Het gebruik van een optische val voor de Studie van gastheer-pathogeen interacties voor Dynamic live cell imaging

Summary

Er wordt een methode beschreven om afzonderlijk levende pathogenen te selecteren, te manipuleren en te beeldvormen met behulp van een optische val gekoppeld aan een spinning disk microscoop. De optische val biedt ruimtelijke en temporele controle van organismen en plaatst ze naast gastheercellen. Fluorescerende microscopie legt dynamische intercellulaire interacties vast met minimale verstoring van cellen.

Abstract

Dynamische live cell imaging maakt directe visualisatie van real-time interacties mogelijk tussen cellen van het immuunsysteem^{1, 2}; echter, het ontbreken van ruimtelijke en temporele controle tussen de fagocytische cel en microbe heeft gerichte observaties van de initiële interacties van de gastheersrespons op pathogenen moeilijk gemaakt. Historisch gezien zijn intercellulaire contactgebeurtenissen zoals fagocytose³ gevisualiseerd door twee celtypen te mengen en vervolgens continu het gezichtsveld te scannen om toevallige intercellulaire contacten in het juiste interactiestadium te vinden. De stochastische aard van deze gebeurtenissen maakt dit proces vervelend, en het is moeilijk om vroege of voorbijgaande gebeurtenissen in cel-cel contact door deze benadering te observeren. Deze methode vereist het vinden van celparen die op het punt staan contact te maken en ze te observeren totdat ze hun contact voltooien, of niet. Om deze beperkingen aan te pakken, gebruiken we optische vangsten als een niet-invasieve, niet-destructieve, maar snelle en effectieve methode om cellen in cultuur te positioneren.

Optische vallen, of optische pincetten, worden steeds meer gebruikt in biologisch onderzoek om cellen en andere micrometergrote deeltjes in drie dimensies vast te leggen en fysiek te manipuleren⁴. Stralingsdruk werd voor het eerst waargenomen en toegepast op optische pincetsystemen in 1970^{5, 6}, en werd voor het eerst gebruikt om biologische specimens in 1987⁷ te besturen. Sindsdien zijn optische pincetten uitgegroeid tot een technologie om een verscheidenheid aan biologische fenomenen te onderzoeken^8-13.

We beschrijven een methode¹⁴ die live cell imaging verbetert door een optische val te integreren met spinning disk confocale microscopie met temperatuur- en vochtigheidscontrole om exquise ruimtelijke en temporele controle van pathogene organismen in een fysiologische omgeving te bieden om interacties met gastheercellen mogelijk te maken, zoals bepaald door de operator. Levende, pathogene organismen zoals Candida albicans en Aspergillus fumigatus, die potentieel dodelijke, invasieve infecties kunnen veroorzaken bij immuungecompromitteerde individuen^{15, 16} (bijv. AIDS, chemotherapie en orgaantransplantatiepatiënten), werden optisch gevangen met behulp van niet-destructieve laserintensiteiten en naast macrofagen bewogen, die het pathogeen kunnen fagocyteren. Hoge resolutie, getransmitteerde licht- en fluorescentie-gebaseerde films toonden de mogelijkheid om vroege gebeurtenissen van fagocytose in levende cellen te observeren. Om de brede toepasbaarheid in immunologie aan te tonen, werden ook primaire T-cellen gevangen en gemanipuleerd om synapsen te vormen met anti-CD3 gecoate microsferen in vivo, en time-lapse beeldvorming van synapsevorming werd ook verkregen. Door een methode te bieden om fijne ruimtelijke controle uit te oefenen op levende pathogenen ten opzichte van immuuncellen, kunnen cellulaire interacties worden vastgelegd door fluorescentiemicroscopie met minimale verstoring van cellen en kunnen krachtige inzichten opleveren in vroege reacties van aangeboren en adaptieve immuniteit.

Protocol

1. Kweekomstandigheden van pathogenen voor optische vangen

1. Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) op een semi-vaste agar media met SBD (Sabouraud dextrose) bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
2. Grow C. albicans (SC5314) in YPD (Gist-Peptone Dextrose) vloeibare cultuur met 100 ug / ml ampicilline 's nachts in een shaker incubator bij 30 ° C.

2. De voorbereiding van pathogenen voor TL-etikettering

1. Oogst gewenste hoeveelheid ziektekiemen en over te dragen aan een 1,5 mL reactie buis.
2. Voeg 300 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) de reactie buis.
3. Sonificeer mengsel gedurende 30 seconden.
4. Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
5. Aspireren supernatant, waardoor pellet ongestoord.
6. Herhalen (2,4) en (2,5) nog twee keer.
7. Resuspendeer in 500μL van PBS.

3. Etikettering van pathogenen met een fluorescerende kleurstof

1. Los 1 mg kleurstof van belang (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 pi dimethylformamide (DMF) (concentratie van 10 mg / ml).
2. Voeg 3 ul van kleurstof mengsel reactie buisjes met gewassen ziekteverwekkers.
3. Draaien of schudden monster op 37 ° C gedurende 1 uur.
4. Was monster met PBS 3X door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
5. Resuspendeer in 300 ul PBS.

4. Oogsten T-cellen uit volbloed

1. Verkrijgen van volbloed (vers).
2. Warm bloed, PBS + 2% foetaal bovine serum (FBS), en histopaque tot kamertemperatuur.
3. Voeg RosetteSep Human CD4 + T-cel Verrijking Cocktail op 50 ul / ml volbloed.
4. Draai monster en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verdunnen monster met een gelijk volume van PBS + 2% FBS en meng voorzichtig.
6. Laag verdunde monster op de top van histopaque, het minimaliseren van het mengen van
7. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur met de rem af.
8. Verwijder de verrijkte cellen.
9. Was de verrijkte cellen 2x met PBS + 2% FBS-oplossing.
10. Lyse rode bloedcellen gedurende 2 minuten met een rode bloedcellen lyserende buffer
11. Voeg 10 ml PBS + 2% FBS en centrifugeer gelyseerde rode bloedcellen bij 1500 rpm gedurende 5 minuten
12. Aspireren supernatant, Pas op dat u de pellet te verstoren
13. Resuspendeer in IMDM media met 10% foetaal runderserum

5. De voorbereiding van RAW 264,7 macrofagen in de kamer dia's

1. Bereid DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) tot 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 1% L-glutamine bevatten.
2. Warm media, trypsine, en PBS in warme bad tot 37 ° C.
3. Was de plaat 2x met PBS
4. Aspireren PBS tussen elke wasbeurt.
5. Voeg 5 ml trypsine tot op het bord naar de oppervlakte te dekken (voor een 10 cm weefselkweek plaat).
6. Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
7. Zachtjes klop kant van de plaat om cellen van plaatoppervlak los te maken. Wees niet te trypsine splash buiten van de plaat.
8. Voeg 5 ml of equivalente hoeveelheid media trypsine.
9. Aspireren mengsel in een reageerbuis.
10. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten.
11. Aspireren media, Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
12. Resuspendeer in 10 ml media.
13. Voeg 400 ul van media om elke kamer van de kamer schuiven.
14. Voeg 5 pi van celsuspensie aan elke kamer.
15. Groeien 's nachts in de broedstoof bij 37 ° C met 5% CO _2.

6. Toevoeging van pathogenen te proeven

1. Pipetteer 5-10 pi van gelabelde pathogenen van belang (van stap 1-3) in de kamer.
2. Meng goed door pipetteren op en neer, Zorg ervoor dat u de bodem van de kamer raken om de macrofagen gehandeld verstoren.

7. Het laden van monster op draaiende schijf confocale microscoop (in video, scannen door middel van onderdelen)

1. Schakel alle componenten om draaiende schijf confocale microscoop.
2. Lijn microscoop voor DIC imaging.
3. Verwijder de kamer dia uit incubator.
4. Plaats de kamer glijden in gespecialiseerde podium.
5. Verwijder de bovenkant van de kamer slide (nodig voor DIC imaging).

8. Voorbereiding voor optische trapping (in video-, scan door middel van onderdelen en de manier waarop het is geïntegreerd in de microscoop)

1. Zet de sluiter voor optische val.
2. Zet IR-laser.
3. Open sluiter (de laser) naar optische val.
4. Bevestig de sluiter voor IR laser wordt afgesloten door de controle met IR-kaart.

9. Selectie en manipulatie van een ziekteverwekker met optische val

1. Focus op macrofagen op gehandeld dia.
2. Zoek ziekteverwekkers vrij fluctuerende in oplossing grenzend aan macrofagen.
3. Verplaats stadium zodanig dat de ziekteverwekker is in de buurt van de val.
4. Open sluiter en schakel de val.
5. Verhuizen monster op macrofagen in contact te brengen met de stationaire trapped ziekteverwekker.
6. Afbeelding met draaiende schijf confocale microscoop, hetzij in DIC, fluorescentie, of een combinatie van beide. Doorgaans wordt trapping gedaan in DIC, en real-time beeldvorming wordt gedaan met fluorescentie.

10. Representatieve resultaten:

Uit te oefenen volledige ruimtelijke en temporele controle van pathogenen en kralen in een in vivo en in vitro omgeving, hebben we een custom-built trapping apparaat geïntegreerd op een draaiende schijf confocale microscoop (schematisch weergegeven in Fig. 1). Op volle sterkte, de laser die 350 mW vermogen en na het koppelen van het licht met de verschillende optische componenten in de optische val apparaat, ~ 80 mW vermogen op de TIRF doelstelling, zoals gemeten met een power meter, werd gebruikt om de val formulier in de kamer.

Om een ​​object in de kamer ten opzichte van het object gevangen positie, was het toneel verplaatst terwijl de gevangen object stationair met het vangen laser. Het podium werd verplaatst langzaam genoeg snelheden, zodat de weerstand kracht op de gevangen deeltjes niet de maximale vangst van kracht overschrijden.

Afzonderlijke populaties van C. albicans (typische grootte - ~ 5 micrometer) werden gemerkt met elk van de drie kleuren (AF488, AF568, en AF647, hetgeen overeenkomt met groen, blauw en rood in de figuur, respectievelijk) om beeldvorming te illustreren met meerdere kanalen fluorescentie tegelijkertijd optisch het vangen van de ziekteverwekker. Een enkele C. albicans werd gevangen en verplaatst in een vierkant patroon door middel van een cluster van andere gist, zoals aangegeven door grijze pijlen, waaruit de mogelijkheid om vast te leggen en te manipuleren de specifieke locatie van een enkel pathogeen gekozen door de exploitant, zelfs in een drukke omgeving (Fig. 2A) .

Om te illustreren verder de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormen morfologiën tentoongesteld door pathogene organismen val, de optische pincet was ook in staat om vast te houden en situeren een C. albicans deeltje met een pseudohyphae. De C. albicans gelabeld met AF647 (rood) was bewogen langs een traject zoals geschetst door de witte pijl en geplaatst naast de fluorescerende GFP-LC3-RAW-cellen (Fig. 2B). De gist deel van de C. albicans werd gevangen als de pseudohyphae getrokken langs.

We hebben ook gepositioneerd Aspergillus fumigatus naast een RAW-muis macrofaag cel in om de absolute tijdsbestek van fagocytose te analyseren met deze specifieke cellijn en pathogeen (Fig. 3A). Zodra de ziekteverwekker in contact komt met de cel, is de val uitgezet, en time-lapse imaging wordt gebruikt voor de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen waarnemen (Fig. 3B). De optische val werd ook gebruikt om de primaire T-cellen geïsoleerd uit het bloed vast te leggen en naast doorverwezen naar parels gecoat met anti-CD3 antilichaam in zodat de T-cel naar een immunologische synaps met de kraal (afb. 4) vormen, tonen de extra veelzijdigheid om direct vangen en te manipuleren immuuncellen.

Figuur 1. Overzicht en schema van gecombineerde optische val en draaiende schijf confocale microscoop setup. Instrument lay-out met de trapping balk (paars), verlichting pad voor helderveld beeldvorming (oranje), fluorescentie excitatie balk (rood), fluorescentie-emissie (groen), charge-coupled device (CCD) camera, elektron-vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EM- CCD) camera, dichroïsche spiegels (D1 en D2), spiegels (M1 en M2), en lenzen (L1, L2, L3, L4). Alle andere onderdelen van de trap-confocale microscoop systeem zijn geëtiketteerd in de figuur.

Figuur 2. (A) Fluorescentie beelden van gevangen en gemanipuleerd C. albicans. Een gevangen fluorescent-gelabelde (Alexa Fluor 488 (AF488), blauw) organisme in een gebied van andere fluorescent gelabelde C. albicans (AF568, groen en AF647, rood). Het podium is verplaatst van de gevangen, blauwe CA deeltje zoals aangegeven door de grijze pijlen. (B) Trapped pseudo-hyfen vorm van C. albicans naast GFP-LC3 RAW cel. Fluorescent gelabelde psuedohyphal vorm van CA (rood, AF647) optisch opgesloten en verhuisde grenzend aan GFP-LC3 uitgedrukt RAW macrofagen. De CA organisme wordt verplaatst langs het traject, zoals aangegeven door de witte pijl.

Figuur 3. Trapping en positionering van A. fumigatus naast een fagocytaire RAW cel. (A) Helderveld beelden van een gevangen A. fumigatus, zoals aangegeven door de witte pijl, verplaatst en gepositioneerd langs het pad, zoals aangegeven door de rode pijl. De gevangen pathogeen is enigszins onscherp te wijten aan de val te duwen het organisme iets boven het brandvlak. A. fumigatus wordt verplaatst totdat het grenst geplaatst om de gewenste RAW cel. (B) grieporescence beeldvorming van fagocytose van A. fumigatus met RAW cel. Nadat de gevangen pathogeen is naast een RAW-cel geplaatst, is de fagocytose proces geactiveerd. Op 30 s, het membraan van de RAW-cel begint te veranderen en een beker te vormen rond het deeltje. Op 60 s, is de beker volledig gevormd. Van jaren '90 tot 150s, de A. fumigatus is verzwolgen, en door 180 s, het deeltje volledig geïnternaliseerd

Figuur 4. Trapping primaire T-cel synaps vormen met anti-CD3 gecoate kralen. DIC beelden van een primaire T-cel ontroerd door de optische val naar een positie naast een kraal gecoat met anti-CD3 antilichaam. De cel vormt dan een immunologische synaps, die niet gemakkelijk te onderscheiden zijn in de beelden.

Discussion

In dit werk gebruiken we een optische val om pathogenen met afmetingen tussen 3 μm - 5 μm te vangen. Hoewel pathogenen die interessant zijn voor ons lab typisch deze afmetingen hebben, is het optische pincetsysteem dat hier wordt beschreven flexibel om een ​​groot aantal groottes te vangen. Inderdaad, optische vallen zijn gebruikt om deeltjes te vangen variërend van enkele atomen tot cellen van ongeveer 10 μm in diameter. Bovendien was dit optische vangprincipe in staat om deeltjes van verschillende vormen te vangen: ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
A. fumigatus			Albino stam, B-5233/RGD12-8, geschenk van K.J. Kwon-Chung, NIH
C. albicans			SSY50-B mutant, geschenk van Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 stam, geschenk van Gerald Fink, Whitehead Institute
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A20000
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A20006
dimethylformamide	Sigma-Aldrich	D4551
Frisch bloed			Geschonk van R.J.W. Heath, MGH, HMS
Nikon omgekeerde microscoop	Nikon Instruments		Model Ti-E
Tapping laser, ChromaLase	Blue Sky Research	CLAS-106-STF02-02
Fluorescentie-excitatilaser	Coherent Inc.		Model Innova 70C
Printplaten voor tappingcomponenten	Thorlabs Inc.	MB1224, MB1218
Optische luchttafel	Technical Manufacturing Corp.
Elektronische sluiter met pedaalbediening	Uniblitz		Gekocht bij Vincent Associates, Rochester, NY
Singlemode optische vezel	Oz Optics	PMJ-3S3S-1064-6
Vezelpositioner	Thorlabs Inc.	PAF-X-5-C
Vezelcollimator	Oz Optics	HPUCO-23-1064-P-25AC
Lenzen voor telescoop	Thorlabs Inc.	AC254-150-B	Brandpuntsafstand van 150 mm
Translatietafels (x, y, z)	Newport Corp.	M-461-XYZ
IR dichroisch spiegel	Chroma Technology Corp.	ET750-sp-2p8
Objectieflens (100X)	Nikon Instruments		NA = 1.49, olie-immersie, TIRF-objectief
Confocale kop	Yokogawa	CSU-XI
Polarisator	Nikon Instruments	MEN51941
Wollaston-prisma	Nikon Instruments	MBH76190
EM-CCD-camera	Hamamatsu Corp.	C9100-13
CCD-camera (ORCA ER)	Hamamatsu Corp.	C4742-80-12AG
Filterwiel	Ludl	99A353
Filterwiel	Sutter Instrument Co.	LB10-NWE
Chambered dekglas	Lab-Tek	155409
Dynabeads	Invitrogen	111-51D	Gecoat met anti-CD3
Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM)	Invitrogen	10313
Penicilline/streptomycine	Invitrogen	15140-122
L-glutamine	Invitrogen	25030-081
Foetaal bovien serum (HyClone)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	SH30071.03