Uitbreiding van de humane perifere bloed γδ T-cellen met behulp van zoledronaat

Samenvatting

Een methode om γδ T-cellen uit het perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) uit te breiden wordt beschreven. PBMC-afgeleide γδ T-cellen worden gestimuleerd en uitgebreid met behulp van zoledronaat en interleukine-2 (IL-2). Grootschalige uitbreiding van γδ T-cellen kunnen worden toegepast op autologe cellulaire immunotherapie van kanker.

Samenvatting

Menselijke γδ T-cellen kunnen herkennen en reageren op een breed scala van stress-geïnduceerde antigenen, waardoor het ontwikkelen van aangeboren brede anti-tumor-en anti-infectueuze activiteit. ¹ De meerderheid van de γδ T-cellen in het perifere bloed hebben de Vγ9Vδ2 T-cel-receptor. Deze cellen herkennen antigeen in een grote histocompatibiliteitscomplex-onafhankelijke wijze en ontwikkelen van sterke cytolytische en Th1-like effector functies. ¹ Daarom, γδ T-cellen zijn aantrekkelijke kandidaat effector cellen voor immunotherapie van kanker. Vγ9Vδ2 T-cellen reageren op phosphoantigens zoals (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrofosfaat (HMBPP), dat wordt gesynthetiseerd in bacteriën via isoprenoide biosynthese, ² en isopentenyl pyrofosfaat (IPP), dat wordt geproduceerd in eukaryote cellen door middel van de mevalonate pad. ³ In fysiologische toestand, de generatie van het IPP in nontransformed cel is niet voldoende voor de activatie van γδ T-cellen. Ontregeling van mevalonaat route in tumorcellen leidt tot een ophoping van IPP en γδ T-cellen te activeren. ³ Omdat aminobifosfonaat (zoals pamidronaat of zoledronaat) remmen farnesyl pyrofosfaat synthase (FPP), het enzym optreedt stroomafwaarts van IPP in de mevalonate route, intracellulaire niveaus van IPP en sensitibity te γδ T-cellen erkenning kan therapeutisch worden verhoogd door aminobifosfonaat. IPP accumulatie is minder efficiënt in nontransfomred cellen dan tumorcellen met een farmacologisch relevante concentratie van aminobifosfonaat, die ons in staat immunotherapie voor kanker door het activeren van γδ T-cellen met aminobifosfonaat. ⁴ Interessant, IPP zich ophoopt in monocyten wanneer PBMC worden behandeld met aminobifosfonaat, omwille van een efficiënte drug opname door deze cellen. ⁵ Monocyten die IPP accumuleren worden antigeen-presenterende cellen en stimuleren Vγ9Vδ2 T-cellen in het perifere bloed. ⁶ Op basis van deze mechanismen, hebben we een techniek ontwikkeld voor grootschalige uitbreiding van γδ T-celculturen met behulp van zoledronaat en interleukine -2 (IL-2). ⁷ Andere methoden voor de uitbreiding van γδ T-cellen maken gebruik van de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) ⁸ of 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP). ⁹ Al deze methoden ex toelaten vivo-expansie, wat resulteert in grote aantallen γδ T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie. Echter alleen zoledronaat is een FDA-goedgekeurde commercieel verkrijgbaar reagens. Zoledronaat-geëxpandeerde γδ T-cellen weer te geven CD27 ^- CD45RA ^- effector geheugen fenotype en hun functie kan worden geëvalueerd door IFN-γ productie test ^7.

Protocol

1. Isolatie van PBMC

1. Draw bloed (7.5-8.0 ml) in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met Sodium Heparine. De buis bevat een natrium-heparine en een Ficoll-Hypaque dichtheid vloeistof, plus een polyester gel barrière die de twee vloeistoffen scheidt. Centrifugebuis / bloed bij kamertemperatuur (18 ° C tot 25 ° C) in een horizontale rotor (swing-out head) gedurende 20 min bij 1800 x g. Schakel centrifuge remmen uit.
2. Na het centrifugeren, de volgorde van lagen gebeurt als volgt (van boven naar beneden): a) plasma - b) perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) en bloedplaatjes - c) dichtheid oplossing - d) polyester gel - e) granulocyten - f) rode bloedcellen (afb. 1).
3. Verzamel een fractie van het plasma laag, waardoor 5 tot 10 mm van plasma boven de interfase zonder de cellaag. Het plasma kan worden gebruikt voor de cultuur (paragraaf 2.5).
4. Oogst de verrijkte fractie (PBMC) aan de interfase met een pipet en over te dragen aan een 15 ml conische buis.
5. Was de PBMC met 10 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), door het omkeren van de buis 5 keer, en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g.
6. Tweemaal herhalen wassen stappen uit, waarna resuspendeer de celpellet in 5 ml PBS. Bepaal het aantal cellen. Meestal 1,3 x10 ⁶ cellen worden gewonnen uit een ml volbloed.
7. Bepaal de frequentie en fenotype van γδ T-cellen in PBMC door flowcytometrie (deel 3) (afb. 2).

2. Uitbreiding van γδ T-cellen

1. Centrifuge celsuspensies in 15 ml conische buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij kamertemperatuur, en gooi de supernatant.
2. Bereid kweekmedium (CM) door het toevoegen van humaan IL-2 (IL-2) en zoledronaat (Zometa) tot eindconcentraties van 1000 IU / ml en 5 uM, respectievelijk. ALyS203 (Cell Science & Technology Institute) of OPTMIZER (Invitrogen) media ondersteunen een goede uitbreiding van γδ T-cellen (meer informatie in de referenties 6 en 9). Zometa wordt geleverd in vloeibare vorm (4 mg/5-ml flacon). Ter voorbereiding op een 5 uM oplossing, voeg 50 ul van Zometa tot 30 ml kweekmedium.
3. Resuspendeer celpellet in kweekmedium en aan te passen aan 1x10 ⁶ cellen / ml.
4. Pipetteer 1 ml van de CM met 1x10 ⁶ cellen in elke well van een 24-well plaat. Voor grootschalige culturen, kunnen cellen worden gezaaid op 0,5 x 10 ⁶ cellen / cm ² op basis van de oppervlakte van de plaat putten, gerecht, of de kolf.
5. Dus voeg autoloog plasma (paragraaf 1.3), gepoolde humane AB sera, of FCS dat het ongeveer 10% van het volume van de cultuur (100 pi voor elk putje van een 24-wells plaat). Leg de platen in een vochtige 37 ° C, 5% CO ₂ incubator gedurende 24-48 uur.
6. Handhaving van de cultuur op een cel dichtheid van 0,5 tot 2 x 10 ⁶ cellen / ml. Voeg vers medium met humaan IL-2 (1000 IU / ml) alleen (zonder Zometa) om de 2-3 dagen, en overdracht van gekweekte cellen in nieuwe putten of flessen nodig, afhankelijk van de mate van celproliferatie (afb. 3). Levering plasma of serum aan het medium, zodat de serumconcentratie kan worden gehandhaafd ten minste 1%.
7. Oogst cellen op dag 12-14 en bepalen de frequentie, fenotype, en de functies van γδ T-cellen door flowcytometrie (zie hieronder).

3. Fenotypische analyse door flowcytometrie

1. Transfer 200 ul monsters die 2 x 10 ⁵ cellen om fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS) buizen.
2. Voeg 2 ml koud PBS en centrifugeer 5 minuten bij 400 x g. Dan, resuspendeer de pellets in 50 ul FACS buffer (PBS + 1% FCS + 0,1% natriumazide). Voeg 5 ul van elk antilichamen tegen de monsters (de monoklonale antilichamen zijn vermeld in tabel 1).
3. Incubeer op ijs in het donker gedurende 20 minuten.
4. Voeg 2 ml FACS buffer aan elk monster, en vervolgens vortex. Centrifuge monsters gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C. Decanteer zorgvuldig het supernatant.
5. Resuspendeer de cellen in 300 ul FACS buffer en vortex. Analyseer monsters op een flowcytometer (afb. 2).

4. IFN-γ productie test ¹⁰

1. De dag voor test, voor te bereiden stimulator cellen door het kweken van 3-5 x10 ⁵ Daudi cellen / ml in RPMI 1640 medium plus 10% FCS (RPMI-10) 's nachts met Zometa (5 uM) (hierna aangeduid Z-Daudi).
2. Verzamel Z-Daudi en resuspendeer in RPMI-10 op 2x10 ⁶ cellen / ml. Voeg 100 ul van de Z-Daudi (2x10 ⁵⁾ aan elk putje van een ronde bodem 96-well plaat.
3. Bereid γδ T-cellen op 2x10 ⁶ cellen / ml in RPMI-10 bevat Brefeldine A bij 20 ug / ml. Breng 100 ul van γδ T-cel suspensie (2x10 ⁵⁾ aan elk putje met Z-Daudi cellen of om putten (100 ul RPMI-10 alleen, of RPMI-10 met 20 ng / ml forbol 12-myristaat 13-acetaat controle[PMA] plus 2 ug / ml van ionomycine).
4. Meng door en neer te pipetteren meerdere malen. Incubeer gedurende 4 uur in een 37 ° C, 5% CO ₂ incubator.
5. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 400 x g bij 4 ° C en resuspendeer de pellets in 200 ul van koude PBS.
6. Breng de monsters naar FACS buizen. Voeg 4 ml van de koude PBS en centrifugeer de buizen gedurende 5 min bij 400 x g bij 4 ° C.
7. Resuspendeer de pellets in 50 ul van de FACS-buffer met FITC-geconjugeerd anti-TCRVγ9 (5 pl) en PE/Cy5-conjugated anti-CD3 mAb (2,5 pl). Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
8. Voeg 100 ul van IntraPrep reagens 1 en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur.
9. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en voeg 100 ul van IntraPrep reagens 2. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur zonder schudden.
10. Voeg 5 ul van PE-geconjugeerd anti-IFN-γ mAb aan de reageerbuis. Incubeer beschermd tegen licht gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
11. Voeg 4 ml PBS aan elke buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 400 x g bij kamertemperatuur. Verwijder de bovenstaande vloeistof door aspiratie en resuspendeer de cel pellet in 0,5 ml FACS buffer.
12. Analyseer de cellen door flowcytometer. Poort op CD3 ⁺ TCRVγ9 ⁺ cellen en onderzoekt de expressie van IFN-γ (afb. 4).

5. Representatieve resultaten:

Het is belangrijk om het percentage van γδ T-cellen in PBMC bepalen aan het begin van de cultuur. Zoals getoond in Fig. 2 A, het percentage van de CD3 ^{+ +} TCRVγ9 γδ T-cellen in PBMC was 1,6% op dag 0. De dominante bevolkingsgroepen werden CD27 ^{+ +} CD45RA naïef of CD27 ⁺ CD45RA ^- centrale geheugen fenotypes. Wanneer γδ T-cellen efficiënt gestimuleerd werden, vormden zij clusters op dag 3-5 (afb. 3 A en B). Toen clustervorming werd uitgesteld, de groei van andere celtypen, zoals CD4 ⁺ en CD8 ⁺ T-cellen of αβ NK-cellen kunnen de groei van γδ T-cellen (Fig. 3 C en D) domineren. Na 14 dagen van de cultuur, de frequentie van γδ T-cellen steeg tot meer dan 93,8% van de gekweekte cellen in een succesvolle γδ T-celculturen (fig. 2 E). De gekweekte γδ T-cellen opgereguleerd NKG2D en CD69 expressie (afb. 2 G en H). Ze worden weergegeven CD27 ^- CD45RA ^- effector geheugen fenotype (afb. 2 F). De functies van γδ T-cellen werden geëvalueerd met betrekking tot de cytokine productie en cytotoxiciteit. De intracellulaire IFN-γ vlekken aangetoond dat γδ T-cellen IFN-γ geproduceerd in reactie op de PMA / ionomycine behandeling of Z-Daudi cellen die opgebouwd IPP na zoledronaat behandeling (afb. 4). Deze resultaten geven aan dat zoledronaat efficiënt kunnen stimuleren en uit te breiden functionele γδ T-cellen.

buis	FITC	PE	ECD	PE/Cy5
1	CD3	CD19	CD45	CD14
2	CD3	TCRαβ	CD4	CD8
3	CD3			CD56
4	TCR Vγ9	TCRαβ	CD45	CD3
5	TCR Vγ9	NKG2D
6	TCR Vγ9	CD69
7	TCR Vγ9	muis IgG1
8	TCR Vγ9		CD45RA	CD27
9	TCR Vγ9		muis IgG1	muis IgG1

Tabel 1. Monoklonale antilichamen gebruikt in de meerkleurige kleuring van γδ T-cellen. Een voorbeeld van de fenotypische analyse van γδ T-cellen uitgevoerd in ons laboratorium wordt getoond in Fig. 2.

Figuur 1. Scheiding van PBMC. Bloed (7,5-8,0 ml) wordt getrokken in een BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met natriumheparine en direct gecentrifugeerd gedurende 20 min bij 1800 x g. Na het centrifugeren, de resulterende lagen gezien vanaf boven naar bottom: a) Plasma - b) PBMC en bloedplaatjes - c) Dichtheid oplossing - d) Polyester gel - e) Granulocyten - f) rode bloedcellen.

Figuur 2. Typische oppervlakte fenotype van γδ T-cellen. PBMC werden gestimuleerd met zoledronaat en IL-2 voor 14 dagen. Cellen werden gekleurd met FITC-gelabeld anti-TCR Vγ9 en PE/Cy5-labeled anti-CD3 aan de uitbreiding van γδ T-cellen (A en E) monitor. γδ T-cellen werden geïdentificeerd door hun expressie van TCRVγ9, en hun expressie van CD27 en CD45RA (B en F), NKG2D (C en G), of CD69 (D en H) werd onderzocht.

Figuur 3. Vertegenwoordiger γδ T-cel-culturen. PBMC werden gestimuleerd met IL-2 (1000 IU / ml) en zoledronaat (5 uM). Representatieve velden worden weergegeven (IX71 omgekeerde microscoop [Olympus] x 200). Clusters en aggregaten van γδ T-cellen kunnen worden waargenomen op dag 3 (A) en dag 5 (B), wanneer γδ T-cellen met succes werden uitgebreid. Daarentegen werden er geen clusters of aggregaten waargenomen wanneer γδ T-cel-groei is niet voldoende (C en D).

Figuur 4. IFN-γ productie. γδ T-cellen werden geïncubeerd met RPMI-10 alleen (A) of PMA / ionomycine (B) of Z-Daudi (C) voor 4 uur. Eerst werd oppervlakte-expressie van TCRVγ9 gekleurd en IFN-γ toen de productie werd onderzocht door IFN-γ intracellulaire kleuring.

Figuur 5. Kinetiek van γδ T-cel cultuur. (A) Absoluut aantal van de gekweekte cellen, (B) percentage van de γδ T-cellen, en (C) absolute aantal γδ T-cellen op de aangegeven tijdstippen.

Discussie

De hier gepresenteerde methode maakt een efficiënte uitbreiding van γδ T-cellen uit PBMC. γδ T-cellen geactiveerd en uitgebreid door zoledronaat en IL-2 te ontwikkelen compleet effector functies, weergegeven door cytokine productie en cytotoxiciteit. Het is gemeld dat de synthetische phosphoantigens bromohydrin pyrofosfaat (BrHPP) en 2-methyl-3-butenyl-1-pyrofosfaat (2M3B1PP) ook uit te breiden γδ T-cellen, maar ze zijn niet commercieel beschikbaar. In tegenstelling, is zoledronaat al een licentie voor klinische toepass...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens naam	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
ZOMETA	Novartis Pharma K. K		zoledronaat
Proleukin	Novartis Pharmaceuticals		humaan recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT celpreparaat Tube met natriumheparine	BD	362753
RPMI1640	Invitrogen	21870-076
ALyS203-medium	Cell Science & Technology Institute	0301-7
OPTMIZER	Invitrogen	0080022SA
Brefeldine A	Sigma	B5936-200UL
forbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma	P1585-1mg
ionomycine	Sigma	13909-1ml
IntraPrep	Beckman Coulter	A07803
anti-humaan CD3-FITC of PE/Cy5	Beckman Coulter	A07746 FITC A07749 PE/Cy5
anti-humaan CD4-ECD	Beckman Coulter	6604727
anti-humaan CD8-PE/Cy5	Beckman Coulter	6607011
anti-humaan CD14-PE/Cy5	Beckman Coulter	A07765
anti-humaan CD19-PE	Beckman Coulter	A07769
anti-humaan CD45-ECD	Beckman Coulter	A07784
anti-humaan CD56-PE/Cy5	Beckman Coulter	A07789
anti-humaan TCRαβ-PE	Beckman Coulter	A39499
anti-humaan TCR Vγ9-FITC	Beckman Coulter	IM1463
anti-humaan CD27-PE/Cy5	Beckman Coulter	6607107
anti-humaan CD45RA-ECD	Beckman Coulter	IM2711
anti-humaan CD69-PE	BD	555531
anti-humaan NKG2D-PE	Beckman Coulter	A08934
Anti-humal IFNy-PE	Beckman Coulter	IM2717U
Muis IgG1 isotype controle-PE	Beckman Coulter	A07796
Muis IgG1 isotype controle-ECD of PE/Cy5	Beckman Coulter	A07797 A07798