Een In vivo Imaging-protocol om de primaire sensorische axonen volgende achterwortelganglia verpletteren monitor is beschreven. De procedures maken gebruik van wide-field fluorescentie microscopie en thy1-YFP transgene muizen, en staan herhaalde beeldvorming van regeneratie van axonen meer dan 4 cm in de PNS en axon interacties met de interface van het CZS.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Live-Imaging van de dorsale wortel Axonen na Rhizotomy
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De primaire sensorische axonen gewond door spinale wortel verwondingen niet te regenereren in het ruggenmerg, wat leidt tot chronische pijn en blijvende zintuiglijke verlies. Regeneratie van dorsale wortel (DR) axonen in het ruggenmerg wordt voorkomen op de dorsale wortel entry zone (DREZ), de interface tussen het centrale zenuwstelsel en PNS. Ons begrip van de moleculaire en cellulaire gebeurtenissen die regeneratie te voorkomen op DREZ is onvolledig, deels omdat complexe veranderingen die gepaard gaan met een zenuwbeschadiging zijn afgeleid uit post-mortem analyses. Dynamische cellulaire processen, zoals regeneratie van axonen, worden het best bestudeerd met technieken die real-time gebeurtenissen met meerdere waarnemingen van ieder levend dier te vangen. Ons vermogen om neuronen te controleren serieel in vivo is dramatisch toe als gevolg van revolutionaire innovaties in de optica en de muis genetische manipulatie. Verscheidene lijnen van thy1-GFP transgene muizen, waarin de subsets van neuronen genetisch zijn geëtiketteerd in verschillende fluorescerende kleuren, maken individuele neuronen af te beelden in vivo 1. Deze muizen zijn uitgebreid gebruikt voor in vivo beeldvorming van de hersenen de spieren 2-4 en 5-7, en hebben nieuwe inzichten in de fysiologische mechanismen die statische analyses niet konden hebben opgelost. Beeldvormend onderzoek van neuronen in het ruggenmerg wonen nog maar kort geleden begonnen. Lichtman en zijn collega's voor het eerst gedemonstreerd op hun haalbaarheid door het bijhouden van gewonde dorsale kolom (DC) axonen met een wide-field microscopie 8,9. Multi-foton in vivo beeldvorming van diep gepositioneerd DC axonen, heeft microglia en bloedvaten ook bereikt 10. In de afgelopen jaren, hebben wij de pioniers bij de toepassing van in vivo beeldvorming tot regeneratie van axonen DR gebruik van wide-field microscopie en H lijn van thy1-YFP muizen monitor. Deze studies hebben geleid tot een nieuwe hypothese over de reden waarom DR axonen worden verhinderd regenereren in het ruggenmerg 11.
In H lijn van thy1-YFP muizen, zijn te onderscheiden YFP + axonen oppervlakkig geplaatst, die het mogelijk maakt meerdere axonen tegelijk worden gecontroleerd. We hebben geleerd dat DR axonen te komen tot DREZ beter worden afgebeeld in de lumbale dan in cervicale ruggenmerg. In dit rapport beschrijven we een aantal strategieën die we hebben gevonden nuttig om een succesvolle lange termijn en herhaalde beeldvorming van regenererende axonen DR verzekeren. Deze omvatten methoden die herhaald intubatie en respiratoire onderbreking elimineren, minimaliseren van de operatie-geassocieerde stress en littekenvorming, en het verwerven van een stabiele beelden op hoge resolutie zonder fototoxiciteit.
Protocol
1. Microscoop set-up en imaging voorbereiding
- Onze beeldvorming set up bestaat uit een Leica MZ16 fluorescerende stereomicroscoop met een snelle sluiter en een gekoelde CCD-camera bestuurd door Metamorph software.
- Bereid een thermostatisch geregelde verwarming pad en aan te passen vermogen tot 32,5 ° C te houden van het dier lichaamstemperatuur tijdens en na de operatie.
- Warm steriele Ringer-oplossing of kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) tot 32,5 ° C bij voorbaat voor de irrigatie van het ruggenmerg tijdens de operatie.
- Verdoven het dier met een intraperitoneale injectie van xylazine (8 mg / kg) en ketamine (120 mg /....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Imaging DR regeneratie direct in levende muizen vormt een bijzondere uitdaging, omdat het een substantiële dorsale laminectomie nodig heeft om axongroei monitoren over een groot gebied, gevolgd door meerdere invasieve chirurgische en anesthetische procedures in de daaropvolgende beeldvorming sessies. Verschillende strategieën geholpen om deze uitdagingen te overwinnen. De eerste, succesvolle beeldvormend onderzoek vereist het verminderen van de muis de mortaliteit (circa 25%) door het minimaliseren van de duur van de an.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. Alan Tessler voor commentaar en redactionele hulp. Dit werk werd ondersteund door NIH NS062320.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogus nummer | Reacties |
| H lijn thy1-YFP (2-4 maanden oud, zowel mannen als vrouwen) | Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injectie, steriele oplossing) | Lloyd Laboratories, (Shenandoah, LA) | 4811 | 8 mg / kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injectie, USP) | Hospira, Inc (Lake Forest, IL) | 2051 | 120 mg / kg |
| Buprenorfine (Buprenex injecteerbare) (0,05 mg / kg) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc (Richmond, VA) | 7571 | |
| Kleine dieren tondeuses | Oster Professional, (McMinnville, TN) | 76059-030 | |
| Ontharen lotion | Church & Dwight Co (Princeton, NJ) | NAIR met babyolie | |
| Gaas sponzen | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 22-362-173 | |
| Wattenstaafje swabs | Fisher Scientific, (Pittsburgh, PA) | 14-960-3Q | |
| 1 ml spuiten | Becton, Dickson and Company Franklin Lakes, New Jersey) | 309602 | |
| Subcutane (Sub-Q) naalden, 26ga. | Becton, Dickson en Company (Franklin Lakes, New Jersey) | 305115 | |
| Spring schaar en pincet | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | ||
| 2,5-mm gebogen rongeurs | Fine Science Tools, (Foster City, CA) | 16221-14 | |
| Ringer-Lactaat injectie USP | B. Braun Medical Inc, (Irvine, CA) | BBR-L7502 | |
| Steriele zoutoplossing | APP Pharmaceuticals, (Schaumburg, IL) | 918610 | |
| Dun kunststof matrix membraan (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals, (Morgantown, WV) | 62794-096-251 | |
| Kunstmatige dura | Gore Verhinderen MVP Dura Substitute, WL Gore and Associates, (Flagstaff, AZ) | 1MVP40 | |
| 5-0 zijden hechtdraden | Ethicon, Inc (Somerville, NJ) | K-580 | |
| Wond clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, Frankrijk) | A75 | |
| TL-stereomicroscoop | Leica Microsystems, (Wetzlar, Duitsland) | MZ16 | |
| CCD-camera | Hamamatsu, (Bridgewater, NJ) | ORCA-Rx2 | |
| Temperatuurregelaar | Wereld precisie-instrumenten (Sarasota, FL) | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices, (Sunnyvale, CA) | ||
| Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA |
Referenties
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
