Visualiseren van Dengue Virus via Alexa Fluor Labeling

Summary

Profiterend van de vooruitgang in de ontwikkeling fluorofoor en imaging technologie, een eenvoudige methode van Alexa Fluor etikettering van dengue virus was ontwikkeld om het begin van de interacties tussen virus en cel visualiseren.

Abstract

De vroege gebeurtenissen in de interactie tussen virus en cel kan hebben grote invloed op de uitkomst van de infectie. Het bepalen van de factoren die deze interactie van invloed zou kunnen leiden tot een beter begrip van de ziekte pathogenese en dus invloed vaccins of therapeutische design. Daarom zou de ontwikkeling van methoden om deze interactie probe nuttig zijn. Recente ontwikkelingen in fluoroforen ontwikkeling ^1-3 en imaging technologie ⁴ kan worden benut om onze huidige kennis over dengue pathogenese te verbeteren en zo de weg vrijmaken voor de miljoenen van dengue besmettingen per jaar te verminderen.

De omhulde dengue-virus heeft een externe steiger bestaat uit 90 enveloppe glycoproteïne (E)-dimeren de bescherming van de nucleocapside shell, die een enkele positieve streng RNA genoom ⁵ bevat. De identieke eiwitsubeenheden op het virus oppervlak kan dus worden voorzien van een amine reactieve kleurstof en gevisualiseerd door middel van immunofluorescentie microscopie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de etikettering van dengue virus met Alexa Fluor succinimidylester kleurstof direct opgelost in een natriumbicarbonaat buffer die zeer levensvatbaar virus leverde na labeling. Er is geen gestandaardiseerde procedure voor de etikettering van levend virus en bestaande fabrikant protocol voor het eiwit labeling meestal de reconstructie van kleurstof in dimethylsulfoxide vereist. De aanwezigheid van dimethylsulfoxide, zelfs in kleine hoeveelheden, kan blokkeren productieve infectie van het virus en ook leiden tot cel cytotoxiciteit ^6. De uitsluiting van het gebruik van dimethylsulfoxide in dit protocol zo beperkt deze mogelijkheid. Alexa Fluor kleurstoffen hebben superieure fotostabiliteit en zijn minder pH-gevoelig dan de gewone kleurstoffen, zoals fluoresceïne en rhodamine ^2, waardoor ze ideaal zijn voor het onderzoek naar cellulaire opname en endosomale transport van het virus. De vervoeging van Alexa Fluor kleurstof had geen invloed op de opname van gelabelde dengue-virus door virus-specifieke antilichamen en zijn vermeende receptoren in gastheercellen ^7. Deze methode zou kunnen hebben nuttige toepassingen in virologische studies.

Protocol

1. Alexa Fluor etikettering van dengue virus

1. Voor de etikettering reactie, zuiveren dengue virus met sucrose kussen en de voorbereiding van de benodigde reagentia en apparatuur, zoals aangegeven in het protocol.
2. Bereid verse 0,2 M natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5 (etikettering buffer), en 1.5M hydroxylamine buffer, pH 8,3 (stop reagens), vlak voor de etikettering en filter steriliseren met 0.2μm spuit filters.
3. Verdunnen van ongeveer 3x10 ⁸ plaque-vormende eenheden (pfu) van gezuiverd dengue virus in 1 ml van de etikettering buffer in een 2ml buis. Dit kan worden opgeschaald naar evenredigheid voor de etikettering van de batc....

Discussion

Hoewel AF594 kleurstof werd gebruikt in dit rapport, een brede waaier van fluoroforen in de Alexa Fluor succinimidyl esters serie is leverbaar met vergelijkbare etikettering chemie. Dit kan uitbreiding van de etikettering van toepassing buiten beeldvorming. Flowcytometrie kan worden gebruikt als een alternatief voor de confocale microscopie voor het schatten van de mate van etikettering voor fluoroforen die kunnen worden opgewonden en gedetecteerd door de FACS apparaat.

Alexa Fluor kleurstof.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S6297
Hydroxylamine	Sigma-Aldrich	159417
Natriumhydroxide	Merck	106498
AF594 succinimidyl esters	Molecular Probes, Invitrogen	A20004
PD-10 kolom	GE Healthcare	17-0851-01
Hepes	Sigma-Aldrich	H6147
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
M-199	Invitrogen	11150
FBS	Hyclone	SH30070.03
4-well plaat	Nunc	176740
Coverslips	Einst	0111520
Microscoopglaasje	Sail Brand	7105
3H5 hybridoma	ATCC	HB46
10x PBS	1e Base	BUF-2040-10X1L
Saponine	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A7906
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M2670
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C3306
Paraformaldehye	Sigma-Aldrich	15,812-7
Mowiol 4-88	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma-Aldrich	D27802
Tafelblad centrifuge	Eppendorf	5424
Confocale microscoop	Zeiss	LSM 710