voor grootschalige experimenten. Hier hebben we melding van een verbeterde protocol dat de bestaande wassen methoden ¹⁴ voor cellulase activiteit verandert: de cellen gekweekt op CMC agar platen zijn voorafgaand aan de CR vlekken verwijderd. Ons protocol vermindert kruisbesmetting en is zeer schaalbaar, waardoor de snelle screening van duizenden klonen. Naast de H. jecorina enzymen, hebben we uitgesproken en gescreend endoglucanase varianten uit de Thermoascus aurantiacus en Penicillium decumbens (getoond in Figuur 2), wat suggereert dat dit protocol is van toepassing op enzymen uit een reeks van organismen.

Protocol

1. Screening plaat voorbereiding

1. Voeg 25g LB groeimedium, 15 g agar, en 1,5 g carboxymethylcellulose (CMC) substraat aan 1L gedestilleerd water, en de autoclaaf te steriliseren.
2. Na de autoclaaf, laat medium laten afkoelen en voeg de juiste antibiotica, en IPTG tot een uiteindelijke concentratie van 100 urn.
3. Iedere gieting 200mL medium in vijf grote vierkante petrischaaltjes / bioassay trays (240 x 240 x 20mm of groter). Laat platen volledig drogen.

2. Endoglucanase bibliotheek generatie en het scherm

1. Genereer een bibliotheek van endoglucanase katalytische domein (en). Dit kan worden bereikt op vele manieren (bijvoorbeeld plaats-gerichte of willekeurige mutagenese, recombinatie, etc.) en wordt bepaald door de onderzoeker.
2. Kloon van de bibliotheek in een vector zodanig dat zij onder de controle van de T7-promotor met het lac operator, en bevatten een pelB signaalsequentie voor het richten van de periplasma. Een voorbeeld van een geschikte vector is pET22b (+) van Novagen.
3. Transformeren de endoglucanase bibliotheek in E. coli-stam BL21 (DE3) en de plaat voor enkele kolonies.
4. 'S nachts Incubeer transformatie bij 37 ° C.
5. Met behulp van steriele tandenstokers, enten klonen in 96 goed deep-well platen die 400μL LB-medium aangevuld met de juiste antibiotica. Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht met schudden bij 250 rpm.
6. Voeg steriele glycerol aan 96 goed 's nachts culturen tot een uiteindelijke concentratie van 10% voor de lange termijn opslag bij -80 ° C. Dit zal de meester plaat worden.
7. Met behulp van een 96-pin stempel, repliceren plaat 's nachts culturen op de screening platen met IPTG en CMC. Tot 5 sets van 's nachts culturen kan worden afgestempeld op elke screening plaat.
8. Label de screening platen, zodat de identiteit en de oriëntatie van elk 96 wells plaat is bekend.
9. Incubeer de gestempelde bibliotheken bij kamertemperatuur (17-25 ° C) 's nachts of tot de zichtbare kolonies hebben gevormd.
10. Spoel plaat met gedestilleerd water totdat alle sporen van de kolonies worden verwijderd.
11. Pour Congo Rood (CR; 0,5% in water) op gewassen plaat. Zorg ervoor dat u net genoeg CR toe te voegen aan de plaat te dekken.
12. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Niet meer dan 15 minuten voor CR incubatie. Langere incubatietijden zal resulteren in minder duidelijk halo's.
13. Giet CR en voeg een flinke hoeveelheid (meer dan genoeg om de plaat te dekken) van 1M NaCl.
14. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur.
15. Giet NaCl aan CMC degradatie halo's zichtbaar te maken. Voor een betere resolutie van de halo's, kan het langer incubatietijden met NaCl of meerdere NaCl wasbeurten nodig zijn.
16. Met behulp van een steriele tandenstoker, pick actieve enzymen klonen van de master-plaat voor verdere karakterisering.

3. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van de uitlezing voor deze high throughput scherm wordt weergegeven in figuur 3. Klonen kunnen worden geïdentificeerd als inactief, zwak actief, en zeer actieve basis van de grootte van de degradatie zone. Dit is vooral handig als een enzym van bekende activiteit is opgenomen in de bibliotheek als een referentie. Zoals hier weergegeven, is de identificatie van actieve enzymen is robuust en reproduceerbaar. Maar, wees ervan bewust dat een adequate etikettering van de screening platen is uiterst belangrijk. De onderzoeker moet in staat zijn om actief varianten te identificeren na het wassen van de kolonies weg, om ze te kiezen uit de master plaat opgeslagen bij -80 ° C voor verdere karakterisering. Tot slot is het moeilijk in te schatten a priori de relatie tussen de activiteiten op het kunstmatige versus natuurlijke substraten. Daarom moet de onderzoeker test alle positieve klonen op industrieel relevante materiaal om eiwit conditie te bepalen.

Figuur 1. Schematisch overzicht van de screening procedure. Cellen worden getransformeerd met een endoglucanase bibliotheek en selectief plated voor enkele kolonies. Klonen geplukt en gegroeid 's nachts in 96 goed diep en platen voor (1) opslag bij -80 ° C en (2) replica plating op borden met CMC en IPTG aan endoglucanase expressie induceren. Actief klonen worden geplukt van de master plaat bewaard bij -80 ° C.

Figuur 2. Klonering en expressie van schimmels katalytische domeinen in E. coli. (A) endoglucanase expressievector. Genen werden gekloneerd in pET22b (+) (Novagen) onder controle van de T7-promotor. (B) Rechts panel: endoglucanase-expressie BL21 (DE3) kolonies. Linker paneel: CMC degradatie halo's na het wassen en ontwikkeling met Congo Red.

Figuur 3. Voorbeeld resultaten van CMC / Congo Red scherm. Foto's genomen van de screening platen na het wassen en Congo Red ontwikkeling. Alle kolonies op screening platen waren van vergelijkbare grootte.

Discussie

Het protocol hier beschreven staat stelt snel en high throughput identificatie van actieve enzymen, met een minimum aan manipulatie. Activiteit detectie is vrij gevoelig, en kwalitatief weerspiegelt de hoeveelheid activiteit in de cel. Het gebruiksgemak maakt deze methode geschikt voor een breed scala van enzym bibliotheken, slechts beperkt door de functionele expressie in E. coli. Bovendien is de activiteit van dit soort screening niet beperkt tot schimmel cellulasen, maar kan worden aangepast voor elke endogl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Vennootschap	Product nummer
IPTG	Sigma	I1284
Congo Red	Sigma	C6277
Carboxymethylcellulose	Sigma	360384
NaCl	Sigma	S1679
Bacto-agar	BD Biosciences	214030
Bioassay platen	Thermo Scientific	240845