Subcutane toediening van muscarine antagonisten en Triple-Immunokleuring van de Levator Auris longus in Muizen

Samenvatting

We beschrijven de procedures voor de herhaalde toediening van remmers van muscarine-signalering naar de levator Auris longus (LAL) spier van jong volwassen muizen en voor de daaropvolgende immunokleuring van de neuromusculaire verbindingen (NMJs) in wholemounts. De LAL spier heeft unieke voordelen voor het openbaren van In vivo Farmacologische effecten op de NMJs.

Samenvatting

Achterste ledematen spieren van knaagdieren, zoals de gastrocnemius en de m. tibialis anterior, worden vaak gebruikt voor in vivo farmacologische studies van de signalen essentieel voor de vorming en instandhouding van zoogdieren NMJs. Echter, drugs penetratie in deze spieren na subcutane of intramusculaire toediening is vaak onvolledig of oneffen en vele NMJs kunnen blijven onaangetast. Hoewel de systemische toediening met apparaten zoals mini-pompen kunnen het verbeteren van de spatiotemporele effecten, kan het invasieve karakter van deze aanpak leiden tot verwarrende ontstekingsreacties en / of directe spierschade. Bovendien is het volledige analyse van de NMJs in een achterste ledematen spier een uitdaging, want het vereist tijdrovende serie snijden en uitgebreide immunokleuring.

De muis LAL is een dunne, vlakke plaat van de spieren oppervlakkig gelegen op het dorsale gedeelte van de nek. Het is een fast-twitch spier die functies te bewegen de oorschelp. Het bevat rostrale en caudale delen die afkomstig zijn van de middellijn van de schedel en uit te breiden zijdelings aan de kraakbenige gedeelte van elk oorschelp. De spier wordt geleverd door een tak van de nervus facialis die caudaal projecten dat uit de stylomastoid foramen. Wij en anderen hebben gevonden LAL naar een geschikte preparaat dat voordelen voor het onderzoek van zowel korte als lange termijn in vivo effecten van drugs op NMJs en spieren aanbiedingen zijn. De eerste, de oppervlakkige ligging maakt meerdere lokale toepassingen van drugs onder lichte narcose. Ten tweede, de dunheid (2-3 lagen van spiervezels) staat visualisatie en analyse van bijna alle NMJs binnen de spier. Ten derde, het gemak van ontleden met zijn zenuw intact, samen met het patroon van de innervatie vergunningen aanvullende elektrofysiologische analyse in vitro ^9,5. Laatste, en misschien wel het allerbelangrijkste, een klein toegepaste volume (~ 50μl) dekt met gemak de hele spier oppervlak, zorgt voor een uniforme en langdurige blootstelling van al haar NMJs om het geneesmiddel en elimineert de noodzaak voor een systemische benadering ^1,8.

Protocol

1. Subcutane toediening van muscarine acetylcholine receptor (mAChR) antagonisten

1. Bereiden onder aseptische omstandigheden de juiste dosis van mAChR antagonist, (cf. tabel) door het oplossen van het geneesmiddel in steriele fysiologische zoutoplossing in 1,5 ml reactie buis. De volgende antagonisten werden gebruikt: atropine, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
2. Teken 50μl van de oplossing in a1cc insulinespuit en gebruik een aparte spuit voor elke muis. Ook voorbereiden spuiten met fysiologisch zout alleen voor elke muis in de controle groep. Blijven spuiten op ijs pas klaar om te injecteren.
3. Verdoven muizen met ketamine-xylazine cocktail (120 mg / kg ketamine, 8 mg / kg xylazine) Controleer voor de juiste verdoving diepte door het observeren van het gebrek aan reactie op knijpen teen.
4. Na een goede sedatie, scheren haar met betrekking tot de rostrale regio van het hoofd naar de caudale regio van de nek, veeg de resterende haar weg met 70% ethanol.
5. Plaats de muis onder stereomicroscoop, en steek de naald parallel aan LAL spieren tijdens het omhoog te trekken licht op de naald van de spuit (afb. 1A, B). Dit zorgt ervoor dat de naald wordt ingebracht in bovenliggende bindweefsel en niet direct schade aan de LAL spier zelf. Steek de naald, zodat het uiteinde dekt de caudale aspect van de LAL spier.
6. Heel langzaam beginnen te oplossing te injecteren in de juiste LAL spier, terwijl intrekking van de spuit, de totale injectie tijd moet ongeveer 1 minuut. Als dit goed wordt geïnjecteerd, moet de oplossing vormen een 'koepel', dat is ongeveer 1 cm in diameter, in de bovenliggende huid die zal blijven gedurende ten minste een uur. Een uniform geïnjecteerde oplossing betrekking op de gehele rostrale en caudale regio van de juiste LAL spier.
7. Herhaal de procedure om de 12 uur gedurende 1 tot 7 dagen. Voor andere studies1, gebruikten we hetzelfde protocol te injecteren groeifactoren elke 12 uur gedurende maximaal 21 dagen. Geen abnormale respons waargenomen van muizen toegediend met anesthesie 2x per dag gedurende maximaal 21 dagen.

2. Dissectie van LAL spieren

1. Euthanaseren muizen met een overdosis natriumpentobarbital (390 mg / kg). De dood is verzekerd door beoordeling van het gebrek van de hartslag na een thoracotomie wordt uitgevoerd.
2. Vastpinnen de muis in een dissectie schaal-, rug-kant naar boven met een pin in elke poot en een pin door de neus.
3. Maak de eerste incisie door de huid alleen met behulp van kleine lente schaar te snijden langs de linkeroever LAL uit de regio net proximaal van het oor naar de regio rond de linker schouderblad.
4. Verwijder voorzichtig de huid in deze regio, maar vermijd het snijden te dicht bij de rechter oor als deze is een van de bevestigingspunten voor de juiste LAL spier.
5. Zoek de centraal geplaatste vetweefsel strook van lipide over de middellijn, op het oppervlakkige oppervlak van het hoofd, waar de rechter en linker LAL spieren te voldoen. Met behulp van kleine lente een schaar, knip 1 cm aan de rechterkant van het vetweefsel (in de richting van het linker oor) van de proximale rand van de linker LAL spier tot het bereiken van de schouder (Fig. 1C).
6. Nadat de incisie wordt gemaakt, schil de rug van de juiste LAL spier met kleine tang aan de ventrale zijde van de spier bloot te leggen. Trim het bindweefsel en de fascia terwijl zorgvuldig omhoog te trekken aan de rechterkant LAL spier met een pincet (Fig. 1C).
7. Snijd rond het caudale einde van de juiste LAL aan de basis van het oor. Blijven snijden, op weg naar de rostrale einde van het rechteroor, het bijhouden van de juiste LAL omgedraaid (afb. 1C).. Het is beter om meer weefsel ten deze stap is dan het risico beschadiging van de LAL zelf. Als de spier begint te drogen, pipet 1X PBS over de spier.
8. Plaats ontleed recht LAL in 30mm cultuur Sylgard schotel met 1X PBS-, rug-kant naar boven. Vastpinnen vier de hoeken van de spier met kleine insect pinnen.
9. Met kleine tang en de lente schaar, schone bindweefsel van de dorsale en ventrale oppervlak van de juiste LAL spier. Draai de spieren om en re-pin, om schoon te buikoppervlakte. 2-3 spieren kunnen worden geplaatst in dezelfde 30mm schotel.

3. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 1

1. Voor het begin van immunokleuring, bereiden alle benodigde reagentia. 1X PBS, 2% boviene serumalbumine BSA) / PBS, 0,1 M glycine in 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS, en 4% paraformaldehyde (PFA) in 1X PBS nodig zal zijn. Pre-cool methanol in -20 ° C vriezer.
2. Laat LAL spieren gespeld in de schotel dorsale zijde tijdens dit proces. Gooi 1X PBS-oplossing en voeg genoeg 4% (PFA) om de spier te dekken. Plaats schaal op shaker ingesteld op snelheid 2 of 3 voor 20 minuten. Tenzij anders vermeld, dient de schotel worden geplaatst op een shaker voor de volgende stappen.
3. Weggooien 4% PFA en was de spier met 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk.
4. Gooi laatste 1X PBS wassen en 0,1 M Glycine toe te voegen in 2% BSA / PBS-oplossing voor 30 '.
5. Gooi 0,1 Glycine-oplossing eend toe te voegen 1X PBS met rhodamine geconjugeerde α-bungarotoxin bij een concentratie van 1:200 voor de 15 '.
6. Gooi α-bungarotoxin oplossing weg en was spier in 1X PBS, 3 maal 10 'per stuk.
7. Permeabilize weefsel door het toevoegen van pre-cooled methanol en plaats de schaal in de -20 ° C vriezer voor precies 5 minuten, geen schudden nodig.
8. Verwijder de methanol en was drie keer 10 'elk met 1X PBS. Gooi laatste wassen en te blokkeren weefsel met 0,2% Triton X-100 in 2% BSA / PBS gedurende 1 uur. Het wassen en het blokkeren van stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.
9. 'S nachts Incubeer de spieren, beven, bij 4 ° C in een cocktail van primaire antilichamen verdund in de blockingbuffer (cf. tabel).

4. Triple immunokleuring van LAL NMJs: Dag 2

1. Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'elk op kamertemperatuur.
2. Voeg cocktail van secundaire antilichamen in het blokkeren van oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (cf. tabel). De spieren moeten beschermd worden tegen het licht van deze stap verder naar foto-bleken van Alexa Fluor 647-fluorescentie te voorkomen.
3. Was de spieren in 1X PBS 3 keer, 10 'per stuk.
4. Veeg eventueel resterende bindweefsel in 1X PBS, snijd de laterale grenzen van de LAL spieren en monteren op dia's dorsale kant naar boven, met behulp van glazen cover-slips en montage media. Gebruik duidelijke nagellak te dekken slip in plaats veilig te stellen.
5. Bescherm dia's van licht en bewaar bij -20 ° C tot aan analyse.

5. Confocale beeldvorming van LAL NMJs

1. Hoge-resolutie confocale beelden worden verkregen met een Leica Apo Plan 63x olie doelstelling (1.4NA) op een Leica TCS 4D confocale microscoop.
2. Fluoresceïne en Alexa 647 signalen werden tegelijkertijd gescand met een laser-lijnen 488 nm (Argon, 488 nm, 20 mW) en 633 nm (HeNe, 633 nm, 10 mW), respectievelijk. Sequentieel, is Rhodamine signaal vervolgens gescand met de laserlijn 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Optische secties werden verzameld bij 0,3 micrometer intervallen en het aantal beelden in de z-plane varieerde 60 tot 80. De pinhole wordt aangepast aan een Airy (107,97 um). Het beeld formaat 1024 x 1024 (X, Y), met een zoom factor van 1, bij 400Hz snelheid resulteert in een beeldgrootte van 234.32 x 234.32 um um en de pixelgrootte van 229,05 nm x 229,05 nm.
3. Leica TCS-NT acquisitie software wordt vervolgens gebruikt om z-serie beelden te reconstrueren tot maximale intensiteit projecties.
4. Multipanel beelden worden aangepast voor de helderheid en het contrast met behulp van Adobe Photoshop.
5. Voor een typische LAL spier, moet men in staat zijn om ongeveer 75 tot 100 en face NMJs te analyseren. Synaptische stabiliteit wordt bepaald door kenmerken zoals ruimtelijke afstemming van pre-, peri-en postsynaptische elementen (dat wil zeggen, zenuw-, Schwann-cellen en spieren), en metingen van synaptische gebied (dat wil zeggen, synaps grootte).

Representatieve resultaten:

Bij de volwassen zoogdieren NMJ, een enkele motor axon gaat in fijne takken die zeer gedifferentieerde cilinders van een zenuw klem (afb. 2, Green) vormen op een enkele spiervezel, juist apposed aan de postsynaptische clusters van nicotinezuur AChRs (Fig. 2; Rood) . Perisynaptically, terminal Schwann-cellen goed voor alle takken van presynaptische zenuwuiteinden (afb. 2, Blauw). De structurele en functionele integriteit van deze tripartiete organisatie wordt ernstig verstoord door de dagelijkse toepassing van de subtype-specifieke mAChR remmers. In het voorbeeld hier gepresenteerde (afb. 3), 4-DAMP, een mAChR antagonist met een hoge affiniteit voor M1, M3, M4 en M5 mAChR subtypes, roept selectieve eliminatie van zenuwuiteinden uit talrijke NMJs de hele spier oppervlak (Fig. 3B, C). Daarnaast terminal Schwann-cellen zijn abnormaal latente ^8, zoals blijkt uit heldere S100 etikettering zonder proces extensie (Fig. 3B ", 3C"). Postsynaptically, spiervezels zijn normaal en er is geen verlies van nAChRs (Fig. 3B ", 3C ').

Figuur 1. Anatomische locatie en de organisatie van de LAL spier. Locatie van de rostrale (rLAL), caudaal (cLAL), en de LAL zenuw (LALn) en de bijbehorende eindplaat banden worden weergegeven (A, inzet). De locatie en oriëntatie van de naald ten opzichte van de LAL spier wordt getoond voor de injectie procedure (B). Incisie punten worden weergegeven voor de dissectie procedure (C).

Figuur 2. Tripartiete organisatie van de NMJ. High-vergroting confocale opvattingen van een muis NMJ. Een enkele axon gaat in fijne takken klem (A), stevig onder de terminal Schwann-cellen en hun processen (A ', sterretjes punt klem Schwann cellichamen). Postsynaptically in een spier vezel, is een cluster van nicotine AChRs precies apposed aan de takken van de zenuw termisignalen en terminal Schwann-cellen.

Figuur 3. LAL spieren die behandeld worden met 4-DAMP, een mAChR antagonist. Lage en hoge vergroting confocale opvattingen van LAL spieren die werden behandeld met het voertuig of 4-DAMP. In tegenstelling tot de auto-behandelde spier (A-A'''), talrijke NMJs in de 4-DAMP-behandelde spier gebrek zenuwuiteinden (B-B''', C-C'''). Een omkaderde gebied in Figuur 2B is ingezoomd figuur 2C.

Discussie

De methode maakt hier gepresenteerde onderzoek van niet eerder opgenomen rollen van subtype-specifieke mAChR signalering in de stabiliteit en het onderhoud van zoogdieren NMJs. Deze methode zal ook nuttig zijn om de effecten van neurotrofe factoren en farmacologische stoffen te testen. Bijvoorbeeld: ons laboratorium bleek dat ciliaire neurotrofe Factor (CNTF) veroorzaakte ontspruit uit bijna alle LAL zenuwuiteinden in volwassen muizen 1 . Dit resultaat in contrast met eerdere studies van CNTF behandelde achterste...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
ketamine	Hospira	NDC0409-2051-05	Dosis: 120mg/kg
xylazine	Lloyd Laboratories	LA33806	Dosis: 8mg/kg
atropine	Sigma-Aldrich	A0132	(> 98% zuiverheid); Dosis: 0.2mg/kg - 20mg/kg
atropine	Voigt Global Distribution	AT105	Farmaceutische kwaliteit
Methoctramine	Sigma-Aldrich	M105	Dosis: 100 - 400M
4-DAMP	Sigma-Aldrich	D142	Dosis: 2.5mg/kg
AFDX-116	Tocris Bioscience	1105	250M
AFDX-384	Tocris Bioscience	1345	50M - 500M
MT 7	Peptiden International	PMT-4340-s	0,1 M - 1M
1X fosfaat gebufferde zoutoplossing, pH 7,4	Invitrogen	10010049
Paraformaldehyde	Visser	T353-500	Maak 10% oplossing eerst door het oplossen van 10g/100mL gedeïoniseerd gedistilleerd water, maak 4% met 1X PBS, de pH instellen op 7,4
Natrium pentobarbitol	Virbac Animal Health	NDC-051311-050-01	Dosis: 390mg/kg
Sylgard	Dow Corning	Part # 184	Volg de instructies die bij kit, kunnen meerdere grote cultuur schotel te gebruiken (30mm, 60mm, 100mm), afhankelijk van de behoeften
0,1 M Glycine	Sigma-Aldrich	G-7126	Voeg 0.185g aan 25ml van 2% BSA / PBS
2% Bovine serum albumine (2% BSA)	Sigma-Aldrich	A3059-100g	Los 2g BSA in 100 ml 1X PBS
0,2% Triton X100 in 2% BSA / PBS (Blocking Buffer)	Sigma-Aldrich	T9284-100ml	Los 0.2ml/100mL 2% BSA / PBS
α-bungarotoxin	Invitrogen	T1175	Het gebruik bij een concentratie van 1:200
SMI-312	Sternberger monoklonalen	SMI312	Het gebruik bij een concentratie van 1:1000
SV2	Developmental Studies Hybridoma Bank	SV2-Supernatant	Het gebruik bij een concentratie van 1:10
S100	Dako	Z0311	Het gebruik bij een concentratie van 1:400
FITC-geit anti-muis lgG1	Roche	03117731001	Het gebruik bij een concentratie van 1:200, maar als achtergrond hoog is, probeer dan 1:400
Alexa Fluor 647-geconjugeerd geit anti-konijn	Invitrogen	A21244	Het gebruik bij een concentratie van 1:200
Vectashield fluorescerende montage media	Vector laboratoria	H-1000	Dit is geen hard-set media, moet u het dekglas met heldere nagellak te beveiligen.
Kleine Spring Schaar	Fijn Science Tools	15002-08
Dissection pincet	Fijn Science Tools	11295-51