Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's), rijk aan myofibroblasten aanwezig in de tumor stroma, spelen een belangrijke rol in het besturen van tumorprogressie. We ontwikkelden een coimplantation tumor xengraft model voor het genereren van experimenteel CAFS uit humane fibroblasten borstklieren. Het protocol beschrijft hoe om vast te stellen CAF myofibroblasten dat het vermogen om tumorgenese bevorderen verwerven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Experimentele Generatie van Carcinoom-geassocieerde fibroblasten (cafe's) van Human Borst fibroblasten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Carcinomen zijn complexe weefsels bestaan van neoplastische cellen en een niet-kwaadaardige ruimte aangeduid als de 'stroma'. Het stroma bestaat uit extracellulaire matrix (ECM) en een verscheidenheid van mesenchymale cellen, waaronder fibroblasten, myofibroblasten, endotheelcellen, pericyten en leukocyten 1-3.
De tumor-geassocieerde stroma wordt ingespeeld op de aanzienlijke paracriene signalen uitgebracht door naburige carcinoom cellen. Tijdens het ziekteproces, het stroma wordt vaak bevolkt door carcinoma-geassocieerde fibroblasten (cafe's), inclusief een groot aantal myofibroblasten. Deze cellen zijn eerder verkregen uit veel verschillende soorten van de menselijke carcinomen voor hun in-vitro-cultuur. Een subpopulatie van cafe's is te onderscheiden door hun up-regulatie van α-gladde spiercel actine (α-SMA) expressie 4,5. Deze cellen zijn een kenmerk van 'geactiveerd fibroblasten' die dezelfde eigenschappen delen met myofibroblasten commonly waargenomen in gewonden en fibrotische weefsels 6. De aanwezigheid van deze myofibroblastic CAF deelverzameling is sterk gerelateerd aan high-grade 'maligniteiten en geassocieerd met een slechte prognose bij patiënten.
Veel laboratoria, inclusief onze eigen, hebben aangetoond dat de cafe's, bij injectie met een carcinoom cellen in immunodeficiënte muizen, zijn in staat om aanzienlijk te bevorderen tumorgenese 7-10. CAFS bereid uit carcinoom patiënten, echter, vaak ondergaan veroudering tijdens de voortplanting in de cultuur het beperken van de uitgebreidheid van hun gebruik in heel lopende experimenten. Om dit probleem, ontwikkelden we een nieuwe techniek om experimenteel te genereren onsterfelijke, menselijke borstklieren CAF cellijnen (exp-cafe's) uit humane fibroblasten borstklieren, met behulp van een coimplantation borsttumor xenograft model.
Om de exp-cafe's, ouders menselijke fibroblasten borstklieren, verkregen uit de reductie mammoplasty weefsel te genereren, werden voor het eerst immortalised met hTERT, de katalytische subeenheid van het telomerase holoenzyme, en ontworpen om te uiten GFP en een puromycine resistentiegen. Deze cellen werden coimplanted met MCF-7 menselijke borstcarcinoom cellen die een geactiveerd ras-oncogen (MCF-7-ras-cellen) in een muis xenograft. Na een periode van incubatie in vivo, werden de aanvankelijk ingespoten mens borstklieren fibroblasten uit de tumor xenotransplantaten op basis van hun puromycine weerstand 11.
Merkten we dat de bewoner menselijke fibroblasten borstklieren hebben gedifferentieerd, de aanneming van een myofibroblastic fenotype en tumor-bevorderende eigenschappen verworven in de loop van tumorprogressie. Belangrijk is dat deze cellen, gedefinieerd als exp-cafe's, op de voet na te bootsen van de tumor-bevorderende myofibroblastic fenotype van CAFS geïsoleerd van borstcarcinomen ontleed van patiënten. Onze tumor xenograft afgeleid exp-cafe's daarom voorzien in een effectief model om de biologie van CAFS studie in de mens breast carcinomen. De beschreven protocol kan ook worden uitgebreid voor het genereren en karakteriseren van de verschillende bevolkingsgroepen CAF afgeleid van andere vormen van menselijke carcinomen.
Protocol
1. Isolatie van de primaire gekweekte menselijke normaal door de melkklieren fibroblasten
Experimentele procedures voor het isoleren van primaire gekweekte menselijke fibroblasten normaal door de melkklieren worden beschreven in Fig. 1A.
- Bereid de cel dissociatie buffer, zoals eerder 12 beschreven: Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 10% foetaal kalf serum (FCS), penicilline-streptomycine (200 eenheden / ml), collagenase type I (1 mg / ml) en hyaluronidase ( 125 eenheden / ml).
- Was het borstweefsel ontleed van een verlaging van mammoplasty (~ 0,5 gram) enkele malen in fosfaat gebufferde zoutoploss....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het ontbreken van CAF-specifieke markers en de mate van heterogeniteit waargenomen bij cafe's maken de karakterisering van dit celtype een uitdaging op zich. Studeren CAFS in vitro werd ook gehinderd door de extra complicatie dat deze cellen senesce en stoppen prolifererende wanneer gekweekt voor een lange periode. Onze vorige poging om direct vereeuwigen primaire CAFS met behulp van een retrovirale hTERT cDNA construct werd geen succes. Daarom, naar aanleiding van de tumor het bevorderen van eigenschappen .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) voor de genereuze steun en begeleiding van dit werk en de heer Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester), voor een kritische redactie van dit manuscript. Dit project werd ondersteund door Research Verenigd Koninkrijk (CR-VK) te verlenen nummer C147/A6058 (AO)
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Materiaal Naam | Type | Vennootschap | Catalogus nummer | Commentaar |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Foetaal kalf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicilline-streptomycine | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentine (V9) antilichaam | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 | ||
| Tenascin C (BC-8) antilichaam | een geschenk van | |||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antilichaam | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase | Dako | M0877 | ||
| (5B5) antilichaam | ||||
| Collageen type 1 1A antilichaam | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratine antilichaam | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectine antilichaam | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specifiek eiwit-1) antilichaam | Dako | A5114 | ||
Fibroblast oppervlakte-eiwit (Kloon 1B10) antilichaam | Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Verzoek aan de de auteurs | |||
| pBabe-puro te bouwen | Aankoop van Addgene | |||
| Puromycine | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conische buis | Corning | 430766 | ||
| Naakt muis | Taconic | NCRNU-F | Vrouwelijk naakt NCR | |
| C3H/10T1/2 cellen | ATCC | CCL-226 |
Referenties
- Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Na....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
