Studeren Age-afhankelijke genomische instabiliteit met behulp van de S. cerevisiae Chronologische levensduur Model

Samenvatting

Hier beschrijven we een set van DNA-mutatie assays die kunnen worden gecombineerd met de gist chronologische levensduur model om de genen / paden die reguleren of bijdragen aan de genomische DNA instabiliteit tijdens Aging Study.

Samenvatting

Studies die gebruik maken van de Saccharomyces cerevisiae ouder model hebben ontdekt levensduur regelgeving pathways die gedeeltelijk bewaard in hogere eukaryoten ^1-2. De eenvoud en kracht van de gist ouder model kan ook worden onderzocht op DNA-schade en genoom onderhoud, alsmede hun bijdragen aan ziekten tijdens Aging Study. We beschrijven hier een systeem om leeftijd-afhankelijke DNA-mutaties, waaronder base substituties, frame-shift mutaties, grove chromosomale herschikkingen, en homologe / homeologous recombinatie, evenals nucleair DNA-herstel-activiteit door het combineren van de gist chronologische levensduur met simpele DNA-onderzoek schade en mutatie assays. De hier beschreven methoden moeten vergemakkelijken de identificatie van genen / pathways die genomische instabiliteit en de mechanismen die leeftijd afhankelijke DNA-mutaties en kanker ten grondslag liggen bij zoogdieren te reguleren.

Protocol

Twee modellen zijn levensduur wordt gebruikt om te studeren veroudering in S. cerevisiae: RLS en CLS. De replicatieve (ontluikende) levensduur (RLS) is gebaseerd op de observatie dat gist moeder cellen een eindig aantal divisies ^3-6 ondergaan. Zullen we ons richten op de chronologische levensduur (CLS), een model gebaseerd op de chronologische overleving van niet-delende gist in cultuur of op platen ^7-11. Wild type gist groeit exponentieel voor 10-12 uur in synthetische dextrose complete (SDC) medium . Bij het glucose niveau verlaagt, gist overschakelt van fermentatie tot ademhaling, een proces genaamd diauxic verschuiven. Cellen langzaam blijven delen tijdens de post-diauxic fase voor ongeveer 48 uur vóór het binnenvaren G ₀ arresteren. De stofwisseling van de cellen blijft hoog tot dag 5-6 (dag 0 is de inenting dag). Levensvatbaarheid van de cellen na verloop van tijd kan worden geopend met het percentage van de chronologisch verouderende cellen, bemonsterd om de twee dagen, die G ₀ arrestatie en vormen kolonies op rijke YPED platen kunnen verlaten.

1. Gist chronologische levensduur (CLS) in vloeibare cultuur

1. Inoculeren een enkele kolonie in 1 ml synthetisch volledige glucose-medium (SDC, tabel 1) en incubeer overnacht met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Drie inoculums van onafhankelijke kolonies moeten worden voorbereid voor elke stam om de biologische replica's te bieden.
2. Verdun het 's nachts de cultuur in verse SDC medium (meestal 10 ml) tot OD = 0.05-0.1 (~ 1:100 verdunning) en incubeer met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Dit tijdstip wordt beschouwd als dag 0 van de chronologische veroudering. Handhaaf een 1:5 verhouding van cultuur / fles volume (10 ml cultuur in 50 ml, of voor een langere / grote experimenten 25 ml cultuur in 125 ml) om een ​​goede beluchting zorgen.
3. Vanaf dag drie, twee porties van 10 pi uit de kolf te verwijderen, verdunnen 10.000 keer in geautoclaveerd water, 10 ui verdund cultuur (dat wil zeggen, 10 ⁴ -10) op YEPD (1% gistextract, 2% Bacto pepton, 2% glucose , 2% agar) platen, en incubeer bij 30 ° C voor 48-72 uur voordat kolonievormende verenigen (CFU) is geteld.
4. Dag 3 CFU wordt beschouwd als 100% overleving. Verdunningsfactoren van vergrijzing cultuur in de daaropvolgende dagen moet dienovereenkomstig worden aangepast aan ~ 20-100 kolonies in de CFU-test (bijvoorbeeld 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, etc.) te verzekeren. Voor wild-type cellen in de DBY746 achtergrond, de CLS bereikt 1% overleving rond dag 11.

Variaties van in situ levensvatbaarheid test zijn onder meer:

• Caloriebeperking (CR) van glucose beperking. Verdunning van 's nachts cultuur in glucose beperkte SC medium (zoals 0,5 of 0,05% in plaats van de standaard 2% glucose) in het algemeen leiden tot een lagere dichtheid bevolking verzadiging op dag 3, maar veel langere gemiddelde en maximale (10% overleving) levensduur ^12.
• Voor extreme CR / honger, was de dag 3 stationaire fase cultuur (meestal 10 ml, zoals in stap 3 hierboven) met geautoclaveerd water (resuspendeer cellen in gelijke hoeveelheid water en spin neer op 2500 rpm gedurende 5 minuten, herhaal 3 keer). Incubationof cellen in water bootst de honger voorwaarde dat de gist kunnen tegenkomen in het wild. Om de twee dagen daarna, moet veroudering cultuur gewassen met geautoclaveerd water en opnieuw gesuspendeerd in gelijke hoeveelheid water die alle voedingsstoffen vrijkomen uit gelyseerde dode cellen te verwijderen. Voer levensvatbaarheid assay door bemonstering van de vergrijzing van de cultuur zoals hierboven beschreven. Deze toestand zal hongersnood leidde tot bijna een verdubbeling van de gemiddelde CLS in het wild type DBY746 stam ^12.

2. Ter plaatse levensvatbaarheid assay

In de vloeistof cultuur, een klein deel van de overlevende cellen kunnen de celcyclus opnieuw worden ingevoerd en te groeien gebruik te maken van de resterende voedingsstoffen of deze vrijgegeven vorm gelyseerd dode cellen in het medium, een fenotype genoemd hergroei / hijgend ^13. We ontwikkelden een levensvatbaarheid-op-een-plaat systeem dat de auxotrofie van de DBY746 stam (trp1) gebruikt voor het omzeilen van de hergroei / hijgend probleem en ook laat het testen van het effect van constante blootstelling of ontbering van verschillende externe stimuli voedingsstoffen of op gist CLS ^11. Deze in situ levensvatbaarheid assay bootst ook de replicatieve levensduur model zoals dat cellen voortdurend worden blootgesteld aan overvloedige voedingsstoffen voor de duur van de levensduur analyse.

1. Inoculeren een enkele kolonie in 1 ml synthetisch volledige glucose-medium (SDC) en incubeer overnacht met schudden (220 rpm) bij 30 ° C. Ten minste drie inoculums van onafhankelijke kolonies moeten worden voorbereid voor elke stam om de biologische replica's te bieden.
2. Laat de cultuur om te groeien tot ~ 10 ⁸ cellen / ml (OD ₆₀₀ = ~ 10), vul het culturewith geautoclaveerd water met 100-200 cell/10 ui (meestal 10 ^4-voudige verdunning) en 1.000 cells/10 il (10 ³ -voudige verdunning).
3. Bord twee aliquots van 10-30 ul van de verwaterde cultuur op een tryptofaan uitval SDC plaat. Voorr elke stam, bereiden een reeks van 8 tot 20 platen en geëtiketteerd overeenkomstig plating dichtheid (bv. 10 ^4-voudig verdund, plaat 10 ui of 10 ⁴ -10, 10 ⁴ -30, 10 ³ -10, 10 -30 ³ , enz.), die ervoor zorgen 10-100 kolonies kunnen worden geteld in afwachting van verminderde levensvatbaarheid tijdens het ouder worden.
4. Incubeer de plaat ingesteld op 30 ° C voor de duur van de levensduur analyse.
5. Op de dag van de beplating en om de 2 dagen daarna, verwijder een plaat en druppelsgewijs voeg 0,5 ml Tryptofaan (2 mg / ml), zodat levensvatbare cellen om te groeien. Incubeer de plaat bij 30 ° C voor extra 48-72 uur. Tel de CFU voor levensvatbaarheid op de dag van tryptofaan toevoeging. De CFU op de dag van plating wordt beschouwd als 100% overleving.

Variaties van in situ levensvatbaarheid test zijn onder meer:

• Leeftijd van cellen op agarplaten (extreme honger conditie). Voeg 1 ml 2x YPED in plaats van tryptofaan op de volgende dagen aan de groei en CFU tellen ¹⁴ mogelijk te maken.
• Leeftijd cellen op platen met tryptofaan uitval synthetisch complete medium met verschillende koolstofbronnen, zoals verschillende concentraties van glucose (calorie beperking door glucose beperking), diverse koolstofbronnen, zoals ethanol, glycerol, azijnzuur ^14. Voeg 1 ml glucose / tryptofaan-oplossing (20% glucose en 1mg/ml tryptofaan) om de groei en de CFU tellen mogelijk te maken.
• Andere voedingsstoffen manipulatie, zoals stikstof.

3. DNA-schade en mutatie frequentie tijdens chronologische veroudering

Canavanine weerstand (Can ^r) en CAN1 sequencing
Spontane mutatie frequentie kan worden geëvalueerd door het meten van de frequentie van de Canavanine weerstand (Can ^r) in chronologische veroudering culturen. Mutaties in het CAN1 (YEL063) gen, waarin het plasma arginine permease codeert, maken cellen resistent zijn tegen de arginine analoge L-canavanine.Can ^r kolonies verzameld op verschillende tijdstippen kunnen ook worden opgeslagen voor de extractie van genomisch DNA en de daarop volgende volgorde van de CAN1 gen, die kunnen zorgen voor mutaties spectrum van gegevens (met mutatie Surveyor, SoftGenetics).

Base substituties (Trp ⁺ terugslaan)

Stammen met trp1-289 bevatten, een amber mutatie (C403T) in de TRP1 coderende sequentie. Meting van de frequentie van trp1-289 tot Trp ⁺ reversion ¹⁵ maakt de schatting van de basis vervangen tarief tijdens de gist chronologische veroudering.

Frame-shift mutaties

De Leie ^- stam EH150 (Mata, lys2ΔBglII, trp1-Δ, his3-Δ200, ura3-52, ade2-1o) herbergt een lys2ΔBgl II mutatie die werd gebouwd door het invoegen van vier nucleotiden op een Bgl II restrictie-enzym site in de LYS2 gen te creëren . De resulterende +4 verschuiving in de open reading frame resulteert in auxotrofie voor lysine die kan worden omgekeerd door kleine insertie / deletie mutaties ^16-17.

Bruto chromosomale herschikkingen (GCRs)

Voor het detecteren van bruto chromosomale herschikkingen (GCRs) genereerden wij een mutante stam, waarin HXT13 (YEL069), dat codeert voor een zeer redundant hexose transporter, werd verstoord door een URA3 cassette ^18. HXT13 ligt 7,5 kb telomere te CAN1 op chromosoom V. Mutaties in zowel CAN1 en URA3 genen maken cellen weerstand tegen L-Canavanine en 5-fluoroorotic zuur (5FOA), respectievelijk. Gezien de lage frequentie van punt mutaties die optreden in beide genen, de analyse van de Can ^r 5FOA ^r frequentie geeft een schatting van GCRs die resulteren in het verlies van beide genen.

Homologe recombinatie en homeologous

Voor het bewaken van het niveau van de homologe (100%) en homeologous recombinatie (91%) tijdens de chronologische veroudering, we gegenereerd mutanten waarin gelineariseerde plasmiden (HIS3:: intron-IR-URA3) dragen ofwel 100% homoloog inverted repeats (IRS) (pSR406 ) of 91% homeologous IRS (pSR407) aan de HIS3 locus ^19. Recombinatie tussen de IRS kan de expressie van functionele HIS3 eiwit.

1. Parallel met de normale levensvatbaarheid assay (zoals hierboven beschreven), wordt een geschikte hoeveelheid van cellen van de veroudering cultuur,
   1. voor Can ^r mutatie, te beginnen met ~ 2x10 ⁷ cellen (200 ul van dag 3 cultuur);
   2. voor Trp ⁺ reversion, te beginnen met ~ 10 ⁸ cellen (500-1000 ul van dag 3 cultuur);
   3. voor de Lys ⁺ frame-shift mutatie, te beginnen met ~ 10 ⁸ cellen (500-1000 ul van dag 3 cultuur);
   4. voor GCRs, start met een 2-3x10 ⁸ cellen (2-3 ml van dag 3 cultuur);
   5. voor homologe recombinatie en homeologous, begin bij en tilde; 5x10 ⁷ cellen (200-500 ul van dag 3 cultuur);
   Pas de plating bedrag volgens de daling van de totale levensvatbaarheid en de toename van de mutatie frequentie tijdens chronologische veroudering (tabel 2). In het geval van stammen met hypermutator fenotype (zoals die met gebreken bij DNA-herstel), dienovereenkomstig te verminderen de bemonstering bedrag.
2. Pellet van de cellen met bench-top centrifuge machine (6000 rpm gedurende 5 minuten).
3. Resuspendeer cellen in 1 ml geautoclaveerd water, en pellet de cellen weer.
4. Resuspendeer cel pellet in 100 ui van het water. Plaat cellen,
   1. voor Can ^r mutatie, op arginine-dropout synthetisch compleet medium platen (SDC-Arg, aangevuld met 60 ng / ml L-Canavanine sulfaat);
   2. voor Trp ⁺ reversion, op tryptofaan-dropout platen (SDC-Trp);
   3. voor de Lys ⁺ frame-shift mutatie, op lysine-dropout platen (SDC-Lys);
   4. voor GCRs op arginine-dropout platen (SDC-Arg), aangevuld met 5FOA (1 mg / ml) en L-Canavanine sulfaat (60 ug / ml);
   5. voor homologe recombinatie en homeologous op histidine-dropout platen aangevuld met galactose (2%).
5. Count CFU's na 3-4 dagen incubatie bij 30 ° C. De mutatie frequentie wordt genormaliseerd naar het aantal levensvatbare cellen.

Aanvulling op de in situ levensvatbaarheid assay, leeftijd-afhankelijke Trp ⁺ reversion, Lys ⁺ frame-shift mutatie, recombinatie, of 'Can ^r kan ook worden bestudeerd in cellen jaar oud op de plaat.

1. Plaat-cellen (~ 10 ⁸ cellen / plaat) op Trp-, Lys-, His-uitval, of L-Canavanine synthetisch compleet medium platen (zoals hierboven beschreven).
2. Om de twee dagen (of op het tijdstip van belang), de score van de nieuwe opkomende koloniën.
3. Mutatie frequentie wordt geschat door het normaliseren van nieuwe opkomende koloniën aan het totale aantal levensvatbare cellen van het specifieke dag.

4. Translesie synthese (TLS)

De leeftijd-afhankelijke mutatie frequentie te verhogen kan betekenen verhoogde macromolecuul schade, verminderde cellulaire bescherming / reparatie, en de toegenomen foutieve DNA herstel (zoals Polζ-afhankelijke translesie synthese, TLS) bij het ouder worden. Bijvoorbeeld, de lange levensduur sch9 Δ mutanten vertonen verhoogde expressie van SOD2, en verminderde de expressie van de foutgevoelige DNA-reparatie-enzym Rev.1 ^20. Hier beschrijven we een test te combineren beschadigde DNA template en hele nucleaire extract om de TLS te evalueren in vitro.

1. Bereid kernextract zoals beschreven door Wang et al., ^21;. Kwantificeren de eiwitconcentratie door BCA assay (Pierce).
2. Voeg 0, 5, 10 of 20 ug van nucleaire extracten tot 50 ui (uiteindelijk volume) reacties met TLS buffer (20 mM HEPES, 7 mM _MgCl2, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 7,8), 200 μMdNTPs en 100 nm ^5'-32 P-gelabelde 12-mer primer (5'-TGG CGA TAC GGA-3 '), gegloeid om een 48-mer template met daarin DNA-schade van belang (5'-TCG ATA CTG GTA CTA ATG ATT AAC GAC TXA AGC ACG TCC GTA CCA TCG-3 ', waarin X is de aangetaste locatie, bijvoorbeeld abasic site, 8-oxo-G, etc.).
3. Incubeer het mengsel bij 30 ° C gedurende 30 min, beëindigen de reactie met de toevoeging van 2,5 ul EDTA (20 mm) en 2 pl proteinase K (10 mg / ml).
4. Zuiver DNA met fenol extractie en ethanol precipitatie.
5. Resuspendeer DNA in 50 ul van gel laadbuffer (98% formamide, 20 mM EDTA, en kleurstof).
6. Het oplossen van de translesie synthese producten op 19% polyacrylamide gels.
7. Kwantificeren van de TLS met phosphorimaging (figuur 1).

5. Representatieve resultaten

We meestal de CFU tellingen waren vroeger op dag 3 als 100 procent overleving in de standaard vloeistof CLS-analyse. Het percentage overleving in de volgende dagen kan worden uitgerust met het gemiddelde (50% overleving) te berekenen en maximum (10% overleving) levensduur ^12. Levensduur resultaten van de in situ levensvatbaarheid test zijn over het algemeen overeen met die welke met behulp van de vloeistof CLS-test, maar met verminderde de gemiddelde levensduur, die deels te wijten aan het feit dat cellen voortdurend worden blootgesteld aan voedingsstoffen. Aanwezigheid van glucose remt de activiteit van cellulaire bescherming toonde door de verminderde transactivatie van stress respons transcriptiefactor, zoals Msn2 / 4 en Gis1 ^12.

Leeftijdsafhankelijke mutatie frequentie is sterk afhankelijk van de stam achtergrond, genetische manipulatie, kweekomstandigheden, en leeftijd. Tabel 2 toont de typische resultaten die zijn verkregen in het wild-type stam (DBY746).

Bestanddeel	g / L
D-glucose	20
Ammoniumsulfaat	5
Basis van stikstof (-AS/-AA)	1.8
NaH2PO4	1.4
	mg / L
Adenine	80
L-Arginine	40
L-Asparaginezuur	100
L-Glutaminezuur	100
L-Histidine	80
L-Isoleucine	60
L-Leucine	120
L-Lysine	60
L-Methionine	80
L-Fenylalanine	60
L-Serine	400
L-Threonine	200
L-Tryptofaan	80
L-Tyrosine	40
L-Valine	150
Uracil	80

Tabel 1. Synthetic volledige glucose-medium, SDC (aanpassen aan pH 6.0 met NaOH). 4-voudige overmaat van histidine, zijn leucine, tryptofaan, en uracil opgenomen om het auxotrofie van de DBY746 stam te compenseren.

	Dag 3 (gemiddelde ± SEM)	Tot (gedurende het ouder worden)
Kunnen r	1.76 ± 0.12 x10 -6	6-8 x10 -6
Trp + reversion	6.60 ± 1.70 x10 -8	1,60 x10 -6
Lys + frame-shift mutatie	3.00 ± 0.78 x10 -8	0,70 x10 -6
GCRs	0.62 ± 0.10 x10 -8	0,30 x10 -6
Homologe recombinatie	5.55 ± 2.74 x10 -6	27,00 x10 -6
Homeologous recombinatie	0.12 ± 0.04 x10 -6	0,48 x10 -6

Tabel 2. Typische mutatie frequenties van wild-type cellen (DBY746) tijdens de chronologische veroudering.

Figuur 1. Resultaat van translesie synthese (TLS) ^20. Nucleaire extracten van 3 dagen oud, stationaire fase wild-type (DBY746) en sch9 Δ mutant cellen werden geïncubeerd met onbeschadigde of abasic site-DNA bevat sjablonen voor 30 min bij 30 ° C. TLS producten worden aangeduid met solide (met onbeschadigde template) of gestippeld (met beschadigde sjabloon) lijnen. Er was geen translesie synthese waargenomen in nucleaire uittreksel uit sch9 Δ mutanten. Gratis primers worden aangeduid met de open pijl.

Discussie

Vloeistof veroudering culturen ergens exposeren hergroei / hijgen fenotype ^13, die de CLS analyse bemoeilijkt. Hergroei treedt meestal op als er meer dan 90-99% van de bevolking heeft verloren levensvatbaarheid. Dit fenotype wordt vaak geassocieerd met een verhoogde oxidatieve stress en / of verminderd bescherming in de cel. Bijvoorbeeld, de frequentie van dit fenotype meer dan verdubbeld in cellen ontbreekt cytosolische superoxide dismutase en vermindert in de langlevende mutanten (bijv. sch9 Δ of ras2 Δ) of mutanten overexpressie superoxide dismutases ^22. In de praktijk, definiëren we hergroei als een toename van de levensvatbaarheid of stabilisatie van de levensvatbaarheid van 3 opeenvolgende bemonsteringen in de hoge sterfte tijdens de fase van chronologische veroudering.

Leeftijdsafhankelijke frequenties van de verschillende DNA-mutaties variëren sterk, afhankelijk van de stam achtergrond, genetische manipulatie, kweekomstandigheden, evenals hergroei / hijgen en extreem lage overleving. Pre-experimenten worden uitgevoerd op de tijdstippen, zoals de gemiddelde en maximale overleving met diverse plating dichtheid voor mutatieassays tot mutatie frequentie bereik te bepalen voordat performingthe full scale levensduur analyse. De wild-type stam moeten altijd worden opgenomen in een levensduur of mutatie frequentie studie parallel aan een behandeling of genetische mutant, zodanig dat inter-experiment-variaties kan worden verklaard. Meerdere biologische replica's moet worden opgenomen in de studie, en, zowel vloeibare als in situ levensvatbaarheid / mutatieassays moet worden uitgevoerd ter bevestiging van de resultaten.

In plaats van zich te concentreren op een specifiek type van de DNA-mutatie, profilering van leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit met behulp van meerdere testen in combinatie, kunnen licht werpen op specifieke DNA-schade en DNA-schadeherstel systeem (s) die bijdragen aan leeftijdsafhankelijke genomische instabiliteit. Bijvoorbeeld, is een aanzienlijke stijging van de bruto chromosomale herschikkingen (GCRs), vergeleken met die van andere DNA-mutaties, waargenomen in wild-type gist suggereert een elevationof dubbele draad te breken en / of een bijzondere waardevermindering in niet-homologe eind mee (NHEJ) tijdens gist chronologische veroudering (tabel 2). De CAN1 mutatie spectrum (sequencing van de CAN1 gen) verkregen in de wild-type veroudering gist stelde een verhoging van de oxidatieve schade tijdens chronologische veroudering en foutgevoelige DNA-herstel, en dat, in een lange levensduur sch9 Δ mutanten, minder oxidatieve DNA-schade en veel minder foutgevoelig translesie synthese waargenomen ^20.

Beschreven methoden hier kan verder worden besteed aan leeftijd-afhankelijke genomische instabiliteit te bestuderen. Zo kan bijvoorbeeld rustige en niet-latente cellen worden geïsoleerd uit gist stationaire-fase culturen met behulp van de dichtheid gradiënt methode beschreven door Allen et al.. ^23. In combinatie met de mutatie assays hier beschreven, hebben we gemeld dat een groot deel van leeftijd-afhankelijke mutaties ontstaat uit slapende cellen, in plaats van de te verdelen, beschadigde of apoptotische cellen ^20,24.