De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans</em

Samenvatting

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse-imaging is een gevoelige methode om de effecten van mutaties in C. elegans op axonregeneratie te analyseren. Een hoogwaardig, maar goedkoop laserablatiesysteem kan eenvoudig aan de meeste microscopen worden toegevoegd. Time-lapse-imaging over een periode van 15 uur vereist een zorgvuldige immobilisatie van de worm.

Samenvatting

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse microscopie is een gevoelige assay voor axonale regeneratie-fenotypen in C. elegans¹. De belangrijkste moeilijkheid van deze assay is de waargenomen kostprijs ($25-100K) en de technische expertise die vereist is voor de implementatie van een laserablatiesysteem^2,3. Echter, solid-state gepulseerde lasers tegen bescheiden kosten (<$10K) kunnen robuuste prestaties leveren voor laserablatie in transparante preparaten waarbij de doelaxonen "dicht" bij het weefseloppervlak liggen. De constructie en uitlijning van een systeem kan in één dag worden voltooid. Het optische pad, gevormd door het licht van de gefocuste condensor naar de ablatielaser, dient als een handige uitlijningsgids. Een tussenmodule waarin alle optica zijn verwijderd, kan specifiek worden gewijd aan de ablatielaser, waardoor wordt gegarandeerd dat er geen optische elementen verplaatst hoeven te worden tijdens een laserablatiesessie. Een dichroïsche spiegel in de tussenmodule maakt gelijktijdige beeldvorming en laserablatie mogelijk. Het centreren van de laserstraal ten opzichte van de uitgaande straal van de gefocuste microscoopcondensorlens leidt de initiële uitlijning van het systeem. Diverse lenzen worden gebruikt om de laserstraal te conditioneren en uit te breiden zodat de achteropening van de gekozen objectieflens wordt gevuld. De uiteindelijke uitlijning en testen worden uitgevoerd met een glazen objectglas met een front-surface spiegel als doelwit. Het laservermogen wordt aangepast om een ablatieplek van minimale grootte te verkrijgen (<1um). De ablatieplek wordt gecentreerd door middel van fijne aanpassingen van de laatste kinematisch gemonteerde spiegel ten opzichte van kruisdraadjes die in het beeldvenster zijn gefixeerd. Het laservermogen voor axotomie zal ongeveer 10X hoger zijn dan nodig voor de minimale ablatieplek op het doelglasplaatje (dit kan variëren afhankelijk van het gebruikte doelwit). Wormen kunnen worden geïmmobiliseerd voor laser-axotomie en time-lapse beeldvorming door ze te monteren op agarose-pads (of in microfluïdische kamers⁴). Agarose-pads worden eenvoudig gemaakt met 10% agarose in gebalanceerde zoutoplossing, gesmolten in een magnetron. Een druppel gesmolten agarose wordt op een glazen objectglas geplaatst en met een ander objectglas platgedrukt tot een pad van ongeveer 200 um dik (een enkele laag tijdtape op aangrenzende glasplaatjes wordt als afstandhouder gebruikt). Een "Sharpie"-dop wordt gebruikt om een cirkelvormig pad met een uniforme diameter van 13mm uit te snijden. Anestheticum (1ul Muscimol 20mM) en microsferen (persoonlijke communicatie Chris Fang-Yen) (1ul 2,65% polystyreen 0,1 um in water) worden aan het centrum van het pad toegevoegd, gevolgd door 3-5 wormen die zo zijn georiënteerd dat ze op hun linkerzij liggen. Een glazen dekglas wordt aangebracht en vervolgens wordt vaseline gebruikt om het dekglas af te dichten en verdamping van het monster te voorkomen.

Protocol

1. Constructie van een laserablatiesysteem

Draag een laserveiligheidsbril en hanteer goede laserveiligheidspraktijken tijdens de initiële uitlijning. Kijk nooit door de oculairs wanneer de laser is ingeschakeld.

1. Plaats de componenten op het breadboard zoals weergegeven in Fig. 1 (zie ook het voorbeeld²). Schroef de laser (indien nodig met een tussenplaat), de periscoophouder en de verhoogde railsteunen vast.
2. Plaats de microscoop zodanig dat deze is uitgelijnd met de as van de rail. Lijn deze uit met de doorgelaten lichtbundel van de condensorlens van de microscoop. Stel de railhoogte (gebruik een waterpas) en de positie af met behulp van een verstelbare diafragmaopening of een lens die aan de rail is bevestigd. De diafragmaopening of lens moet zijn uitgelijnd op beide uiteinden van de rail naar de condensorbalk. Labjekken kunnen helpen bij het aanpassen van de railhoogte.
3. Rij de Glan-Thompson-polarisator en de half-golfplaat uit op de laserstraal. Voor deze uitlijning hoeft de laser niet aan te staan. De straal moet enkel door beide componenten lopen zonder de randen te raken. Draai de polarisator om een geschikte oriëntatie en positie voor de beam dump te verkrijgen (fig.1). De half-golfplaat wordt gedraaid om het laservermogen aan te passen. Bevestig de componenten aan de optische tafel.
4. Zet de laser aan, stel de pulsfrequentie in op 10, kies de continue modus en reduceer het vermogen tot een minimum met behulp van de halve-golfplaat. Gebruik een Post-it of lenspapier om de laserstraal zichtbaar te maken.
5. Stel de kinematisch gemonteerde spiegels in volgorde vanaf de laser af en corrigeer deze, om de straal naar de spiegel te leiden die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. De laserstraal moet ruwweg in het midden van de spiegels worden uitgelijnd. De spiegels moeten ongeveer in een hoek van 45 graden ten opzichte van de as van de laserstraal staan (fig.1).
6. Stel de kinematisch gemonteerde spiegel bovenop de periscoop en aan het uiteinde van de rail grof af om de laserstraal uit te lijnen met het midden van de doorgelaten lichtbundel van de microscoop. Zowel de laserstraal als de doorgelaten lichtbundel van de microscoop kunnen gelijktijdig worden gevisualiseerd door papier in het straalpad te plaatsen. Zorg ervoor dat eventuele ND-filters en diafragma's in de tussenmodule verwijderd of volledig geopend zijn.
7. Lijn de laserstraal nauwkeurig uit op het centrum van de doorgelaten lichtbundel met behulp van de fijninstellingen op de bovenste periscoop en de spiegels op de rail. Houd het papier dicht bij de railspiegel en lijn de laserstraal uit op het centrum van de doorgelaten lichtbundel met de spiegel van de bovenste periscoop. Houd het papier nabij de microscoopopening en lijn de laserstraal uit op het centrum van de doorgelaten lichtbundel met de instellingen van de railspiegel (fig. 2).
8. Plaats een Post-It-notitie in het straalpad tussen de uitgelijnde condensorlens en de open objectiefrevolver. De doorgelaten lichtbundel moet zichtbaar zijn, met de kleinere laserstraal nabij het centrum. Gebruik de fijne instellingen op de railspiegel om de laserstraal te centreren. Zet de microscoop vast met klemmen.

Stappen 1.9-1.12 zijn optioneel, maar het is eenvoudig en nuttig om de uitlijning en laserablatie te beoordelen voordat de bundeluitbreidingslenzen worden toegevoegd.

9. Schakel de laser uit en sluit de mechanische veiligheidssluiter. Draai de 50% dichroïsche spiegel uit de straalpad. Hoewel er geen direct laserlicht naar de oculairs zal gaan, kan het gereflecteerde licht zeer intens zijn. Plaats het doelobjectglas voor de fijne uitlijning en beeldvorming met het 60X olie-objectief. Stel scherp op krassen op het objectglas. Plaats het ND4- en ND8-filter in de tussenmodule.
10. Neem beelden van het doelobjectglas met uw CLSM-, Spinning disk- of CCD-camerasysteem. Draai de 50% dichroïsche spiegel in het laserpad. Vanaf dit punt mag u nooit door de oculairs kijken terwijl de ablatielaser aan staat. Schakel de ablatielaser in en stel de modus in op 'triggered', de frequentie op 10 en het aantal pulsen op 10. Zorg ervoor dat het vermogen nog steeds op minimum staat via de halve-golfplaat en open vervolgens de mechanische veiligheidssluiter. U kunt gelijktijdig beeldvorming toepassen en de ablatielaser gebruiken.
11. Trigger de ablatielaser terwijl u het doelobjectglas in beeld brengt. Controleer het doelobjectglas op een ablatiespot van 1-10 µm in diameter. Verwijder opeenvolgend de ND-filters totdat er een ablatiespot zichtbaar is. Pas de ablatiespot aan naar het centrum van het beeld met de railspiegel. U zult een ND-filter willen toevoegen om ruimte te hebben om het laservermogen met de halve-golfplaat nauwkeurig te verhogen voor een ablatiespot van <1 µm. Neem beelden op 0,2 µm/pixel of minder en stel de ablatiespot nauwkeurig af op het middelpunt van het beeld (positie 256,256 bij een 512X512 beeld).
12. Controleer de scherptediepte en de as van de laserstraal. Focus 1-2 µm omhoog en omlaag en controleer de ablatiepositie en de grootte van de ablatiespot. Als de laserstraal axiaal is uitgelijnd, zal de ablatiespot niet bewegen. De ongeconditioneerde laserstraal verdeelt het vermogen over meerdere µm (ongeveer 3-5 µm van boven naar beneden in het brandpunt).

2. Voeg lenzen toe om de laserstraal uit te breiden zodat deze de achteropening van het objectief vult en pas de convergentie aan om de focus te beheren

1. Dit systeem maakt gebruik van dubbele Galileïsche straaluitbreiders om de laserstraal uit te breiden zodat deze de achteropening van het objectief (10 mm) vult. Monteer de 4 lenzen op houders en bevestig deze aan de rail (L1f1+L2f2 en L3f1'+L4f2'). Pas de posities aan zodat alle lenzen op dezelfde optische as liggen en exact loodrecht op de laserstraal staan (fig. 2).
2. Zet de laser aan en stel deze in op minimaal vermogen en continue modus. Pas de uitlijning van de straal door elke lens grofweg aan door papier te gebruiken om de laserstraal en de doorgelaten lichtstraal van de microscoopcondensor te zien. Zet de laser uit en sluit de sluiter.
3. Verwijder de klemmen aan één zijde van de microscoop en schuif de microscoop uit het pad van de laserstraal. Zet de laser aan en verwijder de veiligheidssluiter.
4. De fijne uitlijning van de lenzen en de laserstraal kan worden uitgevoerd door de uitgebreide laserstraal op een nabijgelegen muur te bekijken. De straal moet symmetrisch uitbreiden en inkrimpen wanneer de lenzen worden bewogen. Pas de laatste twee kinematisch gemonteerde spiegels aan om de straal uit te lijnen (fig. 3).
5. Het uitgelijnde en uitgebreide straalprofiel moet circulair zijn en een uniforme helderheid hebben (fig. 3). De grootte en uniformiteit van de straal kunnen worden bekeken met een Post-it op de geschatte positie van de achteropening van het objectief.
6. De straal moet worden ingesteld op nul convergentie voor optische systemen voor oneindig. Convergentie kan worden geschat door op te merken hoe de straalgrootte verandert naarmate u een Post-it verder van de lenzen verwijdert. Zet de laser uit en sluit de mechanische sluiter.
7. Schuif de microscoop terug in het pad van de laserstraal, waarbij de vaste klemmen worden gebruikt om de juiste uitlijning te bepalen. Plaats de klemmen aan de vrije zijde van de microscoop terug, maar draai ze niet vast.
8. Zet de laser aan en verwijder de veiligheidssluiter. Draai de objectiefrevolver naar een open positie. Plaats een Post-it op de tafel. U moet de uitgebreide en uniforme laserstraal zien, gecentreerd op de doorgelaten lichtstraal van de condensor (fig. 4). Het kan nodig zijn om deze te centreren door de microscoopklemmen los te maken en de microscoop voorzichtig te verschuiven.
9. Sluit de veiligheidssluiter en zet de laser in trigger-modus. Draai het 60X objectief op zijn plaats en beeld de oppervlaktekrasjes op het target-preparaat af.
10. Verwijder de veiligheidssluiter, trigger de ablatielaser en pas het laservermogen aan voor de minimale ablatieplek. De ablatieplek moet circulair zijn en zich binnen 5-10 µm van het midden van het beeld bevinden.
11. Centreer de ablatieplek met fijne aanpassingen van de kinematisch gemonteerde railspiegel. U moet iteratief de op de rail gemonteerde spiegel en de bovenste periscoopspiegel aanpassen om zowel de ablatieplek te centreren als een uniform straalprofiel te behouden.
12. Evalueer de Z-focus van de laser door de focus systematisch in stappen van 1 µm omhoog en omlaag te bewegen en de ablatielaser te triggeren. De uitgebreide, uitgelijnde en op convergentie ingestelde straal moet maximaal ablateren bij de beeldfocus en zwak of helemaal niet 1 µm boven of onder de focus (fig 5).
13. Stel de Z-focus van de uitgebreide straal bij door lens L3 van de Galileïsche telescoop te bewegen (fig. 2).

3. Laser axotomie en time-lapse microscopie van axonregeneratie

1. Verwarm 10% agarose (RPI Molecular Biology Grade EEO 0.1 A20090) in gebalanceerde zoutoplossing in de magnetron tot het volledig is gesmolten. Plaats dit op een warmteplaat om het gesmolten te houden tijdens het gebruik voor het monteren.
2. Een druppel gesmolten agarose wordt op een glasplaatje geplaatst en met een ander glasplaatje platgedrukt tot een laagje van ongeveer 20 um dik (een enkele laag tijdtape op aangrenzende plaatjes wordt als afstandhouder gebruikt).
3. Een dop van een "Sharpie"-stift wordt gebruikt om een rond plakje met een uniforme diameter van 13mm uit te snijden.
4. Anesthesie (1ul Muscimol 20mM) en microsferen (Chris Fang-Yen, persoonlijke communicatie) (1ul 2,65% polystyreen 0,1 um in water) worden in het midden van het plakje gevoegd, gevolgd door 3-5 wormen die zo zijn georiënteerd dat ze op hun linkerzij liggen. Er wordt een glazen dekglas aangebracht en vervolgens wordt vaseline gebruikt om het dekglas af te dichten en verdamping van het monster te voorkomen (fig.6).
5. De ablatielaser wordt aan het begin van elke sessie uitgelijnd op het kruisdraad, zoals hierboven beschreven. Sluit de laserveiligheidsluiter.
6. Verwijder het laseruitlijningsdoel en beeld een gemonteerde volwassen worm in met een geschikte fluorescente marker in de doelneuronen. Beeld axonen in bij een vergelijkbare vergroting (0,2 um/pixel of een hogere vergroting) en positioneer deze onder het kruisdraad (fig.7).
7. Open de laserveiligheidsluiter en activeer de ablatielaser tijdens het beeldvormen. Evalueer het axon na het activeren van de laser en verhoog langzaam het laservermogen totdat het axon is doorgesneden. Er is ongeveer 10X meer laservermogen nodig om axonen door te snijden dan om een ablatieplek op het uitlijningsdoel-plaatje te vormen (ongeveer 1uJ/ ns puls). We snijden doorgaans met 10 pulsen bij 2,5 kHz en een vermogen ingesteld op ongeveer 0,27mW (gemiddeld vermogen gemeten bij het specimen met een Coherent FieldMaxII vermogensmeter en de laser ingesteld op continu bij 250 Hz). De instelling van het ablatielaservermogen zal consistent blijven voor het doorsnijden van axonen in toekomstige experimenten (fig.7).
8. Een succesvol doorgesneden axon vertoont een onderbreking van ongeveer 0,5-1 um zonder verlies van helderheid in de twee doorgesneden uiteinden (fig.7). Een groot verlies van helderheid of een grote opening (2-10 um) duidt vaak op uitgebreide schade voorbij het axon door een cavitatiebel. De proximale en distale axonen zullen zich scheiden en in de volgende 30 minuten retractiebollen vormen (fig. 8 en Movie).
9. Equilibreer uw gemonteerde wormen op de microscooptafel gedurende 30 minuten voordat u start met de time-lapse opname. Dit minimaliseert drift door temperatuurverschillen en krimp van de agarose.
10. De parameters voor time-lapse imaging worden ingesteld met de imagingsoftware van uw systeem. We beelden doorgaans 10-20 Z-stappen in (1um/stap) bij 0,1-0,2 um/pixel met instellingen voor gain, pinhole, scansnelheid en laservermogen voor imaging die de blootstelling minimaliseren terwijl de gewenste ruimtelijke resolutie wordt bereikt. De bemonsteringsintervallen zijn doorgaans 1-5 minuten over 15 uur, afhankelijk van de gewenste temporele resolutie (fig. 8 en Movie).
11. Time-lapse beeldgegevens worden omgezet in films met NIS Elements of ImageJ.

4. Representatieve resultaten:

Laseraxotomie met dit systeem is betrouwbaar en routinematig. De resultaten die in figuur 7 worden getoond, zijn typerend. Time-lapse imaging van axonregeneratie is zeer robuust met dit protocol. We snijden en beelden routinematig tot 5 axonen in 5 verschillende wormen op één enkele slide door gebruik te maken van een gemotoriseerde tafel. De enige beperking is de tijd die nodig is om de beelden van elk axon te verzamelen; als het bijvoorbeeld 20 seconden duurt om een stack voor een axon te verzamelen, kun je maximaal 9 axonen (9 stacks) samplen als je elke 180 seconden samplt. Het voorbeeld getoond in figuren 8 en 9 is een goed representatief resultaat. Ongeveer 10% van de experimenten geeft resultaten van deze kwaliteit. De overige experimenten leveren goede gegevens over het regeneratie-fenotype, maar zijn esthetisch minder aantrekkelijk vanwege kleine trilbewegingen van de worm die over het algemeen na 5-8 uur immobilisatie beginnen.

Figuur 1 Laserablatiesysteem. De 532 nm Nd:YAG-laser is gemonteerd op een verhogingsplaat om deze op dezelfde hoogte als de andere componenten te brengen en is vastgeschroefd aan de optische tafel. (Een optische isolator is optioneel en waarschijnlijk niet nodig). De Glan-Thompson-polarisator en de halfgolveplaat worden gebruikt om het laservermogen nauwkeurig te regelen. Deze bevinden zich in nauwkeurig gekalibreerde rotatiehouders. Let bij het instellen van de beam dump goed op. De hoekspiegel leidt de laserstraal naar de onderste periscoopspiegel. De bovenste periscoopspiegel leidt de straal naar de railspiegel. De rail is gemonteerd op twee door stangen ondersteunde platforms. Dubbele Galileïsche lenzen zijn bevestigd aan schuifrailhouders. Let op de toegevoegde tussenmodule die specifiek is bedoeld voor de ablatielaser. Het systeem zou compacter gemaakt kunnen worden door de optische isolator en de hoekspiegel te verwijderen en de laser, de Glan-Thompson-polarisator en de halfgolveplaat aan de achterzijde van de optische tafel te positioneren.

Figuur 2 Dubbele Galileïsche conditioneringslenzen worden gebruikt om de 30 µm TEM₀₀ laserbundel uit te breiden tot een uniforme grootte van 10 mm met nul convergentie. Een labjack is geplaatst onder een van de platforms die de rail ondersteunt. Dit helpt bij het aanpassen van de railhoogte tijdens de uitlijnstappen. Stel de railhoogte grof bij door lens L1 op de rail te monteren en de condensatorbundel als uitlijngids te gebruiken. Stel de rail zo in dat de condensatorbundel is uitgelijnd met het centrum van de lens bij beide uiteinden van de rail. Dit zorgt ervoor dat de rail parallel aan de optische as van de microscoop is uitgelijnd. Het kan nodig zijn om eerst de microscoop aan te passen aan de optische as van de rail. Gebruik klemmen om de positie van de microscoop vast te zetten (zie fig. 1). Verwijder de op de rail gemonteerde lens. Lijn nu de laserstraal uit op het centrum van de bundel van de condensor bij beide uiteinden van de rail. Een vel papier in het straalpad is een handige manier om beide stralen gelijktijdig te zien. Gebruik de bovenste periscoopspiegel om de laserstraal uit te lijnen met de condensorstraal nabij de op de rail gemonteerde spiegel. Gebruik de op de rail gemonteerde spiegel om de laserstraal uit te lijnen met de condensorstraal aan het verre uiteinde van de rail (het dichtst bij de microscoop). Monteer nu alle vier de lenzen op de rail, zoals afgebeeld in de figuur. De lengte van de rail, de brandpuntsafstand van de lenzen en de lensconfiguraties variëren afhankelijk van uw microscoop en de fysieke opstelling. Kritieke parameters zijn de diameter van de laserstraal en de grootte van de achteropening van het gekozen objectief. In oneindigheid-optische systemen wordt een perfect parallelle laserstraal gefocust (nul convergentie). De afstand tussen L1 en L2 moet de som zijn van de brandpuntsafstanden van de lenzen, f1+f2, en de afstand tussen L3 en L4 moet dienovereenkomstig f1'+f2' zijn. De afstand tussen de dubbele Galileïsche paren is niet kritiek. De positie van L3 kan nauwkeurig worden aangepast om de convergentie van de straal te controleren;

Figuur 3 Uitlijning van de laserstraal door de dubbele Galileïsche lenzen. Verwijder de microsceekklemmen aan één zijde van de microscoop, zodat de microscoop uit het straalpad kan worden bewogen, terwijl de resterende klemmen het mogelijk maken om de microscoop nauwkeurig opnieuw te positioneren. Denk aan laserveiligheidZorg ervoor datHet laservermogen met de Glan-Thompson-polarisator tot een minimum is ingesteld. Schakel de laser in en bekijk het patroon van de laserstraal op de muur. Een stuk papier dat op de muur is geplakt, kan helpen bij het visualiseren van de laserspot. Pas de posities van de lenzen systematisch aan om een gevoel te krijgen voor hun effect op de straalbreedte en het uiterlijk. U zou iets moeten zien dat lijkt op paneel A, waarbij een intense spot excentrisch is gelegen in een zwakker profiel. Gebruik de op de rail gemonteerde spiegel om de intense spot naar het centrum te verplaatsen, zoals weergegeven in paneel B. Gebruik nu de spiegel van de bovenste periscoop om een uniform perifeer profiel te verkrijgen. Als alles correct is uitgelijnd, zult u merken dat het verplaatsen van de lenzen ervoor zorgt dat de straal symmetrisch expandeert en contraheert. Verplaats de lenzen terug naar de beginposities, zoals weergegeven in figuur 2. Onderbreek de straal nu op de afstand van de achteropening van het objectief. Deze moet circulair zijn, in ieder geval groot genoeg om de achteropening te vullen, en een uniforme helderheid hebben. Het is geen probleem als de straal groter is, zolang er voldoende laservermogen is voor de ablaties. Evalueer de convergentie door de straaldiameter op de afstand van de achteropening van het objectief te vergelijken met die op de muur. Voor een straal met nulconvergentie moet de straaldiameter identiek zijn. De schaalbalk is 10 mm.

Figuur 4 Uitlijning van de uitgebreide laserbundel op de condensorbundel. Sluit de laser af en beweeg de microscoop terug in het pad van de laserbundel, waarbij de klemmen als uitlijningsstops dienen. Zet de condensorbundel aan, lijn deze uit en focus deze met behulp van een objectieflens. Plak papier over de oculairs om te voorkomen dat iemand het intense gereflecteerde laserlicht zietDraai de objectiefrevolver naar een open positie. Plaats een stuk papier op de tafel om de bundel van de condensator af te schermen. Zet de laser in de continue modus en verwijder de mechanische veiligheidssluiter. Er zou nu laserlicht door de microscoop moeten komen. Maak de klemmen van de microscoop los en verschuif de microscoop voorzichtig om de laserbundel uit te lijnen met de bundel van de condensator. De laserbundel moet cirkelvormig zijn en een uniforme helderheid hebben. Het is soms nuttig om de op de rail gemonteerde lenzen aan te passen. Als de uitlijning correct is, moet u de laserbundel gelijkmatig kunnen uitbreiden en inkrimpen. U kunt de ingekrompen laserbundel met de op de rail gemonteerde spiegel centreren ten opzichte van de minimaal gecentreerde condensatorbundel en deze vervolgens uitbreiden naar de gewenste grootte. Nadat u de positie van de ingekrompen bundel met de spiegel op de rail heeft aangepast, moet u de bovenop gemonteerde periscoopspiegel opnieuw afstellen om een uniforme helderheid van de uitgebreide bundel te behouden. Als u geen cirkelvormige, gecentreerde laserbundel kunt verkrijgen, moet u de eerdere uitlijningsstappen opnieuw doorlopen.

Figuur 5 Centreer de ablatiespot en stel de convergentie van de laserstraal af voor een optimale focus. Schakel de laser uit en sluit de sluiter. Verwijder het papier en monteer de gespiegelde target-objectglasplaat (u kunt ook permanente markerinkt op een dekglas als target gebruiken)²). Beeld de krassen op het spiegeloppervlakK met de 60X 1,4na olie-objectief). Beeld het oppervlak nu met een confocale microscoop of CCD-camera. Kijk niet door de oculairs terwijl de laser is ingeschakeldZet de laser aan en open de sluiter. Stel de laser in op trigger-modus, het laagste vermogen en 10 Hz. Trigger ongeveer 10 pulsen. Er zou een ablatiespot met een diameter van 1-5 µm zichtbaar moeten zijn binnen 10 µm van het centrum van het gezichtsveld. Als er geen ablatiespot zichtbaar is, kan het laservermogen in stappen van 5-10% worden verhoogd. Zodra een ablatiespot is geïdentificeerd, moet deze in het midden van het gezichtsveld worden geplaatst. Plaats het vizier op de coördinaten 256, 256 bij een 512X512-afbeelding. Als de laserspot naar het midden wordt verschoven, zal de positie bij het zoomen niet veranderen. Gebruik de op de rail gemonteerde spiegel om de ablatiespot naar het centrale vizier te verplaatsen. Evalueer de uniformiteit van de laserstraal opnieuw door naar de straal te kijken zonder objectief, zoals hierboven beschreven in Figuur 4. Pas de uniformiteit van de straal aan met de bovenop de periscoop gemonteerde spiegel. Herhaal de evaluatie van de positie van de ablatiespot. Dit is een iteratief proces dat moet worden herhaald totdat de ablatiespot gecentreerd is en de uitgebreide straal uniform is. Indien correct uitgevoerd, zal de ablatiespot cirkelvormig zijn, zoals te zien is bij de ablatiespot in focus in de figuur. Evalueer vervolgens de focus van de laserstraal in de Z-as. Trigger de laser om een ablatiespot van ongeveer 1 µm in het centrum te produceren. Verplaats de slide nu ongeveer 5 µm zijdelings en focus 1 µm onder het oppervlak van de target-slide. Trigger de laser met dezelfde laserinstellingen als gebruikt voor de eerste ablatiespot. Herhaal dit na het focussen op 1 µm boven het oppervlak van de target-slide. Als de laserstraal is gefocust op de beeldfocus, zou er een patroon zichtbaar moeten zijn dat vergelijkbaar is met het patroon in deze figuur. De grootste ablatiespot moet overeenkomen met de beeldfocus, en de ablatiespotten boven en onder de focus moeten symmetrisch kleiner worden. Pas lens L3 aan om de brandvlakken uit te lijnen. Door lens L3 van de microscoop af te bewegen, wordt de straal convergenter en zal de ablatiespot zich dichter bij het objectief bevinden. Kleine

Figuur 6 Het fixeren van wormen voor laser-axotomie en time-lapse imaging. 10% agarose in zoutoplossing wordt verhit tot het volledig is gesmolten. Een kleine druppel wordt op een glazen microscoopdia geplaatst en vervolgens met een andere dia platgedrukt om een platte pad te vormen. De dikte van de pad wordt bepaald door tape aan te brengen op twee naast elkaar gelegen dia's. De pad krijgt ongeveer 1 minuut de tijd om te stollen, waarna de dia's worden gescheiden. De dop van een "Sharpie" wordt als uitsteker gebruikt om een pad van een uniforme grootte van ongeveer 13 mm te vormen. 1 $\mu$l 10 mM muscimol en 1 $\mu$l microsferen worden aan het midden van de pad toegevoegd (persoonlijke communicatie Fang-Yen). Wormen worden aan de druppel van 2 $\mu$l toegevoegd en georiënteerd voordat het glazen dekglas wordt geplaatst. Vaseline wordt vervolgens met een spuit (20-25 ga. naald) op de rand van het dekglas aangebracht om het af te dichten.

Figuur 7 Typische resultaten van laser-axotomie in C. elegansIn A is het intacte axon kort voor en na laseraxotomie te zien. De opening is gewoonlijk ongeveer 0,5-1 μm. B toont de laseraxotomie van één axon zonder schade toe te brengen aan een nabijgelegen axon op ongeveer 1 μm afstand. De laser was ingesteld op ongeveer 10% vermogen (gemiddeld 0,3 mW bij 250 Hz), met 10 pulsen. De schaalbalk is 5 μm.

Figuur 8Typische regeneratie van wildtype L4. Dit is een tijdserie die de ablatie en time-lapse opname van axonale regeneratie laat zien. Kort na de laseraxotomie bij 0 minuten is de retractiebol zichtbaar. Bij 138 minuten is de retractiebol tot in het maximale extent teruggetrokken en is de remodellering begonnen. Sporadische membraanuitstulpingen (microspikes of filopodia) zijn zichtbaar langs de axonale schacht (pijlen bij 138 en 324). De rechterstomp vertoont bij 360 minuten een goed gevormde, compacte groeikegel. Bij 414 minuten hebben beide stompen groeikegels ontwikkeld. De initiële, embryonale groeikegels worden dystroof naarmate ze zich naar het dorsale zenuwstreng uitstrekken (414, 519 en 597 minuten). De dystrofe groeikegels stagneren vlak voor het dorsale zenuwstreng (960 minuten). Pijlpuntjes geven de proximale stomp en de groeikegels aan. Pijlen geven membraanuitstulpingen langs de proximale axonale schacht aan. Schaalbalk 20 µm.

Video 1. Film van axonregeneratie bij het wildtype. Deze film komt overeen met de tijdspunten die in Figuur 8 worden weergegeven. Wormen werden gemonteerd zoals beschreven in het protocol en axonen werden elke drie minuten gedurende ongeveer 10 uur gefotografeerd. Bij elk tijdspunt werden z-stacks (20 x 1 µm) gemaakt en samengevoegd tot enkele afbeeldingen met behulp van een maximumprojectie-algoritme (NIS Elements). Klik hier om de video te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende goede discussies over laser-microschirurgie met verschillende lasersystemen^3,5-11. Femtoseconde-IR-lasers zijn de "gouden standaard" voor subcellulaire laserablatie¹² en zijn handig als ze gekoppeld zijn aan een beeldvormingsfaciliteit, maar ze zijn vaak te kostbaar voor individuele gebruikers. Als u een femtoseconde-IR-laser nodig heeft voor de beeldvorming van uw monster vanwege de beelddiepte, dan heeft u er waarschijnlijk ook een nodig voor laser-axotomie. Transparante weefsels met doelaxonen binnen 30-50 µm van het oppervlak zijn waarschijnlijk haalbaar met blauwe en groene pulslasers in het bereik van 20 µJ/puls, gericht via een immersielens met een hoge na. Er zal meer collaterale schade zijn met nano- en picoseconde-lasers vergeleken met de femtoseconde-laser, vooral naarmate de diepte van het doelaxon toeneemt. C. elegans is transparant en alle axonen bevinden zich binnen 20-30 µm van het oppervlak. Wij snijden routinematig motorische axonen die zich binnen 5 µm van het oppervlak bevinden. We hebben ook met gemak axonen binnen de zenuwring gesneden die ongeveer 20 µm van het cuticulaoppervlak afliggen. We stelden vast dat de grens voor het doorsnijden van axonen ongeveer 30-50 µm is door de diameter van een volwassen worm. Het is waarschijnlijk dat het hier beschreven laserablatiesysteem goed zou werken bij veel verschillende preparaten die voldoen aan de criteria van transparantie en diepte van de doelaxonen. Toch is het enigszins verrassend, gezien de theoretische voordelen van femtoseconde-IR-lasers, dat nano- en picoseconde 355 nm en 532 nm lasers zo goed presteren voor laser-axotomie in C. elegans^6,13. We zien geen verschillen in axonregeneratie als reactie op laser-axotomie met nanoseconde 440 nm, nanoseconde 532 nm en femtoseconde-IR-lasers.

Solid-state 355 nm UV-lasers kosten ongeveer hetzelfde als de 532 nm diode-gepompte passief Q-geswitchte solid-state laser, maar vereisen ofwel hogere vermogens of optica die deze kortere golflengten efficiënt doorlaten. De meeste optica zijn ontworpen om goed te functioneren met zichtbaar licht van 400-700 nm. 355 nm lasers zouden enkele voordelen bieden⁶, zoals een verlaagde plasmadrempel, een kleinere spotgrootte, en een long-pass dichroïsche spiegel zou 100% van de ablatielaser efficiënt naar het doel richten en gelijktijdige beeldvorming van GFP mogelijk maken zonder verlies van het monstersignaal. Blauwe 440 nm lasers zouden de voordelen van het werken met een zichtbaar lichtlaser behouden (goede prestaties met standaardoptica en veiligheid). Helaas zijn de kosten van een DPP Q-geswitchte solid-state 440 nm laser op dit moment 3 maal zo hoog als die van een 355 nm of 532 nm laser met vergelijkbaar vermogen. Als we een nieuw systeem zouden ontwerpen voor C. elegans, waarbij de doeldiepte minimaal is, zouden we kiezen voor een UV-transparante lens (kosten ongeveer $3.000 voor een 40X 1.3na olie-lens met 50-70% transmissie bij 355 nm) en een 355 nm laser die 5-10 uJ/puls produceert bij 1-20 kHz.

Men gaat ervan uit dat axon-ablatie het gevolg is van plasmavorming. Kortere pulsen genereren plasmadrempels bij een lager vermogen en de plasmavolumes zullen kleiner zijn⁶. Het doel is om het kleinste en kortstlevende plasma te creëren door de pulsenergie naar het laagste vermogen aan te passen. Grotere, langdurige plasma's genereren cavitatiebellen die de omringende cellen beschadigen. Over het algemeen hebben we vastgesteld dat ablatie met ongeveer 50-100 pulsen bij de hoogste frequentie (d.w.z. 2,5kHz) de beste resultaten geeft. Dit suggereert dat schade geleidelijk kan worden opgebouwd over een reeks pulsen om de omvang van de schade beter te beheersen. Het hier beschreven laserablatiesysteem is zeer vergevingsgezind, mits de bundel nauwkeurig is uitgelijnd en uitgebreid. We beginnen met het doorsnijden van axonen in volwassen wormen bij 10% laservermogen (gemiddeld 0,3 mW gemeten bij 2500 Hz en geschat op 1 uJ/puls) en kunnen doorsnijden met beperkte lokale schade tot 14% vermogen. Vanaf 15-39% laservermogen kunnen grotere beschadigde gebieden worden waargenomen, maar pas boven 40% vermogen (gemiddeld ongeveer 1 mW gemeten bij 2500 Hz) exploderen de wormen door grote cavitatiebellen en schade aan de cuticula van de worm.

Het artikel van Steinmeyer et al. 2010² is een uitstekende bron voor het construeren van een laserablatiesysteem. Leon Avery heeft ook een mooie praktische beschrijving van een laserablatiesysteem gebaseerd op een goedkope N2-gaslaser van 337 nm en hij geeft enkele goede praktische adviezen (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Bij het ontwerpen van uw eigen systeem moet u eerst overleggen met uw microscoopvertegenwoordiger om te bepalen hoe de ablatielaser op het microscoopobjectief kan worden gericht. Uw microscoop moet worden geplaatst op een trillingsisolatietafel (Newport, TMI, Thor). Een breadboard-blad is optimaal, maar een massief stalen blad kan nog steeds worden gebruikt met magnetische positioneers. Een speciale tussenmodule op een rechtopstaande microscoop is handig omdat alle optische elementen op hun plaats kunnen blijven. Het kan echter goedkoper en praktischer zijn om een cameraport (geïnverteerd) of een "combiner" te gebruiken die is bevestigd aan een epi-fluorescentieport. U moet de grootte van de achteropening en de transmissie (bij de golflengte van de ablatielaser) van de objectieflens die u wilt gebruiken, weten. Zodra u een laser heeft gekozen (bijv. Crylas, TEEM, Crystal of CRC), dient u contact op te nemen met Thor of Newport voor hulp bij het selecteren van de juiste optische elementen, hardware en veiligheidsapparatuur. Wij hebben gekozen voor een dubbele Galileïsche straalexpander om ruimte te besparen, maar een eenvoudigere Kepleriaanse expander is ook een optie (f2/f1=expansiefactor). Een op maat gemaakte straalexpander is het goedkoopst, maar Newport, Thor en verschillende laserfabrikanten bieden commerciële straalexpanders van uitstekende kwaliteit aan. Sommige laserfabrikanten bieden ook handmatige en elektronisch gestuurde attenuatoren aan die kosteneffectief en ruimtebesparend kunnen zijn, maar niet zo veelzijdig als de Glan-Thompson-polarisator en de halve-golfplaat. U moet ook beslissen hoe u de laser wilt aansturen. U kunt een LabView-gebaseerde controller ontwerpen, een commerciële TTL-generator gebruiken of software gebruiken die door het laserbedrijf wordt geleverd. Bespreek de opties met de specifieke laserfabrikant.

We hebben een lijst van de gebruikte hardware bijgevoegd, uitsluitend als algemene richtlijn. Het hier beschreven systeem kostte ongeveer $15,000 toen het aan ons bestaande imagingsysteem werd toegevoegd. Uw lokale afdeling Natuurkunde heeft vaak iemand die bereid is een praktische introductie te geven over het veilig werken met vrije-straal lasers.

Alternatieve methoden voor immobilisatie en time-lapse imaging van C. elegans zijn onlangs beschreven.¹⁴

Probleemoplossing

De meest moeilijke en kritische stap is de uitlijning van de gecentreerde, uitgebreide bundel op de optische as van de microscoop. Zodra de bundel gecentreerd en uitgebreid is via de Galileï-lenzen, moet u er alles aan doen om deze binnen 5 um van de optische as van de microscoop uit te lijnen VOORDAT u de stuurspiegels gebruikt voor de uiteindelijke uitlijning op het centrum. Overmatig gebruik van de stuurspiegels om de bundel op de microscoop uit te lijnen, zal deze uit de as van de bundeluitbreider verschuiven. MET UITERSTE VOORZICHTIGHEID kunt u de laserbundel attenueren met het juiste ND-filter en het laserbundelprofiel direct bekijken op een reflecterend doel (front-surface spiegel). U kunt de microscoop voorzichtig verschuiven om de bundel precies in het gezichtsveld van het 60X objectief te centreren (als dit in het op/neer-bereik niet kan worden gecentreerd, moet de railhoogte worden aangepast). Het bundelprofiel kan worden gebruikt om de optische as van de microscoop nauwkeurig uit te lijnen, zodat een gecentreerde bundel ontstaat die cirkelvormig is en symmetrisch "uitwaaiert". Een asymmetrische uitwaaiering is een indicatie dat de microscoopas niet perfect is uitgelijnd (of dat de rail niet waterpas staat). Ten slotte moet u L3 aanpassen, waarbij een gelijkmatige en symmetrische expansie en contractie van de bundel zichtbaar moet zijn. Stel de microscoop nauwkeurig scherp op het doeloppervlak en pas vervolgens L3 aan om de laserbundel te focussen tot de kleinste spot. U zult nu merken dat de laserbundel zich binnen 5 um van het centrum bevindt wanneer deze wordt afgebeeld via LSCM of een CCD-systeem, en dat de ablatiespot zich binnen 1um van de Z-focus bevindt.

Als u merkt dat u wormen "opblaast" of consistent grote cavitatiebellen genereert bij het doorsnijden van axonen, ligt het probleem zeer waarschijnlijk bij de fijne uitlijning van de ablatielaser. Zorg ervoor dat de minimale (<500nm) ablatiespot gelokaliseerd is op de Z-focus (pas de convergentie aan met de L3-lens) en op het XY-fiduciaire punt (pas aan met de laatste kinematisch gemonteerde spiegel).

Het targeten van axonen die dichter bij het oppervlak liggen, vereist minder laservermogen. Op dezelfde manier zullen kleinere dieren (L1 en L2) minder laservermogen nodig hebben voor axotomie in vergelijking met het targeten van dezelfde axonen bij volwassenen.

Als uw wild-type axonen niet regenereren of als de axonen bleken, dient u te proberen het vermogen van de beeldvormingslaser te verlagen of de bemonsteringssnelheid te verkleinen. Als uw wormen sterven of ziek worden, probeer dan het agarosepercentage in stappen van 1% te verlagen. Zorg ervoor dat u het dekglas niet verschuift na het monteren van de wormen, aangezien dit vaak tot hun dood leidt bij gebruik van een hoog agarosepercentage en microsferen.

Als uw wormen knappen of sterven tijdens een time-lapse sessie, is dit te wijten aan: 1. Het percentage agarose is te hoog. 2. Beschadiging van de cuticula door de ablatielaser. 3. Verschuiving van het dekglas na het monteren. Indien beschadiging van de cuticula de oorzaak is, zal dit alleen invloed hebben op gemonteerde wormen die met de ablatielaser zijn behandeld.

Als uw worm te veel beweegt tijdens een time-lapse-sessie, probeer dan het agarosepercentage in stappen van 0,5% te verhogen. Gezonde axonen in gezonde wormen zijn altijd "actief" en vertonen een constant fluorescentieniveau. Als u een plotselinge afname in fluorescentie of activiteit ziet, is de worm stervend of dood. Meerdere gekraalde of gefragmenteerde axonen zijn een zeker teken van een stervende of dode worm.

Als u problemen heeft om uw axonen gedurende de gehele time-lapse-sessie in focus te houden, kunnen daar verschillende oorzaken voor zijn. Controleer eerst de drift van uw tafel door gedurende 10 hrs een inert monster op een glazen objectglas te beeldvormen. Een drift van enkele microns kan worden veroorzaakt door thermische instabiliteit, maar meer dan 5 um is waarschijnlijk te wijten aan mechanische problemen met uw microscoop. Problemen met de montage komen vaker voor. Laat uw gemonteerde wormen 30 minuten equilibreren op uw microscooptafel voordat u met de time-lapse begint. Controleer of de Vaseline-afdichting geen lekken heeft ontwikkeld tijdens uw time-lapse-sessie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
535 nm Laser	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal en CRC bieden ook vergelijkbare lasers aan)
Alle optica en hardware			(Thor biedt vergelijkbare optica en hardware aan)
SUPREMA optische houder, 1,0-inch diameter	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
Stang van 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stangvork van 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Achromatische nulde-orde golfelplaat, ½ golfvertraging, 400-700nm	Newport Corp.	10RP52-1	1
Rotatietrap, 1" opening	Newport Corp.	RSP-1T	1
Stang van 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stangvork van 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Glan-Laser calciet polarisator, 430-700nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
Rotatiehouder voor polarisator	Newport Corp.	RM25A	1
¼" spacer voor stang van 1" diameter	Newport Corp.	PS-0.25	1
½" hoogte, stang van 1" diameter	Newport Corp.	PS-0.5	1
Vork, stang van 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Beam dump	Newport Corp.	PL15	1
Houder voor microscoopobjectief	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
Stang van 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stangvork van 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
High-Energy Nd:YAG laserspiegel, 25,4 mm diameter, 45°, 532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
SUPREMA optische houder, 1,0 inch diameter, montagegat met speling	Newport Corp.	SN100C-F	2
Hoge precisie knop-instelbout, 12,7 mm slag, 100 TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K	4
Schroefdrapadapter, ¼-20 mannelijk, 8-32 vrouwelijk	Newport Corp.	SS-1-B	2
Stangklem voor stang van 1,5 inch diameter	Newport Corp.	340-RC	2
Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog	Newport Corp.	40	1
Raildrager voor X26, vierkant 40 mm lengte	Newport Corp.	CN26-40	4
Stalen rail, 384 mm (15") lengte	Newport Corp.	X26-384	1
Stangplatform voor stang van 1,5 inch diameter	Newport Corp.	300-P	2
Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog	Newport Corp.	40	2
Plano-concave lens, 12,7 mm diameter, -25 mm EFL, 430-700 nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
Plano-convexe lens, 25,4 mm diameter, 50,2 mm EFL, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
Plano-convexe lens, 25,4 mm diameter, 62,9 mm EFL, 430-700 nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
Vaste lenshouder, 0,5" diameter, 1,0" ashoogte	Newport Corp.	LH-0.5	2
Vaste lenshouder, 1,0" diameter, 1,0" ashoogte	Newport Corp.	LH-1	2
Microsferen 0,1 µm	Polysciences, Inc.	00876
Agarose	Research Products International Corp.	A20090	EEO-kwaliteit
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523