Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

13.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3123

⸱

28 juli 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Mechanical and Aerospace Engineering, The Ohio State University, 3Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 4Dept. of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een methode beschreven om levende pathogenen individueel te selecteren, te manipuleren en te beelden met behulp van een optische pincet gekoppeld aan een spinning disk-microscoop. De optische pincet biedt ruimtelijke en temporele controle over de organismen en plaatst deze naast gastheercellen. Fluorescentiemicroscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van de cellen.

Samenvatting

Dynamische live-cell imaging maakt directe visualisatie mogelijk van real-time interacties tussen cellen van het immuunsysteem1, 2; echter heeft het gebrek aan ruimtelijke en temporele controle tussen de fagocytische cel en de microbe het lastig gemaakt om gerichte observaties te doen van de initiële interacties van de gastheerrespons op pathogenen. Historisch gezien zijn intercellulaire contactgebeurtenissen zoals fagocytose3 in beeld gebracht door twee celtypen te mengen en vervolgens continu het gezichtsveld te scannen om toevallige intercellulaire contacten in het juiste stadium van interactie te vinden. De stochastische aard van deze gebeurtenissen maakt dit proces moeizaam, en het is met deze benadering moeilijk om vroege of vluchtige gebeurtenissen in cel-celcontact te observeren. Deze methode vereist het vinden van celparen die op het punt staan contact te maken, om ze vervolgens te observeren tot ze hun contact voltooien, of juist niet. Om deze beperkingen aan te pakken, maken wij gebruik van optische trapping als een niet-invasieve, niet-destructieve, maar snelle en effectieve methode om cellen in kweek te positioneren.

Optische vallen, of optische pincetten, worden steeds vaker ingezet in biologisch onderzoek om cellen en andere micron-grote deeltjes in drie dimensies vast te leggen en fysiek te manipuleren4. Stralingsdruk werd voor het eerst waargenomen en toegepast in optische pincet-systemen in 19705, 6, en werd voor het eerst gebruikt om biologische monsters te controleren in 19877. Sindsdien zijn optische pincetten uitgegroeid tot een technologie om een verscheidenheid aan biologische fenomenen te onderzoeken8-13.

We beschrijven een methode14 die live cell imaging verbetert door een optische pincet te integreren met spinning disk confocale microscopie met temperatuur- en vochtigheidscontrole, om een uitstekende ruimtelijke en temporele controle over pathogene organismen in een fysiologische omgeving te bieden, zodat interacties met gastheercellen naar wens van de operator kunnen worden gefaciliteerd. Levende, pathogene organismen zoals Candida albicans en Aspergillus fumigatus, die potentieel dodelijke, invasieve infecties kunnen veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen15, 16 (bijv. patiënten met AIDS, chemotherapie en organtransplantaties), werden optisch gevangen met behulp van niet-destructieve laserintensiteiten en verplaatst naar de nabijheid van macrofagen, die de pathogeen kunnen fagocyteren. Movies met een hoge resolutie, gebaseerd op doorgelaten licht en fluorescentie, bevestigden de mogelijkheid om vroege gebeurtenissen van fagocytose in levende cellen waar te nemen. Om de brede toepasbaarheid binnen de immunologie aan te tonen, werden ook primaire T-cellen gevangen en gemanipuleerd om synapsen te vormen met anti-CD3-gecoate microsferen in vivo, waarbij tevens time-lapse imaging van de synapsvorming werd verkregen. Door een methode te bieden voor fijne ruimtelijke controle van levende pathogenen ten opzichte van immuuncellen, kunnen cellulaire interacties worden vastgelegd via fluorescentiemicroscopie met minimale verstoring van de cellen, wat krachtige inzichten kan opleveren in de vroege responsen van de aangeboren en adaptieve immuniteit.

Protocol

1. Kweekomstandigheden van pathogenen voor optische vangen

  1. Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) op een semi-vaste agar media met SBD (Sabouraud dextrose) bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
  2. Grow C. albicans (SC5314) in YPD (Gist-Peptone Dextrose) vloeibare cultuur met 100 ug / ml ampicilline 's nachts in een shaker incubator bij 30 ° C.

2. De voorbereiding van pathogenen voor TL-etikettering

  1. Oogst gewenste hoeveelheid ziektekiemen en over te dragen aan een 1,5 mL reactie buis.
  2. Voeg 300 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) de reactie buis.
  3. Sonificeer mengsel gedurende 30 seconden.
  4. Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
  5. Aspireren supernatant, waardoor pellet ongestoord.
  6. Herhalen (2,4) en (2,5) nog twee keer.
  7. Resuspendeer in 500μL van PBS.

3. Etikettering van pathogenen met een fluorescerende kleurstof

  1. Los 1 mg kleurstof van belang (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 pi dimethylformamide (DMF) (concentratie van 10 mg / ml).
  2. Voeg 3 ul van kleurstof mengsel reactie buisjes met gewassen ziekteverwekkers.
  3. Draaien of schudden monster op 37 ° C gedurende 1 uur.
  4. Was monster met PBS 3X door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
  5. Resuspendeer in 300 ul PBS.

4. Oogsten T-cellen uit volbloed

  1. Verkrijgen van volbloed (vers).
  2. Warm bloed, PBS + 2% foetaal bovine serum (FBS), en histopaque tot kamertemperatuur.
  3. Voeg RosetteSep Human CD4 + T-cel Verrijking Cocktail op 50 ul / ml volbloed.
  4. Draai monster en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Verdunnen monster met een gelijk volume van PBS + 2% FBS en meng voorzichtig.
  6. Laag verdunde monster op de top van histopaque, het minimaliseren van het mengen van
  7. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur met de rem af.
  8. Verwijder de verrijkte cellen.
  9. Was de verrijkte cellen 2x met PBS + 2% FBS-oplossing.
  10. Lyse rode bloedcellen gedurende 2 minuten met een rode bloedcellen lyserende buffer
  11. Voeg 10 ml PBS + 2% FBS en centrifugeer gelyseerde rode bloedcellen bij 1500 rpm gedurende 5 minuten
  12. Aspireren supernatant, Pas op dat u de pellet te verstoren
  13. Resuspendeer in IMDM media met 10% foetaal runderserum

5. De voorbereiding van RAW 264,7 macrofagen in de kamer dia's

  1. Bereid DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) tot 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 1% L-glutamine bevatten.
  2. Warm media, trypsine, en PBS in warme bad tot 37 ° C.
  3. Was de plaat 2x met PBS
  4. Aspireren PBS tussen elke wasbeurt.
  5. Voeg 5 ml trypsine tot op het bord naar de oppervlakte te dekken (voor een 10 cm weefselkweek plaat).
  6. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
  7. Zachtjes klop kant van de plaat om cellen van plaatoppervlak los te maken. Wees niet te trypsine splash buiten van de plaat.
  8. Voeg 5 ml of equivalente hoeveelheid media trypsine.
  9. Aspireren mengsel in een reageerbuis.
  10. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten.
  11. Aspireren media, Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
  12. Resuspendeer in 10 ml media.
  13. Voeg 400 ul van media om elke kamer van de kamer schuiven.
  14. Voeg 5 pi van celsuspensie aan elke kamer.
  15. Groeien 's nachts in de broedstoof bij 37 ° C met 5% CO 2.

6. Toevoeging van pathogenen te proeven

  1. Pipetteer 5-10 pi van gelabelde pathogenen van belang (van stap 1-3) in de kamer.
  2. Meng goed door pipetteren op en neer, Zorg ervoor dat u de bodem van de kamer raken om de macrofagen gehandeld verstoren.

7. Het laden van monster op draaiende schijf confocale microscoop (in video, scannen door middel van onderdelen)

  1. Schakel alle componenten om draaiende schijf confocale microscoop.
  2. Lijn microscoop voor DIC imaging.
  3. Verwijder de kamer dia uit incubator.
  4. Plaats de kamer glijden in gespecialiseerde podium.
  5. Verwijder de bovenkant van de kamer slide (nodig voor DIC imaging).

8. Voorbereiding voor optische trapping (in video-, scan door middel van onderdelen en de manier waarop het is geïntegreerd in de microscoop)

  1. Zet de sluiter voor optische val.
  2. Zet IR-laser.
  3. Open sluiter (de laser) naar optische val.
  4. Bevestig de sluiter voor IR laser wordt afgesloten door de controle met IR-kaart.

9. Selectie en manipulatie van een ziekteverwekker met optische val

  1. Focus op macrofagen op gehandeld dia.
  2. Zoek ziekteverwekkers vrij fluctuerende in oplossing grenzend aan macrofagen.
  3. Verplaats stadium zodanig dat de ziekteverwekker is in de buurt van de val.
  4. Open sluiter en schakel de val.
  5. Verhuizen monster op macrofagen in contact te brengen met de stationaire trapped ziekteverwekker.
  6. Afbeelding met draaiende schijf confocale microscoop, hetzij in DIC, fluorescentie, of een combinatie van beide. Doorgaans wordt trapping gedaan in DIC, en real-time beeldvorming wordt gedaan met fluorescentie.

10. Representatieve resultaten:

Uit te oefenen volledige ruimtelijke en temporele controle van pathogenen en kralen in een in vivo en in vitro omgeving, hebben we een custom-built trapping apparaat geïntegreerd op een draaiende schijf confocale microscoop (schematisch weergegeven in Fig. 1). Op volle sterkte, de laser die 350 mW vermogen en na het koppelen van het licht met de verschillende optische componenten in de optische val apparaat, ~ 80 mW vermogen op de TIRF doelstelling, zoals gemeten met een power meter, werd gebruikt om de val formulier in de kamer.

Om een ​​object in de kamer ten opzichte van het object gevangen positie, was het toneel verplaatst terwijl de gevangen object stationair met het vangen laser. Het podium werd verplaatst langzaam genoeg snelheden, zodat de weerstand kracht op de gevangen deeltjes niet de maximale vangst van kracht overschrijden.

Afzonderlijke populaties van C. albicans (typische grootte - ~ 5 micrometer) werden gemerkt met elk van de drie kleuren (AF488, AF568, en AF647, hetgeen overeenkomt met groen, blauw en rood in de figuur, respectievelijk) om beeldvorming te illustreren met meerdere kanalen fluorescentie tegelijkertijd optisch het vangen van de ziekteverwekker. Een enkele C. albicans werd gevangen en verplaatst in een vierkant patroon door middel van een cluster van andere gist, zoals aangegeven door grijze pijlen, waaruit de mogelijkheid om vast te leggen en te manipuleren de specifieke locatie van een enkel pathogeen gekozen door de exploitant, zelfs in een drukke omgeving (Fig. 2A) .

Om te illustreren verder de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormen morfologiën tentoongesteld door pathogene organismen val, de optische pincet was ook in staat om vast te houden en situeren een C. albicans deeltje met een pseudohyphae. De C. albicans gelabeld met AF647 (rood) was bewogen langs een traject zoals geschetst door de witte pijl en geplaatst naast de fluorescerende GFP-LC3-RAW-cellen (Fig. 2B). De gist deel van de C. albicans werd gevangen als de pseudohyphae getrokken langs.

We hebben ook gepositioneerd Aspergillus fumigatus naast een RAW-muis macrofaag cel in om de absolute tijdsbestek van fagocytose te analyseren met deze specifieke cellijn en pathogeen (Fig. 3A). Zodra de ziekteverwekker in contact komt met de cel, is de val uitgezet, en time-lapse imaging wordt gebruikt voor de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen waarnemen (Fig. 3B). De optische val werd ook gebruikt om de primaire T-cellen geïsoleerd uit het bloed vast te leggen en naast doorverwezen naar parels gecoat met anti-CD3 antilichaam in zodat de T-cel naar een immunologische synaps met de kraal (afb. 4) vormen, tonen de extra veelzijdigheid om direct vangen en te manipuleren immuuncellen.

Figuur 1
Figuur 1. Overzicht en schema van gecombineerde optische val en draaiende schijf confocale microscoop setup. Instrument lay-out met de trapping balk (paars), verlichting pad voor helderveld beeldvorming (oranje), fluorescentie excitatie balk (rood), fluorescentie-emissie (groen), charge-coupled device (CCD) camera, elektron-vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EM- CCD) camera, dichroïsche spiegels (D1 en D2), spiegels (M1 en M2), en lenzen (L1, L2, L3, L4). Alle andere onderdelen van de trap-confocale microscoop systeem zijn geëtiketteerd in de figuur.

Figuur 2
Figuur 2. (A) Fluorescentie beelden van gevangen en gemanipuleerd C. albicans. Een gevangen fluorescent-gelabelde (Alexa Fluor 488 (AF488), blauw) organisme in een gebied van andere fluorescent gelabelde C. albicans (AF568, groen en AF647, rood). Het podium is verplaatst van de gevangen, blauwe CA deeltje zoals aangegeven door de grijze pijlen. (B) Trapped pseudo-hyfen vorm van C. albicans naast GFP-LC3 RAW cel. Fluorescent gelabelde psuedohyphal vorm van CA (rood, AF647) optisch opgesloten en verhuisde grenzend aan GFP-LC3 uitgedrukt RAW macrofagen. De CA organisme wordt verplaatst langs het traject, zoals aangegeven door de witte pijl.

Figuur 3
Figuur 3. Trapping en positionering van A. fumigatus naast een fagocytaire RAW cel. (A) Helderveld beelden van een gevangen A. fumigatus, zoals aangegeven door de witte pijl, verplaatst en gepositioneerd langs het pad, zoals aangegeven door de rode pijl. De gevangen pathogeen is enigszins onscherp te wijten aan de val te duwen het organisme iets boven het brandvlak. A. fumigatus wordt verplaatst totdat het grenst geplaatst om de gewenste RAW cel. (B) grieporescence beeldvorming van fagocytose van A. fumigatus met RAW cel. Nadat de gevangen pathogeen is naast een RAW-cel geplaatst, is de fagocytose proces geactiveerd. Op 30 s, het membraan van de RAW-cel begint te veranderen en een beker te vormen rond het deeltje. Op 60 s, is de beker volledig gevormd. Van jaren '90 tot 150s, de A. fumigatus is verzwolgen, en door 180 s, het deeltje volledig geïnternaliseerd

Figuur 4
Figuur 4. Trapping primaire T-cel synaps vormen met anti-CD3 gecoate kralen. DIC beelden van een primaire T-cel ontroerd door de optische val naar een positie naast een kraal gecoat met anti-CD3 antilichaam. De cel vormt dan een immunologische synaps, die niet gemakkelijk te onderscheiden zijn in de beelden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk gebruiken we een optische val om pathogenen met afmetingen tussen 3 μm - 5 μm te vangen. Hoewel de pathogenen waarin ons laboratorium geïnteresseerd is doorgaans deze afmetingen hebben, is het hier beschreven optische pincetsysteem flexibel genoeg om een breed scala aan groottes te vangen. Optische vallen zijn inderdaad gebruikt om deeltjes te vangen variërend van enkele atomen tot cellen met een diameter van ongeveer 10 μm. Bovendien was dit optische vangsysteem in staat om deeltjes van verschillende vormen ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenverstrengeling gemeld.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door interne fondsen van de afdeling Geneeskunde van het Massachusetts General Hospital (J.M.T., M.K.M, M.L.C., J.M.V.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering beurs T32EB006348 (C.E.C.), het ontwikkelingsfonds van het Center for Computational and Integrative Biology van het Massachusetts General Hospital en AI062773 (R.J.H.), beurzen AI062773, DK83756 en DK 043351 (R.J.X.), NSF 0643745 (M.J.L.), NIH R21CA133576 (M.J.L.), en het National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) van de National Institutes of Health (NIH) AI057999 (J.M.V.). We danken Nicholas C. Yoder voor behulpzame discussies en Charles Felts (RPI, Inc.) voor technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A. fumigatusAlbino stam, B-5233/RGD12-8, gift van K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicansSSY50-B mutant, gift van Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 stam, gift van Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488InvitrogenA20000
Alexa Fluor 647InvitrogenA20006
dimethylformamideSigma-AldrichD4551
Vers bloedGift van R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon omgekeerde microscoopNikon InstrumentsModel Ti-E
Trapping laser, ChromaLaseBlue Sky ResearchCLAS-106-STF02-02
Fluorescentie-excitatielaserCoherent Inc.Model Innova 70C
Breadboards voor trapping-componentenThorlabs Inc.MB1224, MB1218
Optische luchttafelTechnical Manufacturing Corp.
Elektronische sluiter met pedaalbedieningUniblitzAangekocht bij Vincent Associates, Rochester, NY
Single-mode optische vezelOz OpticsPMJ-3S3S-1064-6
VezelpositioneerderThorlabs Inc.PAF-X-5-C
VezelcollimatorOz OpticsHPUCO-23-1064-P-25AC
Lenzen voor telescoopThorlabs Inc.AC254-150-BBrandpuntsafstand van 150 mm
Translatiepodia (x, y, z)Newport Corp.M-461-XYZ
IR-dichroïsche spiegelChroma Technology Corp.ET750-sp-2p8
Objectief (100X)Nikon InstrumentsNA = 1.49, olie-immersie, TIRF-objectief
Confocale kopYokogawaCSU-XI
PolarisatorNikon InstrumentsMEN51941
Wollaston-prismaNikon InstrumentsMBH76190
EM-CCD cameraHamamatsu Corp.C9100-13
CCD-camera (ORCA ER)Hamamatsu Corp.C4742-80-12AG
FilterwielLudl99A353
FilterwielSutter Instrument Co.LB10-NWE
Dekglas met kamerLab-Tek155409
DynabeadsInvitrogen111-51DGecoat met anti-CD3
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Invitrogen10313
Penicilline/streptomycineInvitrogen15140-122
L-glutamineInvitrogen25030-081
Foetaal runderserum (HyClone)Thermo Fisher Scientific, Inc.SH30071.03

Referenties

  1. Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
  2. Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
  3. Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
  4. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  5. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
  6. Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
  7. Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
  8. Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
  9. Khalil, A. S. Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
  10. Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
  11. Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
  12. Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
  13. Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
  14. Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
  15. Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Optische trappingspinning disk confocale microscopieobservatie van fagocytosemanipulatie van pathogeneninteractie met macrofagenCandida albicansAspergillus fumigatusT-celsynaps
Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.