Het creëren van twee-dimensionale Patterned Substraten voor eiwit en Cell opsluiting

Summary

Zelf-geassembleerde monolagen (SAM) gevormd uit lange keten alkaan thiolen op goud bieden goed gedefinieerde substraten voor de vorming van eiwit patronen en cel opsluiting. Microcontact printen van hexadecanethiol met behulp van een polydimethylsiloxaan (PDMS), stempel, gevolgd door opvulling met een glycol-beëindigde alkaan thiol monomeer produceert een patroon waarbij eiwitten en cellen adsorberen alleen aan de gestempelde hexadecanethiol regio.

Abstract

Microcontact printen zorgt voor een snelle, zeer reproduceerbare methode voor het creëren van goed gedefinieerde patroon substraten. ¹ Terwijl microcontact afdrukken kan worden gebruikt om rechtstreeks af te drukken van een groot aantal moleculen, zoals eiwitten, DNA ^{2, 3} en silanen, ⁴ de vorming van het zelf -geassembleerde monolagen (SAM) van lange keten alkaan thiolen op goud biedt een eenvoudige manier om eiwitten en cellen om specifieke patronen met lijm en bestand zijn tegen de regio's te beperken. Deze opsluiting kan gebruikt worden om celmorfologie controle en is nuttig voor de behandeling van een verscheidenheid aan vragen in eiwit en celbiologie. Hier beschrijven we een algemene methode voor het creëren van goed gedefinieerde eiwitpatronen voor cellulaire studies ⁵ Dit proces bestaat uit drie stappen:. De productie van een patroon meester met behulp van fotolithografie, de creatie van een PDMS stempel, en microcontact afdrukken van een goud- gecoate substraat. Eenmaal patroon, deze celcultuur substraten in staat zijn van de afbakening van eiwitten en / of cellen (primaire cellen of cellijnen) om het patroon.

Het gebruik van zelf-geassembleerde monolaag chemie zorgt voor nauwkeurige controle over de patroon eiwit / cel lijm regio's en niet-klevende gebieden, dit niet kan worden bereikt met behulp van directe eiwit stempelen. Hexadecanethiol, de lange-keten alkaan thiol gebruikt in de microcontact drukfase, produceert een hydrofoob oppervlak dat gemakkelijk eiwit adsorbeert uit de oplossing. De glycol-beëindigd thiol, gebruikt voor opvullen van de niet-gedrukte regio's van het substraat, ontstaat een monolaag die bestand is tegen eiwit-adsorptie en daarmee de celgroei. ⁶ Deze thiol monomeren produceren zeer gestructureerde monolagen dat nauwkeurig te definiëren regio's van de substraat dat kan ondersteunen eiwitadsorptie en celgroei. Als gevolg daarvan, deze substraten zijn nuttig voor een breed scala aan toepassingen uit de studie van de intercellulaire gedrag ⁷ tot de oprichting van micro-elektronica. ⁸

Terwijl andere soorten monolaag chemie zijn gebruikt voor celkweek studies, waaronder werk van onze groep met behulp van trichloorsilanen om patronen direct op glas substraten te creëren, ⁹ patroon monolagen gevormd uit alkaan thiolen op goud zijn straight-forward voor te bereiden. Bovendien zijn de monomeren gebruikt worden voor monolaag bereiding zijn commercieel beschikbaar, stabiel en vereisen geen opslag of verwerking onder inerte atmosfeer. Patroon substraten bereid uit alkaan thiolen kan ook worden gerecycled en hergebruikt meerdere malen, onderhouden cel opsluiting. ¹⁰

Protocol

1. Voorbereiding van de Patterned Master (figuur 1)

1. Midden van de silicium wafer op de spin-coater en spoel de wafer met aceton bij de eerste stap van de twee cycli spin-programma in tabel 1. De aceton zal verdampen tijdens de tweede stap van de spin-programma verlaten van een schone, droge wafer.
2. Breng ongeveer 1 ml AZ9245 fotolak / in (in diameter) van de wafer en de spin-coat met de voorwaarden beschreven in Tabel 1.
3. Soft-bak de fotolak-gecoate wafer bij 110 ° C gedurende 2 m met een hoge uniformiteit kookplaat.
4. Photopattern de ondergrond met behulp van een direct-write fotolithografie systeem of een masker aligner systeem en de juiste masker. Maskers zijn te koop bij een aantal commerciële bronnen. Daarnaast kan transparanten bedrukt met UV-absorberend inkt, vastgeplakt aan een optisch vlakke, worden gebruikt om patronen te produceren met grote mogelijkheden.
5. Ontwikkel de patroon wafer in 01:02 400K developer: semi-conductor kwaliteit gedemineraliseerd water voor 1 m 45 s onder zacht schudden. Spoel goed af met semi-conductor kwaliteit gedeïoniseerd water en droog met een stroom van stikstof (N ₂₎ gas. Patroon ontwikkeling kan worden gecontroleerd met behulp van een microscoop met een UV-filter. Als het patroon niet volledig ontwikkeld is, kan de wafer worden teruggegeven aan de zich ontwikkelende oplossing voor extra tijd.

Opmerking: Voor de beste resultaten, photopatterning moet worden uitgevoerd in een cleanroom-omgeving.

2. Voorbereiding van de PDMS Stamp (figuur 2)

1. Bereid een 10:01 door gewicht hars: harder mengsel van Sylgard 182 (PDMS) en volledig bedekken van de master (photopatterned wafer) met het mengsel in een wegwerp petrischaal.
2. De-gas van de PDMS-bedekt meester in een vacuüm exsiccator totdat er geen luchtbellen zichtbaar zijn en laat de stempel in een oven uitharden bij 65 ° C gedurende 1,5 uur Voorafgaand aan genezen, is het belangrijk te zorgen dat de meester is op de bodem van de schaal als het kan naar de oppervlakte stijgen tijdens de ontgassing stap.
3. Snijd de PDMS stempel uit van de master-en trim naar de juiste grootte. Bewaar de stempel in een afgedekte container (functie zijde naar boven) om het te beschermen tegen stof en vuil.

3. Voorbereiding van het patroon Gold substraat (Figuur 3)

1. Geen 25 mm voor te bereiden. Een ronde glazen dekglaasjes voor metalen afzetting door ze te behandelen met zuurstof plasma voor 10 m. Spoel tweemaal met 18,2 MΩ gedeïoniseerd water, gevolgd door tweemaal met ethanol en drogen met een stroom van N ₂ gas tussen elke stap.
2. Met behulp van een multi-pocket electron-beam depositie systeem, borg 50 een titanium, gevolgd door 150 een gouden. Niet ontlucht de verdamper tussen afzetting van de titanium laag en goud laag. Als alternatief goud gecoate dekglaasjes kunnen worden gekocht van een verscheidenheid aan leveranciers, echter, is het belangrijk dat de metalen lagen worden bereid door electron-beam verdamping en niet thermische verdamping. Indien gekocht van een externe bron, kan goud substraten worden gereinigd door plasma-oxidatie of "piranha" (07:03 Conc H ₂ SO _4:. 30% H ₂ O _2), ¹¹ voor gebruik.

Opmerking: "Piranha" oplossing is explosief in de aanwezigheid van organische verbindingen.

3. Bereid de afstempeling oplossing, 10 mM hexadecanethiol in absolute ethanol, en het vervolgens afdekken oplossing, 1 mM glycol-terminated thiol in absolute ethanol.
4. Spoel de stempel met ethanol en droog grondig af met N ₂ gas. Van toepassing stampen oplossing voor het PDMS stempel toe tot volledig gecoat. Droog de ​​stempel met N ₂ gas. Ga verder naar 5a of 5b in voorkomend geval op basis van de kenmerken van de PDMS stempel.
5. 1. Druk de stempel op de gouden ondergrond en laat de monolaag te vormen voor 15 s.
   2. Plaats het goud substraat in een petrischaaltje met 18,2 MΩ gedeïoniseerd water, zodat de ondergrond is ondergedompeld. Druk de stempel op de gouden ondergrond en laat de monolaag te vormen voor 15 s.
6. Twee keer Spoel de gestempelde substraat met ethanol en drogen met N ₂ gas na elke spoeling en plaats het substraat in een petrischaal.
7. Bedek de ondergrond met opvulling oplossing en sluit de schotel met parafilm om verdamping te voorkomen.
8. Laat de achtergrond monolaag in het donker formulier voor 12-14 uur
9. Verwijder de patroon dekglaasje van het vervolgens afdekken oplossing en spoel tweemaal met ethanol en drogen met N ₂ gas na elke spoeling.

4. Het toepassen van eiwitten en cellen tot de gedessineerde ondergrond

1. Plaats de patroon dekglaasje in een petrischaaltje of celkweek kamer en bedekken met 500 ui tot 1 ml fosfaat Dulbecco's gebufferde fysiologische zoutoplossing (DPBS). De DPBS moet de ondergrond volledig te bedekken tijdens het eiwit incubatie, zelfs eiwit dekking te verzekeren.
2. Voeg een geconcentreerde oplossing van eiwit aan de DPBS en meng de oplossing door de pijpTing een paar keer. Incubeer het eiwitmengsel met het substraat bij 37 ° C gedurende 1 uur Uiteindelijke concentraties voor laminine en fibronectine zijn meestal 12 ug / ml en 20 ng / ml. Eiwit kan worden gelabeld met een amine reactieve fluorescente kleurstof om te zorgen voor een gemakkelijke patroon visualisatie. Er moet echter gemerkt eiwit worden gemengd 1:1 met niet-gelabelde eiwit als eiwit labeling kunnen interfereren met biologische activiteit.
3. Na de incubatie Spoel het substraat met DPBS (4-5x) om ongebonden eiwit te verwijderen, zorg ervoor dat u de ondergrond droog of te brengen door de lucht-water interface. Na de eerste drie spoelingen, voeg ongeveer 500 pi van complete celgroei media op een natte ondergrond te behouden.
4. Vervang de groei van media gebruikt om de ondergrond te spoelen met verse media.
5. Losmaken en tellen cellen voor plating op de ondergrond. Ofwel gescheiden primaire cellen, zoals de hippocampus neuronen, of onsterfelijk gemaakte cellijnen, zoals CHO-K1-cellen, kan worden benut.
6. Plaat los cellen op de ondergrond. Meestal 30 tot 200 cellen / mm ² worden gebruikt.

5. Representatieve resultaten:

Figuur 1. Algemeen schema voor de fotolithografische voorbereiding van een patroon meester. In dit proces, is een silicium wafer gereinigd met aceton, bekleed met fotolak, blootgesteld aan het patroon van belang, en het patroon is ontwikkeld.

Figuur 2. Algemeen schema voor PDMS stempel voorbereiding. In dit proces, het patroon meester is bedekt met Sylgard (10:01 hars: verharder), ontgast in een vacuüm exsiccator, uitgehard in een oven op 60 ° C, en op maat gesneden.

Figuur 3. General schema voor de ondergrond patronen. In dit proces, zijn glazen substraten bekleed met titanium (50a) en goud (150A) met behulp van een elektronenbundel verdamper, patroon door microcontact drukken hexadecanethiol met behulp van een PDMS stempel, opgevuld met glycol beëindigd alkaan thiolen, en bekleed met fluorescent gelabelde eiwitten.

Figuur 4. Patterned master (A) en PDMS stempel (B) opgesteld volgens de beschreven methoden. Schaal balken zijn 100 urn.

Figuur 5. Patterned SAM gevisualiseerd met AlexaFluor 647-gelabeld fibronectine (A) en CHO-K1 cellen opsluiting (B). Schaal bars zijn 100 micrometer.

Figuur 6. Patterned laminine bezaaid met E18 muis hippocampale neuronen in 4 dagen in vitro. AlexaFluor 350-geconjugeerd anti-laminine antilichaam wordt gebruikt voor het patroon visualisatie (A) en de E18 muis hippocampale neuronen zijn gekleurd met MitoTracker Red 580 (B). Schaal bars zijn 100 micrometer.

Figuur 7. Mogelijke valkuilen in de voorbereiding van de ondergrond patroon gevisualiseerd door AlexaFluor 647-geconjugeerd fibronectine adsorptie. (A) Onvoldoende vermenging leidt tot ongelijke eiwitadsorptie. (B) ongelijke toepassing van de druk tijdens het stempelen leidt tot een gedeeltelijke overdracht van Patten. (C) Overmatige druk tijdens stampen kan leiden tot instorten stempel. (D) Blootstelling van patroon oppervlak om de lucht te water grensvlak tijdens het spoelen kan resulteren in een achtergrond eiwitadsorptie. Schaal bars zijn 100 micrometer.

Figuur 8. Ondergedompeld patronen kunnen patronen te produceren met kleine features die moeilijk af te drukken met conventionele microcontact drukken in de lucht. Beelden (A) en (B) tonen verschillende regio's van het zelfde patroon, bedrukt met dezelfde PDMS stempel in de lucht (A) of gedeïoniseerd water (B). 10μm-brede steun lijnen die het patroon (toegevoegd om te helpen stempel ineenstorting te voorkomen) surround worden gezien in (A), echter de kleinere dot functies zoals weergegeven in (B) worden niet gezien. Dit laat zien dat het afdrukken in de lucht werkt goed voor grotere mogelijkheden, maar het afdrukken in water kan het nodig zijn voor de patronen met kleinere features. Schaal bars zijn 20 urn.

Cyclus	Acceleratie (rpm / s)	Final Snelheid (rpm)	Tijd (s)
1	500	1000	5
2	3800	3800	30

Tabel 1.Twee cycli spin-programma gebruikt om een ​​4,5 micrometer dikke laag van AZ9245 op een silicium wafer te creëren.

Ter voorbereiding PDMS postzegels voor de vorming van patroon substraten, een meester in fotoresist is in de eerste gefabriceerd (figuren 1 en 4A). De master is het omgekeerde van het stempel en is gemaakt met behulp van een direct-write lithografie systeem of een masker aligner. Wanneer een positieve fotolak, zoals AZ9245, wordt gebruikt voor de productie meester, is de weerstand-gecoate wafer blootgesteld aan licht met hetzelfde patroon, dat zal verschijnen op de laatste substraat. Hoewel het niet altijd mogelijk is, is gemeld dat de ideale aspect ratio (feature size om de dikte te weerstaan) voor PDMS stempel masters is 1:2. ¹³ We hebben gevonden dat de aspect ratio van 1:40 mogelijk zijn, afhankelijk van de aard van het patroon. AZ9245 gecoat silicium wafers onder de voorwaarden van de hier beschreven geven fotolak met een nominale dikte van 4,5 micrometer. We hebben ontdekt dat deze dikte van de AZ9245 kan worden gebruikt om PDMS masters te produceren met functies, variërend van> 100 urn tot 2 micrometer.

PDMS postzegels zijn gegoten uit Sylgard 182 (of Sylgard 184) met behulp van de master gefabriceerd uit fotolak (figuur 2). Fotolak masters kan meerdere keren worden gebruikt om vele kopieën van hetzelfde stempel te creëren. Na uitharding van de PDMS, zijn postzegels uit de master met een scheermesje en de daaruit voortvloeiende stempel kan gevisualiseerd worden onder een microscoop door het plaatsen van stempel functie naar beneden op een glazen dekglaasje (Figuur 4B)

Juiste stampen resulteert in een scherpe, heldere eiwit patroon dat kan worden gevisualiseerd door toepassing van fluorescent gelabelde eiwitten (figuur 3 en 5). Als alternatief kan immunohistochemie worden gebruikt om het eiwit patroon na cel fixatie (Figuur 6) te visualiseren. Celgroei is goed beperkt tot het eiwit patroon voor beide onsterfelijk gemaakte cellijnen en primaire cellen (Figuren 5 en 6).

Hoewel deze techniek is eenvoudig onder de knie, kan een aantal veel voorkomende problemen ontstaan. De toepassing van eiwit zonder voldoende menging van de geconcentreerde eiwit-oplossing in de DPBS kan leiden tot ongelijke eiwitpatronen (Figuur 7A). Onjuiste stampen kan leiden tot een gedeeltelijke patroon overgebracht of stempel instorting (figuur 7B-C). Daarnaast, het blootstellen van de patroon substraat met geadsorbeerd eiwit aan de lucht kan de monolaag waardoor verminderde weerstand in de achtergrond (figuur 7D) verstoren. Patronen bestaan ​​uit zeer kleine elementen (<5 micrometer) en een hoge aspect ratio's vereisen vaak het gebruik van ondergedompeld microcontact afdrukken. In deze procedure (3.5b) water wordt gebruikt als een barrière om te voorkomen dat hexadecanethiol storten op de ondergrond buitenkant van het patroon (Figuur 8). ¹⁴

Discussion

Een aantal zaken kunnen voordoen in de lithografische productie van de meester wordt gebruikt voor PDMS stempel schepping. Onderbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in een wazige en onduidelijke patronen en overbelichting van de resist-gecoate wafer resulteert in vergrote of ontbrekende functies. In het algemeen, meesters met grote functie maten (> 10 urn) zijn relatief eenvoudig op patroon en te ontwikkelen, terwijl de masters met kleinere functies kunnen een uitgebreide optimalisatie van photopatternin...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Silicium wafer	Wafer Reclaim Services		2 inch
Spin coater / hot plate	Brewer Science	Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 fotolak	Mays Chemical Company	105880034-1160
Directe schrijf fotolithografie systeem	Microtech srl	LW325 LaserWriter System
Masker Aligner	HTG	3HR
AZ 400K Developer	Mays Chemical Company	105880018-1160
Sylgard 182 Silicone elastomeer Kit	Dow Corning
25 mm geen. Een ronde glazen coverslips	VWR	16004-310
Plasma Oxidizer	Diener	Femto
Titanium stukken Kamis	Incorporated		99,95% zuiver
Goud pellets	Kamis Incorporated		99,999% zuiver
Electron-beam verdamper	Kurt J. Lesker	PVD 75 Thin Film depositie systeem	met een electron-beam accessoire
Hexadecanethiol	Alfa Aesar	A11362
1-mercaptoundec-11-yl) tetra (ethyleenglycol)	Sigma Aldrich	674508
Ethanol	Pharmco-aaper	111000200	200 proof, absolute
Parafilm	VWR	52858-000
DPBS	VWR	4500-434	Zonder calcium en magnesium
Muis Laminine I	VWR	95036-762
Human Plasma Fibronectine	Invitrogen	33016-015
AlexaFluor ® 647 carbonzuur, succinimidylester	Invitrogen	A-20006
MitoTracker Red 580	Invitrogen	M22425
AlexaFluor ® 350 carbonzuur, succinimidylester	Invitrogen	A-10168
Anti-laminine antilichaam	Fisher Scientific	AB2034MI