Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Summary

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Abstract

Microcontact printen zorgt voor een snelle, zeer reproduceerbare methode voor het creëren van goed gedefinieerde patroon substraten. ¹ Terwijl microcontact afdrukken kan worden gebruikt om rechtstreeks af te drukken van een groot aantal moleculen, zoals eiwitten, DNA ^{2, 3} en silanen, ⁴ de vorming van het zelf -geassembleerde monolagen (SAM) van lange keten alkaan thiolen op goud biedt een eenvoudige manier om eiwitten en cellen om specifieke patronen met lijm en bestand zijn tegen de regio's te beperken. Deze opsluiting kan gebruikt worden om celmorfologie controle en is nuttig voor de behandeling van een verscheidenheid aan vragen in eiwit en celbiologie. Hier beschrijven we een algemene methode voor het creëren van goed gedefinieerde eiwitpatronen voor cellulaire studies ⁵ Dit proces bestaat uit drie stappen:. De productie van een patroon meester met behulp van fotolithografie, de creatie van een PDMS stempel, en microcontact afdrukken van een goud- gecoate substraat. Eenmaal patroon, deze celcultuur substraten in staat zijn van de afbakening van eiwitten en / of cellen (primaire cellen of cellijnen) om het patroon.

Het gebruik van zelf-geassembleerde monolaag chemie zorgt voor nauwkeurige controle over de patroon eiwit / cel lijm regio's en niet-klevende gebieden, dit niet kan worden bereikt met behulp van directe eiwit stempelen. Hexadecanethiol, de lange-keten alkaan thiol gebruikt in de microcontact drukfase, produceert een hydrofoob oppervlak dat gemakkelijk eiwit adsorbeert uit de oplossing. De glycol-beëindigd thiol, gebruikt voor opvullen van de niet-gedrukte regio's van het substraat, ontstaat een monolaag die bestand is tegen eiwit-adsorptie en daarmee de celgroei. ⁶ Deze thiol monomeren produceren zeer gestructureerde monolagen dat nauwkeurig te definiëren regio's van de substraat dat kan ondersteunen eiwitadsorptie en celgroei. Als gevolg daarvan, deze substraten zijn nuttig voor een breed scala aan toepassingen uit de studie van de intercellulaire gedrag ⁷ tot de oprichting van micro-elektronica. ⁸

Terwijl andere soorten monolaag chemie zijn gebruikt voor celkweek studies, waaronder werk van onze groep met behulp van trichloorsilanen om patronen direct op glas substraten te creëren, ⁹ patroon monolagen gevormd uit alkaan thiolen op goud zijn straight-forward voor te bereiden. Bovendien zijn de monomeren gebruikt worden voor monolaag bereiding zijn commercieel beschikbaar, stabiel en vereisen geen opslag of verwerking onder inerte atmosfeer. Patroon substraten bereid uit alkaan thiolen kan ook worden gerecycled en hergebruikt meerdere malen, onderhouden cel opsluiting. ¹⁰

Protocol

1. Voorbereiding van de Patterned Master (figuur 1)

1. Midden van de silicium wafer op de spin-coater en spoel de wafer met aceton bij de eerste stap van de twee cycli spin-programma in tabel 1. De aceton zal verdampen tijdens de tweede stap van de spin-programma verlaten van een schone, droge wafer.
2. Breng ongeveer 1 ml AZ9245 fotolak / in (in diameter) van de wafer en de spin-coat met de voorwaarden beschreven in Tabel 1.
3. Soft-bak de fotolak-gecoate wafer bij 110 ° C gedurende 2 m met een hoge uniformiteit kookplaat.
4. Photopattern de ondergrond met behulp van een direct-write fotolithografie systeem of een masker aligner systeem ....

Discussion

Een aantal zaken kunnen voordoen in de lithografische productie van de meester wordt gebruikt voor PDMS stempel schepping. Onderbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in een wazige en onduidelijke patronen en overbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in vergrote of ontbrekende functies. In het algemeen, meesters met grote functie maten (> 10 urn) zijn relatief eenvoudig op patroon en te ontwikkelen, terwijl de masters met kleinere functies kunnen een uitgebreide optimalisatie van photopatternin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Silicium wafer	Wafer Reclaim Services		2 inch
Spin coater / hot plate	Brewer Science	Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 fotolak	Mays Chemical Company	105880034-1160
Directe schrijf fotolithografie systeem	Microtech srl	LW325 LaserWriter System
Masker Aligner	HTG	3HR
AZ 400K Developer	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Silicone elastomeer Kit	Dow Corning
25 mm geen. Een ronde glazen coverslips	VWR	16004-310
Plasma Oxidizer	Diener	Femto
Titanium stukken Kamis	Incorporated		99,95% zuiver
Goud pellets	Kamis Incorporated		99,999% zuiver
Electron-beam verdamper	Kurt J. Lesker	PVD 75 Thin Film depositie systeem	met een electron-beam accessoire
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-yl) tetra (ethyleenglycol)	Sigma Aldrich	674508
Ethanol	Pharmco-aaper	111000200	200 proof, absolute
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Zonder calcium en magnesium
Muis Laminine I	VWR	95036-762
Human Plasma Fibronectine	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 carbonzuur, succinimidylester	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 carbonzuur, succinimidylester	Invitrogen	A-10168
Anti-laminine antilichaam	Fisher Scientific	AB2034MI