$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Alexa Fluor etikettering van dengue virus
- Voor de etikettering reactie, zuiveren dengue virus met sucrose kussen en de voorbereiding van de benodigde reagentia en apparatuur, zoals aangegeven in het protocol.
- Bereid verse 0,2 M natriumbicarbonaat buffer, pH 8,5 (etikettering buffer), en 1.5M hydroxylamine buffer, pH 8,3 (stop reagens), vlak voor de etikettering en filter steriliseren met 0.2μm spuit filters.
- Verdunnen van ongeveer 3x10 8 plaque-vormende eenheden (pfu) van gezuiverd dengue virus in 1 ml van de etikettering buffer in een 2ml buis. Dit kan worden opgeschaald naar evenredigheid voor de etikettering van de batch virus.
- Los het gevriesdroogde Alexa Fluor 594 (AF594) succinimidyl esters tot 1 mm in de etikettering buffer direct voorafgaand aan de etikettering reactie. Andere fluorochromen van de Alexa Fluor kleurstof serie kan worden gebruikt volgens de eigen behoeften. Minimaliseer de blootstelling aan licht van deze stap verder.
- Voeg 100μl van de 1mm AF594 kleurstof om de verdunde virus al roerend zachtjes met de pipetpunt.
- Incubeer de etikettering reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten.
- Spin de buis kort in een tabletop centrifuge en voeg 100μl van stopreagens om de reactie mix al roerend zachtjes met de pipetpunt.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende een extra uur in het donker. Meng door zachtjes te inversies elke 15 minuten.
2. Zuiverende Alexa Fluor gelabeld dengue virus
- In de tussentijd, evenwicht de zuivering kolom met buffer van de keuze. In dit experiment, een PD-10 kolom geëquilibreerd met 25ml van HNE buffer (5mm Hepes, 150mm NaCl, 0,1 mm EDTA), pH 7,4, voor gebruik.
- Van toepassing zijn de gelabelde virus naar de top van de kolom en beginnen met het verzamelen van de doorstroming als de gelabelde virus komt in de matrix. Vul de kolom met HNE buffer een keer al het label virus is binnengekomen de matrix. Gooi de eerste 2,5 ml van de doorstroom en het verzamelen van de volgende 2 ml van gelabeld virus fractie.
- Aliquot en op te slaan gezuiverd AF594 gelabeld dengue-virus bij -80 ° C, weg van de lichtbron.
- Dooi een aliquot en bepaal de titer van de gelabelde virus door plaque assay voor het gebruik van de batch van gelabelde virus.
- Zaad 5x10 4 per putje van Vero-cellen, gekweekt in M-199 groeimedium, in een 4-wells plaat met een dekglaasje op de bodem van goed een dag voor de infectie.
- Verwijder de kweeksupernatant in goed en de cellen met een multipliciteit van infectie van een van de gelabelde virus in 100μl volume (verdund in M-199 onderhoud medium zoals vereist) infecteren voor 10min bij 37 ° C.
- Verwijder de inoculums en twee keer was de dekglaasjes in 1xPBS.
- Fixeer de cellen in 3% paraformalydehyde voor 30 minuten.
- Was de dekglaasjes 3 keer in 1xPBS.
- Permeabilize de cellen met permeabilisatie oplossing, die 0,1% saponine en 5% BSA in 1xPBS voor 30 minuten.
- Incubeer de cellen met onverdunde centrifugatie-verduidelijkt supernatant van 3H5 monoklonaal antilichaam hybridoma cultuur voor 1 uur in een vochtige kamer, beschermd tegen licht.
- Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer (1xPBS met 1 mM calciumchloride, 1 mM magnesiumchloride en 0,1% saponine).
- Incubeer de cellen met AF488 anti-muis IgG antilichaam, 1:100 verdund in permeabilisatie oplossing, voor 45 min in de vochtige kamer, beschermd tegen licht.
- Was de dekglaasjes 3 keer in wasbuffer en spoel een keer in gedemineraliseerd water.
- Dep de rand van dekglaasje tegen een papieren handdoek om overtollig water af te voeren en monteren op glasplaatje met 8μl Mowiol 4-88 met 2,5% Dabco.
- Laat de montage oplossing een nacht ingesteld op 4 ° C voordat u deze bekijkt met behulp van een Zeiss confocale microscoop. Sequentiële overnames moet worden uitgevoerd spannend een fluorofoor in een tijd en schakelen tussen de detectoren gelijktijdig.
- Beelden worden vervolgens geanalyseerd voor co-lokalisatie van de E-eiwit antilichaam kleuring met de gelabelde virus met behulp van de LSM Zeiss Zen-software om de mate van labeling te schatten.
3. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van de opbrengst van dengue virus gemerkt met AF594 kleurstof is weergegeven in figuur 2. Normaal gesproken, zou minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de initiële titer waargenomen worden na succesvol etikettering. Toch moet worden opgemerkt dat alle buffers moeten vers worden bereid voor de etikettering om succesvol te zijn en de Alexa Fluor succinimidyl esters moet onmiddellijk worden gebruikt na reconstitutie als ze hydrolyseren in niet-reactieve vrije zuren in waterige oplossingen 8.
Vervolgens de gelabelde virus moet worden gecontroleerd op voldoende fluorescentie voor gebruik in experimenten. Een eenvoudige immunofluorescentie test werd gedaan op Vero-cellen en de mate van de etikettering kunnen worden geschat op basis van de co-lokalisatie van de gelabelde virus met anti-E eiwit antilichaam kleuring. ScheidenAl cellen werden onderzocht en een typisch confocale afbeelding wordt weergegeven in figuur 3. Co-lokalisatie analyse van de beelden met behulp van de LSM Zen software aangetoond overlap coëfficiënten variërend 0,65 tot 0,8, wat suggereert dat ongeveer 65 tot 80% van de virionen waren gelabeld met de kleurstof.
Figuur 1.De totale regeling beeltenis van de Alexa Fluor kleurstof etikettering van dengue virus procedure. Eerste, de relevante buffers en gezuiverd dengue virus zijn voorbereid. De Alexa Fluor kleurstof is opgelost en toegevoegd aan het dengue virus verdund in de etikettering buffer. De reactie is dan een uur later gestopt met de toevoeging van stopreagens. Vervolgens wordt het label virus gezuiverd door middel van een size exclusion kolom om gratis kleurstof te verwijderen. Tot slot wordt de gelabelde virus opnieuw getitreerd door plaque assay en getest voor fluorescentie.
Figuur 2. Gemiddeld aantal levensvatbare virionen (pfu / ml) zoals bepaald op een plaque assay voor en na de AF594 etikettering. Een deel van de AF594 gelabeld dengue-virus is ontdooid en opnieuw getitreerd door plaque assay en het typisch shows minder dan 10-voudige daling ten opzichte van de start titer. Foutbalken geven de standaarddeviatie van duplicaten.
Figuur 3. Co-lokalisatie van AF594 etiketten met dengue virus E eiwitten in Vero-cellen. Cellen gekweekt op dekglaasjes de dag voorafgaand waren geïnfecteerd met AF594 gelabeld dengue op MOI van een gedurende 10 minuten bij 37 ° C. De cellen werden vervolgens vast en voorzien van anti-E antilichaam, en onderzocht colocalization van E eiwit (groen) en AF594 etikettering (rood). Fluorescerende signalen werden zichtbaar onder 63x vergroting met behulp van Zeiss LSM 710 confocale microscoop. Schaal bar is 10μm. Geel geven gebieden van colocalization, zoals te zien in de inzet.