DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Summary

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

Abstract

Epigenetica beschrijft de erfelijke veranderingen in de gen-functie, die onafhankelijk van elkaar ontstaan ​​aan de DNA-sequentie. De moleculaire basis van epigenetische genregulatie is complex, maar in wezen gaat wijzigingen aan het DNA zelf of de eiwitten met die DNA-medewerkers. De overheersende epigenetische modificatie van DNA in het genoom van zoogdieren is methylatie van de cytosine nucleotiden (5-MEC). DNA-methylatie geeft instructie aan genexpressie machines met betrekking tot waar en wanneer het gen zou moeten worden uitgedrukt. De primaire doelsequentie voor de DNA-methylatie in zoogdieren is 5'-CpG-3 'dinucleotiden (figuur 1). CpG dinucleotiden zijn niet gelijkmatig verspreid over het hele genoom, maar zijn geconcentreerd in de regio's van repetitieve genomische sequenties en CpG "eilanden" vaak geassocieerd met gen promoters (figuur 1). DNA-methylering patronen zijn vroeg in de ontwikkeling vastgesteld, gemoduleerd tijdens de weefselspecifieke differentiatie en verstoord in tal van ziekten, waaronder kanker. Aan understand de biologische rol van DNA-methylatie en zijn rol in de menselijke ziekte, nauwkeurige, efficiënte en reproduceerbare methoden zijn nodig om te detecteren en te kwantificeren individuele 5-MEC.

Dit protocol voor bisulfiet conversie is de "gouden standaard" voor DNA methylatie analyse en faciliteert de identificatie en kwantificatie van DNA-methylatie op single nucleotide resolutie. De chemie van cytosine desaminering door natriumbisulfiet bestaat uit drie stappen (figuur 2). (1) sulfonering: De toevoeging van bisulfiet om de 5-6 dubbele binding van cytosine (2) hydraulische Deaminatie: hydrolytische deaminering van de resulterende cytosine-bisulfiet afgeleide naar een uracil-bisulfiet derivaat (3) geven Alkali Desulphonation: Verwijdering van de sulfonaat groep door een alkali behandeling, uracil geven. Bisulfiet deaminates voorkeur cytosine aan uracil in enkelstrengs DNA, terwijl de 5-MEC, ongevoelig is voor bisulfiet-gemedieerde deaminering. Na PCR-amplificatie, is uracil versterktals thymine terwijl de 5-MEC resten blijven cytosines, waardoor gemethyleerd CpGs te worden onderscheiden van niet-gemethyleerd CpGs door de aanwezigheid van een cytosine "C" versus thymine "T" residu tijdens de sequencing.

DNA-wijziging door bisulfiet conversie is een gevestigde protocol dat kan worden benut voor de vele methoden van DNA-methylatie analyse. Sinds de detectie van 5-MEC door bisulfiet conversie werd voor het eerst aangetoond door Frommer et al.. ¹ en Clark et al.. ^2, de methoden gebaseerd op bisulfiet conversie van genomisch DNA verantwoordelijk voor het merendeel van de nieuwe gegevens over DNA-methylatie. Verschillende methoden van post PCR-analyse kan worden gebruikt, afhankelijk van de graad van specificiteit en de resolutie van methylatie vereist. Klonen en sequencing is nog steeds de meest direct beschikbaar methode die single nucleotide resolutie kan geven voor methylering in het DNA-molecuul.

Protocol

Bisulfiet conversie-protocol

Een standaard protocol voor de omzetting van 2 ug van DNA wordt hieronder beschreven. Kleinere of grotere hoeveelheden van genomisch DNA (100 pg-200 pg) kan ook worden bisulfiet met succes behandeld. Deze reactie-omstandigheden resulteren in volledige omzetting (99,5 tot 99,7%) van bijna elke doelwit DNA-sequentie ^3.

1. DNA Voorbereiding

Voor te bereiden monsters door incuberen genomisch DNA met bisulfiet DNA Lysis Buffer (2 ug t RNA, 280 ng / ul proteïnase K, 1% SDS) in een totaal volume van 18 ul gedurende 1 uur bij 37 ° C. Opmerking: Dit is belangrijk om te realiseren maximale bisulfiet conversie, vooral met DNA geïsoleerd uit klinische monsters waar er kan nog eiwit verbonden aan het DNA.

2. DNA Denaturatie

1. Denatureren 2 ug DNA in een volume van 20 ui door het toevoegen van 2 pi van vers bereide 3M NaOH tot een uiteindelijke concentration van 0,3 M.
2. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten in een waterbad, gevolgd door incubatie bij 90 ° C gedurende 2 minuten in een warmte-blok. Onmiddellijk plaats de buizen op ijs gedurende 5 minuten.
3. Centrifugeer de buizen bij 4 ° C gedurende 10 s bij 10.000 g, om ervoor te zorgen het DNA is op de bodem van de buis.

3. Bisulfiet Deaminatie

Sulfonering & Hydrolytische Deaminatie

1. Bereid verse oplossingen van 10 mM Quinol en verzadigd natriummetabisulfiet pH 5,0 (7,6 g Na ₂ S ₂ O ₅ met 464 ul van 10 M NaOH, aangevuld tot 15 ml met water). De oplossing van verzadigd natriumbisulfiet wordt bereikt door voorzichtig omkeren van het reagens / H ₂ O mengsel, met een minimum aan mengen en beluchting. Indien nodig, de pH aan te passen met 10 M NaOH, voor de volledige ontbinding van de metabisulfiet. Opmerking: Omdat het een verzadigde oplossing, kunnen kleine klontjes nog steeds onopgelost.
2. Voeg 208ul van de verzadigde metabisulfiet en 12 ul van 10mm Quinol aan het gedenatureerde DNA (20 pl), in een eindvolume van 240 ul tot een uiteindelijke concentratie van 2,31 m bisulphite/0.5mM Quinol, pH 5,0. Meng alle reagentia en centrifugeer gedurende 10 seconden om te zorgen dat alle van de druppeltjes zijn aan de onderkant van de buis.
3. Overlay van de monsters met 200 ul van minerale olie. Incubeer de monsters bij 55 ° C in een waterbad, voor 4-16 uur. De lengte van bisulfiet behandeling is afhankelijk van de hoeveelheid en de kwaliteit van het DNA om te zetten. Voor DNA van slechte kwaliteit of beschadigd DNA, beperken de incubatietijd tot 4 uur. Opmerking: het is belangrijk dat dat de bisulfiet conversie plaatsvindt in het donker om te voorkomen dat oxidatie, dus als dat niet mogelijk is wikkel het in folie buizen voorafgaand aan de incubatie .
4. Aan het einde van de juiste incubatietijd, kort draaien de buizen in een microcentrifuge om ervoor te zorgen alle vloeistof op de bodem van de buis.
5. Herstel de bisulfiet behandelde DNAvan onder de olielaag door het zorgvuldig pipetteren uit de DNA-oplossing uit de bodem van de buis, zonder toegang tot een van de minerale olie.

Ontzouten

5. Verwijder eventuele gratis bisulfiet ionen door het passeren door een ontzouten kolom en het elueren in 50 ul van milli-Q water (MQH ₂ O). Afhankelijk van de hoeveelheid en kwaliteit van de genomische DNA en hoe het wordt bereid, kunnen verschillende ontzouten kolommen worden gebruikt. We routinematig gebruik van Promega Wizard Opruimen kolommen, zoals deze kolommen zijn geschikt om te verwijderen de SDS gebruikt bij de bereiding van het DNA voorafgaand aan de conversie.

Alkali Desulphonation

6. De bisulfiet adduct wordt verwijderd uit de uracil ring door desulphonation. Desulphonate door het toevoegen van 5,5 pi van vers bereide 3M NaOH tot een uiteindelijke concentratie van 0,3 M, dan is incuberen de monsters bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
7. Centrifugeer kort en voeg 1 pl t-RNA (10 mg / ml).
8. Neutraliseer de oplossing door de toevoeging van 33 ul van ammonium-acetaat (NH ₄ O Ac), pH 7,0 tot een eindconcentratie van 3M.
9. Ethanol-neerslag het DNA door het toevoegen van 330 pi van ijskoude 100% ethanol, meng goed door inversie. Vertrekken om-20μC gedurende 1 uur tot 's nachts. Centrifugeer bij 14.000 g gedurende 15 min bij 4 ° C. Verwijder alle sporen van supernatant en de lucht droog de neergeslagen DNA voor ~ 20 minuten.
10. Resuspendeer de DNA pellet in 50 ul / ig 0.1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mm EDTA, pH 8,0) of H ₂ O. Laat op kamertemperatuur gedurende ongeveer 2 uur. Af en toe vortex de buizen aan het DNA zorgen is opgelost, gevolgd door een snelle centrifuge.
11. Onmiddellijk met het gebruik van PCR-amplificatie, of bewaar bij -20 ° C voor 1-10 jaar, afhankelijk van de kwantiteit en kwaliteit van het DNA.

4. PCR-amplificatie

Primer Ontwerp

1. Effectief ontwerp van PCR bisulfiet conversie-specifieke primers is crucial voor ervoor zorgt dat efficiënte, onpartijdige versterking van volledig omgezet DNA optreedt. De volgende richtlijnen worden gebruikt om de primer ontwerpen hulp.

Primer Design Guidelines

Thermocyling

2. Om te testen voor de proportionele PCR-amplificatie van gemethyleerd en ongemethyleerd DNA, gebruik dan een 50:50 Gemethyleerd / niet-gemethyleerd volledig bisulfiet omgezet controlemonster en versterken met de bisulfiet conversie-specifieke primers onder de geoptimaliseerde PCR-reactie-omstandigheden (figuur 3). Voor de Gemethyleerd 50:50: ongemethyleerd controle, gebruik van in vitro SssI gemethyleerd DNA en ofwel hele genoom versterkt (WGA) DNA of volbloed DNA. Houdt u er rekening mee dat sommige genen zal uiteraard worden gemethyleerd in het bloed en dus in deze gevallen is het het beste om alleen WGA DNA te gebruiken als de "niet-gemethyleerd" controle.
3. Bereid PCR-amplificatie reactie mengsel in 100 & mU; l aliquots met 2 pl van bisulfiet omgezet genomisch DNA, 200 uM dNTP's, 1 uM primers, 1,5 mM _MgCl2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 en 0,15 pl Taq polymerase.
4. In een temperatuurgradiënt thermocycler, stelt de run reactie in een helling + / - 3 ° C van de voorspelde Tm van de primer over 10 tubes

5. Om te testen of het gemethyleerd en niet-gemethyleerd amplicons zijn versterkt in verhouding, kan het amplicon worden gedigereerd met een informatieve restrictie-enzym, zoals Taq 1 (TCGA), dat gemethyleerd DNA zal verteren, maar zal niet verteren niet-gemethyleerd DNA als de restrictie-enzym site is gewijzigd nadat bisulfiet conversie naar TTGA. De omvang van de spijsvertering kunnen worden gevisualiseerd door agarose gel elektroforese (figuur 3A). Als alternatief kan SYBRGreen (0,2 pi van 1:1000 verdunning) worden toegevoegd aan de PCR-reactie en dede mate van methylering kan worden beoordeeld door het uitvoeren van warmte dissociatie plots in een real-time PCR thermocycler (Figuur 3B).
6. PCR reactie mix waaronder MgCl ₂ concentratie en thermocycling voorwaarden moet mogelijk worden aangepast aan de PCR-efficiëntie te verhogen of om proportionele PCR-amplificatie van gemethyleerd en niet-gemethyleerd PCR-fragmenten te verzekeren.
7. Zodra de PCR-condities zijn geoptimaliseerd, kunnen PCR-amplificatie uitgevoerd worden op bisulfiet omgezet monsters. Opmerking: Wanneer de Tm is geoptimaliseerd een temperatuurgradiënt PCR hoeft niet te worden gebruikt.

5. Representatieve resultaten:

Een voorbeeld van bisulfiet PCR-amplificatie optimalisatie is weergegeven in figuur 3. Optimale PCR-amplificatie voorwaarden moeten versterken gemethyleerd en niet-gemethyleerd amplicons in verhouding en zonder vooringenomenheid. Figuur 3A toont een agarose gel met een temperatuurgradiënt PCR-amplificatie profiel van een mengsel van 50% gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA. The PCR amplicons zijn behandeld met een restrictie-enzym, Taq 1 (TCGA), dat zal verteren gemethyleerd (M) DNA, maar zal niet verteren niet-gemethyleerd (U) DNA als de restrictie-enzym site is veranderd door bisulfiet omzetting naar TTGA. Een gelijke hoeveelheid gesneden en ongesneden PCR-product wordt verwacht als gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA wordt versterkt in verhouding. Het kan worden gezien op deze gel dat de optimale thermocyling voorwaarden voor niet-bias versterking is bij 56,1 ° C (T). Volledige omzetting van de bisulfiet DNA kan ook worden geanalyseerd door digestie met cytosine-site specifiek enzym, zoals Hpa III (CCGG). Hpa III zal alleen verteren als de conversie is mislukt, omdat de beperking site zal worden gehandhaafd. Als de conversie is voltooid de beperking site zal worden omgezet naar TCGG of TTGG, afhankelijk van de methylatie status van het DNA. Compleet bisulfiet DNA conversie is te zien in figuur 3A (H).

Figuur 3B toont een real-time dissociatie plot datkan ook worden gebruikt als een instrument om te bepalen of er sprake is van versterking vooroordelen op basis van de temperatuur waarbij de verschillende moleculen zullen scheiden. In deze figuur is te zien dat de PCR heeft versterkt gemethyleerd (M) en niet-gemethyleerd (U) DNA in verhouding uit een mix van 50% niet-gemethyleerd DNA gemethyleerd en vergeleken met de controlegroep versterking van volledig gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA die los op 82.1μC en 78.9μC respectievelijk.

Na optimalisatie van thermocyling-en reactie-omstandigheden bisulfiet behandelde monsters kunnen worden versterkt met draad specifieke en bisulfiet specifieke primers in zowel een enkel-of semi-nested PCR-reactie. De resulterende PCR-fragmenten kunnen worden gevisualiseerd door agarose gel elektroforese en gesequenced, hetzij direct (Figuur 4A) of door klonering en sequencing. Na kloneren en sequencen van de methylatie status van de individuele moleculen kan worden tabellen, in een bisulfiet kaart (Figuur 4B), de heterogeniteit van de te visualiserenmethylatie.

Hoge doorvoer kwantitatieve methylatie analyse kan worden voorgevormde gebruik van technologie zoals die gebruikt wordt door de Sequenom EpiTYPER methode. Met behulp van deze methode wordt bisulfiet omgezet DNA versterkt met bisulfiet specifieke PCR-primers en gevolgd door een proprietry decollete proces. De resulterende fragmenten worden gekwantificeerd door middel van MALDI-TOF massaspectrometrie met de specifieke spectrum afhankelijk van de aanwezigheid van gemethyleerde cytosines (figuur 5A). Een samenvatting van de methylatie verhoudingen in het monster kan dan worden geëxtrapoleerd in de vorm van een epigram (figuur 5B) of methylering perceel (figuur 5C).

Figuur 1. Gemethyleerde CpG schema. In de normale cel, promotor-geassocieerde CpG eilanden zijn overwegend niet-gemethyleerd (grijs), terwijl CpG sites binnen-gen lichamen zijn schaars en over het algemeen gemethyleerd (rood). Het paneel aan de rechterkant een uitbreiding van de moleculaire structure van DNA bij een individueel CpG site en laat methylering met een CH3 molecule op koolstof 5 van cytosine.

Figuur 2. . Chemische omzetting schematische analyse van DNA-methylatie bestaat uit vier fasen zoals aangegeven, denaturatie, bisulfiet conversie, PCR-amplificatie en analyse. In het rechter paneel, zijn aanpassingen aan de cytosine molecule die zich voordoen tijdens bisulfiet conversie afgebeeld.

Figuur 3. Optimalisatie van de PCR-amplificatie. A. Agarosegelelektroforese met een temperatuurgradiënt PCR-amplificatie profiel van een mengsel van 50% gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA. Fragmenten zijn verteerd met ofwel Taq1 (T) of HpaIII (H) die respectievelijk verteren gemethyleerd DNA en niet bisulfiet omgezet DNA. B. Warmte dissociatie curve de analyse blijkt dat vergelijkingenl deel van gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA (rode lijn 50/50 mix) in vergelijking met de controle versterking van volledig gemethyleerde (roze lijn, M) en niet-gemethyleerd DNA (groene lijn, U) die los bij 82,1 ° C en 78,9 ° C respectievelijk.

Figuur 4. Voorbeeld van directe sequencing en een bisulfiet kaart. A. Volgorde trace uit drie verschillende cellijnen met CpG sites van geel gemarkeerd. Cellijn X geeft 100% methylatie op alle drie de sites van CpG terwijl cellijnen Y en Z tonen verschillende mate van methylering zoals gezien door overlappende G / A-signalen. B. Representatieve bisulfiet kaart met de dichtheid van methylatie (rode stippen) op individueel CpG sites, zoals bepaald door directe sequencen van individuele klonen.

Figuur 5. High-throughput DNA-methylatie analyse met behulp van Sequenom. A. Spectrum bekijken met behulp van Sequenom epiTYPER technologie. DNA-fragmenten weergave van specifieke spectra, afhankelijk van de hoeveelheid DNA-methylatie te presenteren. B. Epigram samenvatting van het percentage van DNA-methylatie op elke CpG site voor vier verschillende cellijnen. C. Methylatie plot samenvatting afgeleid van de Sequenom Epigram.

Discussion

DNA-methylatie analyse van genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA is een gevestigde en veelzijdige methode die de identificatie en kwantificatie van DNA-methylatie op single nucleotide resolutie mogelijk maakt. Echter, bisulfiet conversie en de daaropvolgende analyse gaat uit van de veronderstelling dat het DNA volledig is omgebouwd met alle niet-gemethyleerd cytosine wordt gedeamineerde aan uracil en alleen gemethyleerd cytosines resterende on-reactief. Als conversie onvolledig is, kunnen problemen ontstaan ​​met de analyse, omdat onbekeerde niet-gemethyleerd cytosines verkeerd worden geïnterpreteerd als gemethyleerd cytosines. Bisulfiet conversie kan worden geoptimaliseerd in verschillende stadia van het percentage conversie te maximaliseren. Voor DNA volledig worden omgezet eerst moet worden enkelstrengs zodat cytosine residuen worden blootgesteld aan de bisulfiet ionen. De eerste stap, DNA denaturatie, is kritisch en kan de bron van de onvolledige omzetting zijn als het DNA niet volledig is gedenatureerd. Om ervoor te zorgendat het DNA volledig gedenatureerd is het belangrijk dat de reactie parameters inclusief het verwijderen van alle bijbehorende eiwit, passende zoutconcentratie, incubatie temperatuur en tijd zijn geschikt om DNA te behouden in de enkelstrengs conformatie. Het is belangrijk om verse 3M NaOH te gebruiken en om voldoende incubatietijd mogelijk te maken. Als het DNA is verzet denaturatie, kunnen sommige aanpassingen aan het protocol, waaronder de uitbreiding van de incubatietijd tot 30 minuten of versnijden van het DNA voorafgaand aan denaturatie te vergemakkelijken DNA denaturatie. Daarbij mag enkelstrengs DNA (ssDNA) re-gloeien tot DNA (dsDNA) verdubbelen tijdens de bisulfiet conversie reactie. Het uitvoeren van de reactie bij een hogere temperatuur (90-95 ° C) hetzij periodiek, of continu tijdens de bisulfiet reactie kan helpen het onderhoud van ssDNA. Toch is het belangrijk om te beseffen dat DNA degradatie sterk wordt versneld bij deze hogere temperaturen. Verschillende reagentia kunnen ook worden toegevoegd aan re-gloeien van TH verstorene DNA-strengen, zoals ureum.

De concentratie van het DNA en de kwaliteit ervan kan ook van invloed op de efficiëntie van de bisulfiet reactie en uiteindelijke PCR opbrengst. DNA-degradatie is een beperking van de bisulfiet conversie-protocol. De chemische behandeling van het DNA introduceert diverse breuken in ssDNA en een aantal van de harde voorwaarden die nodig zijn voor een volledige conversie bisulfiet waaronder hoge bisulfiet concentratie, lange incubatietijd kan DNA degradatie versnellen. Onder de standaard beschreven reactie-omstandigheden, DNA-degradatie is niet een veel voorkomend probleem echter, als het protocol wijzigingen worden aangebracht, zoals sequenties die ongevoelig zijn voor conversie, voor DNA-sjablonen die worden afgebroken of van slechte kwaliteit, zoals FFPE monsters, dan DNA degradatie kan een belangrijke beperking te worden.

Formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) en gedegradeerde DNA-monsters kan worden effectief bisulfiet omgezet en versterkt het gebruik van dit protocolMaar aanpassingen om ervoor te zorgen dat het DNA niet verder afgebroken worden geadviseerd. Het gebruik van een drager RNA zoals t-RNA wordt aanbevolen. Ook glycogeen kan worden toegevoegd als een drager wanneer DNA-concentratie is laag (<200 ng). Omdat DNA geïsoleerd uit FFPE weefsel is al versnipperd en verdere versnippering vindt plaats tijdens deaminering, moeten maatregelen genomen worden om verdere degradatie te minimaliseren. Geen fragment DNA verder voor denaturatie en beperken de incubatie tijd voor de bisulfiet reactie tot 4 uur. Ontwerp amplicons niet groter dan 300 bp door gefragmenteerde DNA.

Een andere factor die PCR-amplificatie kunnen beïnvloeden dat bisulfiet omzetting van niet-gemethyleerd cytosines de complexiteit van de DNA-template vermindert. De volgende primer ontwerp van protocol beschreven in paragraaf 4.1, verhoogde primer lengte en geneste PCR kunnen allemaal helpen om de specificiteit en PCR-opbrengst te verhogen.

Tot slot, aangezien de DNA-template veranderen tijdens bisulphite conversie, versterking vooringenomenheid kan een zorg zijn. Zorg ervoor dat de proportionele PCR-amplificatie van gemethyleerd en niet-gemethyleerd templates is gecontroleerd met een controle 50/50 M / U DNA-mix, zoals beschreven in het protocol, zie figuur 3. Er ook voor zorgen dat de versterking van slechts omgezet templates er gebeurt met behulp van HpaIII restrictie-enzym en gelelektroforese (figuur 3). De PCR-condities moet mogelijk worden geoptimaliseerd door het variëren van de temperatuur en / of magnesium concentratie of verlenging verlenging tijd. Sommige templates blijken bijzonder problematisch en primer positie moet mogelijk worden aangepast of gedegenereerde primers kan nodig zijn om te worden gebruikt.

Next generation sequencing technieken snel evolueren naar een gelijkaardige resolutie te bereiken genome sequencing bisulfiet, en de derde generatie van single molecule sequencing heeft de potentie om voor de analyse van zowel de primaire DNA methylatie en mogelijk te maken zonder de noodzaak voor bisulfiet sequencing. Echter, ruime beschikbaarheid en specificity van deze technieken nog enige tijd weg. Bisulfiet genome sequencing is de gouden standaard in methylatie analyse en is een robuust protocol. De methode heeft geleid tot het punt waar de gemeenschappelijke problemen en beperkingen zijn opgelost en de toepassingen zijn uitgebreid van individuele genen analyses tot high throughput en hele genoom-analyse beschreven door Clark et al.. 2006 ^4. Het oplossen van problemen richtlijnen en aanvullende aanbevelingen worden uiteengezet in Tabel 1. Er wordt gesuggereerd dat de optimale benadering is om in eerste instantie volgen de standaard protocol en alleen te introduceren wijziging of en wanneer zich een probleem voordoet.

Tabel 1. Oplossen van problemen Richtlijnen

Materials