Detectie van histon Wijzigingen in bladeren

Samenvatting

Een betrouwbare en bruikbare benadering van de histon-modificaties op specifieke plantengenen te detecteren is beschreven. De aanpak combineert chromatine immunoprecipitatie (chip) en real-time kwantitatieve PCR. Het maakt de ontdekking van histon-modificaties op specifieke genen met een rol spelen in verschillende fysiologische processen.

Samenvatting

Chromatine structuur is belangrijk voor de regulatie van genexpressie in eukaryoten. In dit proces, chromatine remodeling, DNA methylatie, en covalente wijzigingen op de amino-terminale staarten van histonen H3 en H4 spelen een essentiële rol ^1-2. H3 en H4 histon-modificaties omvatten methylatie van lysine en arginine, acetylering van lysine, en de fosforylatie van serine residuen ^1-2. Deze wijzigingen zijn ofwel geassocieerd met gen-activering, repressie, of een gespannen toestand van het gen dat er meer snelle en robuuste activering van meningsuiting steunen na de waarneming van de juiste signalen (microbe-geassocieerde moleculaire patronen, licht, hormonen, etc.) ^3-7.

Hier presenteren we een methode voor de betrouwbare en gevoelige detectie van specifieke chromatine modificaties op geselecteerde plantengenen. De techniek is gebaseerd op de verknoping van de (gewijzigde) histonen en DNA met formaldehyde ^8,9, extractie en sonicatie van chromatine, chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met modificatie-specifieke antilichamen ^9,10, de-verknoping van histon-DNA complexen, en gen-specifieke real-time kwantitatieve PCR. De aanpak is nuttig gebleken voor het opsporen van specifieke histon modificaties geassocieerd met C ₄ fotosynthese in maïs ^5,11 en systemische immuniteit in Arabidopsis ^3.

Protocol

1. Verknoping van plantmateriaal

1. Oogst 1-2g van Arabidopsis bladeren (6 tot 10cm rozet diameter) in een 50 ml plastic buisje en vul tot 40 ml met de verknoping buffer.
2. Zorg ervoor dat bladeren blijven ondergedompeld, bijvoorbeeld door het vullen een op maat gemaakte filter spons recht boven buffer oppervlak. Plaats dan buizen in een exsiccator.
3. Vacuüm infiltreren voor 10min. Aan elke buis 2,5 ml toe te voegen van 2M glycine tot verknoping te stoppen en omkeren buizen op gelijke spreiding van glycine rechtvaardigen.
4. Vacuüm infiltreren voor een ander 5min en gooi vloeistof tijdens het oogsten bladeren op een zeef.
5. Was de bladeren tweemaal met 1 liter water in een bekerglas, dan droge bladeren grondig met papieren handdoeken.
6. Verzamel bladeren in een nieuwe plastic buis en vriezen in vloeibare stikstof. Bewaar vertrekt bij -80 ° C tot chromatine isolatie.

2. Isolatie van chromatine

1. Bladeren werden grond met mortel en stamper die in vloeibare stikstof bewaard tot gebruik.
2. Overdracht poeder om een ​​50-mL plastic buis en schorten 30 ml extractiebuffer # 1.
3. Incubeer 15 minuten bij 4 ° C op een overhead shaker.
4. Filtraat ophanging door middel van vier lagen van miracloth in een verse 50-mL plastic buis.
5. Spin voor 20min bij 2.800 xg bij 4 ° C.
6. Verwijder supernatant en schorten pellet met een kwast in 1 ml extractiebuffer # 2. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 2, en dan pellet te schorten met een kwast, en voeg vervolgens de rest van de buffer.
7. Overdracht vering om een ​​1,5 ml microfugebuis en spin voor 10min bij 12.000 xg bij 4 ° C.
8. Ondertussen bereiden 2 ml-microfugebuizen buisjes met 1,5 ml extractiebuffer # 3.
9. Verwijder het supernatans van de gesponnen buis (stap 2.7) en te schorten pellet in 300μL extractiebuffer # 3. Voeg eerst een klein volume van de buffer # 3, te schorsen pellet met een kwast, en voeg de resterende buffer.
10. Voorzichtig pipet de gesuspendeerde pellet (stap 2.9) op de top van de 1,5 mL extractiebuffer # 3 bereid in stap 2.8. Zorg ervoor dat de twee fasen zal niet mengen. Spin voor 1 uur bij 16.000 xg bij 4 ° C.
11. Verwijder supernatant en schorten chromatine pellet met een kwast in 300μL van ultrasoonapparaat buffer.
12. Sonificeer chromatine met een sonotrode, of in een ultrasoon bad, om een ​​DNA-grootte van ongeveer 400bp. Wanneer sonicating, zorg ervoor dat chromatine niet verwarmd boven ongeveer 30 ° C tot warmtegevoelige crosslinks te beschermen. De duur van ultrasoonapparaat moet experimenteel worden bepaald, omdat deze varieert aanzienlijk tussen verschillende ultrasoonapparaat apparaten. Voor begeleiding, zijn de instellingen voor twee verschillende apparaten op voorwaarde dat:

Voor ultrasoonapparaat met een Bandelin merk sonotrode bloot chromatine in 0,6 ml microfugebuis vijf keer tot 20 barst met instellingen 25% vermogen, cyclus = 50. Terwijl u dit doet, koele monster na iedere 20 ^ste barst in een ijsbad.

Voor ultrasoonapparaat met een Diagenode Bioruptor ultrasoonbad, vul bad met water en ijs en ultrasone trillingen tien keer gedurende 30 seconden in 1,5 ml microfuge tubes met het instellen van 'hoog'. Na elke 30 seconden, koele monsters voor nog eens 30 seconden.

13. Spin gesoniceerd steekproef voor 5 min bij 16.000 g bij 4 ° C voor het neerslaan van onopgelost materiaal. Het supernatant kan direct gebruikt worden voor de immunoprecipitatie. Als alternatief kan monsters shock ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Immunoprecipitatie

1. Bereid 2-mL microfugebuizen buisjes met 40μL proteïne-A agarose en 1.8mL van antilichaam-binding buffer. Voeg 200μL van het chromatine voorbereiding (stap 2,13).
2. Incubeer buizen voor 1 uur op een overhead shaker.
3. Gooi proteïne-A-agarose parels en te gebruiken voor het supernatant immunoprecipitatie.
4. Verwijderen van een 40μL-hoeveelheid aan chromatine concentratie ('input') te bepalen.
5. Voeg 30μL proteïne-A agarose en de hoeveelheid van wijziging-specifieke antilichaam dat wordt aangegeven in de onderstaande tabel van specifieke reagentia en apparatuur om 400μL gesoniceerd chromatine schorsing.
6. Incubeer 2.5u of 's nachts op een overhead-schudder bij 4 ° C.
7. Spin down kralen voor 2min op 440 x g.
8. Was kraal pellet met 900μL van elke wasbuffer (zie onderstaande lijst). Voor elke buffer, incubeer kralen in de buffer voor 10min op een overhead-schudder bij 4 ° C, dan draaien voor 2min op 440 xg, verwijder supernatant, en voeg de volgende buffer.
   1. Lage zout wasbuffer
   2. Hoog zoutgehalte wasbuffer
   3. LiCl wasbuffer
   4. TE wasbuffer
9. Na de laatste wasbeurt, volledig te verwijderen alle resterende buffer.

4. De-verknoping van histonen en DNA, en zuivering van DNA neergeslagen

1. Voeg 100μL van de-verknoping buffer naar de agarose pellet en de 40μl 'input' monster uit stap 3.4, mix voor 5min op een vortex-mixer, spin monsters, en incuBate bij 65 ° C gedurende de nacht.
2. Zuiver DNA met een commerciële DNA-of PCR zuivering kit.
3. Typisch 5μl van een 1:05 verdunning van de laatste kolom eluaat voldoende zijn om uit te voeren conventionele locus-specifieke real-time kwantitatieve RT-PCR (RT-qPCR).

5. Tabel van buffers

Verknoping buffer
Natriumbutyraat	10 mM
Sucrose	400mm
Tris-HCl, pH 8,0	10 mM
β-mercapto-ethanol	5mM
Formaldehyde	3% (v / v)

Extractiebuffer # 1
Natriumbutyraat	10 mM
Sucrose	400mm
Tris-HCl, pH 8,0	10 mM
β-mercapto-ethanol	5mM
Compleet proteaseremmer	1x

Extractiebuffer # 2
Natriumbutyraat	10 mM
Sucrose	250mm
Tris-HCl, pH 8,0	10 mM
β-mercapto-ethanol	5mM
MgCl 2	10 mM
Triton X-100	1% (w / v)
Compleet proteaseremmer	1x

Extractiebuffer # 3
Natriumbutyraat	10 mM
Sucrose	1.7M
Tris-HCl, pH 8,0	10 mM
β-mercapto-ethanol	5mM
MgCl 2	2 mM
Triton X-100	0,15% (w / v)
Compleet proteaseremmer	1x

Ultrasoonapparaat buffer
Tris-HCl, pH 8,0	25MM
EDTA-NaOH, pH 8,0	5mM
SDS	0,5% (w / v)
Compleet proteaseremmer	1x

Antilichaambinding buffer
Tris-HCl, pH 8,0	50 mM
EDTA-NaOH, pH 8,0	1 mM
NaCl	150mm
Triton X-100	0,1% (w / v)

Lage zout wasbuffer
NaCl	150mm
SDS	0,1% (w / v)
Triton X-100	1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0	2 mM
Tris-HCl, pH 8,0	20MM

Hoog zoutgehalte wasbuffer
NaCl	500mm
SDS	0,1% (w / v)
Triton X-100	1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0	2 mM
Tris-HCl, pH 8,0	20MM

LiCl wasbuffer
Lithiumchloride	250mm
Nonidet-P40	1% (v / v)
Natrium desoxycholaat	1% (w / v)
EDTA-NaOH, pH 8,0	1 mM
Tris-HCl, pH 8,0	20MM

TE wasbuffer
EDTA-NaOH, pH 8,0	10 mM
Tris-HCl, pH 8,0	1 mM

Decrosslinking buffer
Tris-HCl, pH 6,8	62,5 mm
NaCl	200MM
SDS	2% (w / v)
DTT	10 mM

6. Representatieve resultaten:

Expressie van de Arabidopsis thaliana PR2 verdediging gen dat codeert voor een β-1,3-glucanase met antimicrobiële activiteit ^12, werd geïnduceerd door benzothiadiazole (BTH), een synthetisch analoog van het plantenhormoon salicylzuur ^3. Figuur 1 toont aan dat activatie van PR2 expressie geassocieerd is met een toename van de acetylering van lysine residuen op histon H3 en H4 op de PR2 promotor. Sinds nucleosoom dichtheid afneemt tijdens gen activatie ^13, werden histonacetylering waarden genormaliseerd voor het signaal verkregen met een antilichaam tegen een invariant gebied van histon 3.

Figuur 1 BTH induceert histonacetylering op de PR2 promotor in Arabidopsis. Planten werden behandeld met 100 urn BTH of een spuitpoeder controle. Na 72h, werden bladeren verzameld en chromatine werd geïsoleerd. Het signaal verkregen na precipitatie met acetylering-specifieke antilichamen (zoals aangegeven in de figuur) werd genormaliseerd om het signaal verkregen door precipitatie met een antilichaam tegen een invariant domein van histon H3. Neergeslagen chromatine werd gekwantificeerd door RT-qPCR. De gegevens zijn gestandaardiseerd voor histon-eiwitten niveaus in de afwezigheid van BTH behandeling.

Discussie

Meest kritische stappen in het protocol zijn de verknoping van DNA en histonen, de soort en hoeveelheid van bladmateriaal, slijpen van het materiaal, en de sonicatie van chromatine. Voor een meer gedetailleerde bespreking van deze onderwerpen, zie refs. 9 en 10.

Sonicatie en verknoping:

Het is belangrijk om chromatine te verstoren tijdens de sonicatie om fragmenten van ongeveer 400bp. Uitputtend sonicatie zal vernietigen chromatine door het verstoren van DNA en histonen, overwegende dat onvoldoende sonicatie zal verlaten lang chromatine fragmenten. Deze invloed op de specificiteit van de methode, omdat histonmodificaties distaal van de onderzochte locus kan niet worden gediscrimineerd van lokale aanpassingen. Sonicatie efficiency is het beste getest door het verzamelen van 20μL chromatine van de monsters voor en na sonicatie, de-crosslinking DNA en histonen, het isoleren van het DNA en het bepalen van de lengte van het geschoren DNA door agarose gelelektroforese. RNAse moet worden toegevoegd aan de monsters voor elektroforese, want het chromatine voorbereiding nog steeds bevat grote hoeveelheden RNA in dit stadium van zuivering die kunnen interfereren met de visualisatie van gefragmenteerd DNA. De monsters zijn handig voor het chromatine immunoprecipitatie als DNA van niet-geschoren chromatine langer is dan 10kbp, terwijl DNA van geknipte chromatine vormt een uitstrijkje met een maximale intensiteit van het signaal rond 400bp van DNA.

We routinematig gebruik van 3% (v / v) voor formaldehyde chromatine verknoping in intact laat, maar 1% (v / v) formaldehyde kan voldoende zijn in de meeste gevallen. In onze handen, een lage formaldehyde-concentraties zorgen voor kortere ultrasoonapparaat tijden en achtergrond signalen in consequent PCR-reacties. Echter, onvoldoende hoeveelheden formaldehyde resulteren vaak in lage reproduceerbaarheid van de PCR-signaal tussen onafhankelijke experimenten. Dit kan te wijten zijn aan onvoldoende penetratie van bladeren met formaldehyde bij lage concentraties. Zorg ervoor dat u uw formaldehyde voorraad vaak wisselen als de verbinding heeft de neiging om te polymeriseren met de tijd. Formaldehyde-oplossingen zijn stabiel slechts voor ongeveer een maand, en deze periode is nauwelijks verlengd met methanol stabilisatie. Het is aan te raden om verschillende concentraties formaldehyde-test bij het opzetten van experimentele omstandigheden.

Hoeveelheid plantaardig materiaal en slijpen:

Het is belangrijk om kleine hoeveelheden van bladmateriaal infiltreren in een groot volume van de buffer aan de bladeren aan elkaar plakken te voorkomen. Blad kleven resulteert vaak in onvoldoende infiltratie van formaldehyde. Bovendien zal te veel plantmateriaal blokkeren poriën van de miracloth weefsel. Het slijpen rendement is sterk afhankelijk van het gebruik van een mortier en een stamper met de perfecte pasvorm. We routinematig slijpen met een vloeibare stikstof gekoelde stamper en vijzel in de afwezigheid van extra vloeibare stikstof drie keer voor 50 seconden totdat het materiaal wordt gemalen tot een fijn poeder.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Eiwit-A-Agarose	Roche	11 134 515 001	hangt af van het antilichaam klasse
Eiwit-G-Agarose	Roche	11 243 233 001	hangt af van het antilichaam klasse
Anti-hyperacetyl-H4	Millipore	06-946	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H4K5	Millipore	07-327	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H4K8	Millipore	07-328	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H4K12	Millipore	07-595	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H4K16	Millipore	07-329	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H4K18	Millipore	07-354	gebruikten we 1μL
Anti-acetyl-H3K9	Millipore	07-352	gebruikten we 5μL
Anti-acetyl-H3K14	Millipore	07-353	gebruikten we 1μL
Anti-trimethyl-H3K4	Diagenode	PAB-003-50	gebruikten we 5μL
Anti-dimethyl-H3K4	Millipore	07-030	gebruikten we 5μL
Anti-monomethyl-H3K4	Abcam	ab8895	2,5-10μL
Anti-H3	Abcam	ab1791	gebruikten we 1μL om histon dichtheid controleren
Bioruptor	Diagenode	UCD-200 AAN
Sonotrode MS72	Bandelin
Miracloth	Calbiochem	475855
Compleet proteaseremmer	Roche	11836145001