De bouw van een Low-budget Laser axotomy Systeem om Axon Regeneration Study in C. elegans</em

Samenvatting

Laser-axotomie gevolgd door time-lapse imaging is een gevoelige methode om de effecten van mutaties in C. elegans op axonale regeneratie te analyseren. Een hoogwaardig, maar goedkoop laserablatiesysteem kan eenvoudig aan de meeste microscopen worden toegevoegd. Time-lapse imaging over een periode van 15 uur vereist een zorgvuldige immobilisatie van de worm.

Samenvatting

Laser axotomie gevolgd door time-lapse microscopie is een gevoelige assay voor axonregeneratie-fenotypen in C. elegans¹. De belangrijkste moeilijkheid van deze assay is de waargenomen kostprijs ($25-100K) en de technische expertise die vereist is voor de implementatie van een laserablatiesysteem^2,3. Echter, solid-state gepulste lasers tegen bescheiden kosten (<$10K) kunnen robuuste prestaties leveren voor laserablatie in transparante preparaten waarbij de doelaxonen "dicht bij" het weefseloppervlak liggen. De constructie en uitlijning van een systeem kan in één dag worden voltooid. Het optische pad van het licht vanuit de gefocuste condensor naar de ablatielaser dient als een handige uitlijningsgids. Een tussenmodule waarin alle optica zijn verwijderd, kan worden toegewezen aan de ablatielaser en waarborgt dat er geen optische elementen verplaatst hoeven te worden tijdens een laserablatiesessie. Een dichroïsche spiegel in de tussenmodule maakt simultane beeldvorming en laserablatie mogelijk. Het centreren van de laserstraal ten opzichte van de uitgaande straal van de gefocuste microscoopcondensorlens leidt de initiële uitlijning van het systeem. Verschillende lenzen worden gebruikt om de laserstraal te conditioneren en uit te breiden om de achteropening van de gekozen objectieflens te vullen. De uiteindelijke uitlijning en testen worden uitgevoerd met een voorzijde-gespiegelde glazen objectglasdoelwit. Het laservermogen wordt aangepast om een ablatieplek van minimale grootte te verkrijgen (<1um). De ablatieplek wordt gecentreerd door fijne aanpassingen van de laatste kinematisch gemonteerde spiegel ten opzichte van kruisdraadjes die in het beeldvenster zijn vastgelegd. Het laservermogen voor axotomie zal ongeveer 10X hoger zijn dan nodig voor de minimale ablatieplek op het doelwitglas (dit kan variëren afhankelijk van het door u gebruikte doelwit). Wormen kunnen worden geïmmobiliseerd voor laseraxotomie en time-lapse beeldvorming door ze te monteren op agarosepads (of in microfluïdische kamers⁴). Agarosepads worden eenvoudig gemaakt met 10% agarose in gebalanceerde zoutoplossing, gesmolten in een magnetron. Een druppel gesmolten agarose wordt op een objectglas geplaatst en met een ander objectglas platgedrukt tot een pad van ongeveer 200 um dik (een enkele laag tijdtape op aangrenzende glazen wordt als afstandhouder gebruikt). Een "Sharpie"-dop wordt gebruikt om een cirkelvormig pad met een uniforme diameter van 13mm uit te snijden. Anestheticum (1ul Muscimol 20mM) en microsferen (Chris Fang-Yen persoonlijke communicatie) (1ul 2,65% polystyreen 0,1 um in water) worden aan het centrum van het pad toegevoegd, gevolgd door 3-5 wormen die zo zijn georiënteerd dat ze op hun linkerzij liggen. Een glazen dekglas wordt aangebracht en vervolgens wordt vaseline gebruikt om het dekglas af te dichten en verdamping van het monster te voorkomen.

Protocol

1. Constructie van een laserablatiesysteem

Draag een laserbeschermbril en hanteer goede laserveiligheidspraktijken tijdens de initiële uitlijning. Kijk nooit door de oculairs wanneer de laser is ingeschakeld.

1. Plaats de componenten op de breadboard zoals weergegeven in Fig. 1 (zie ook voorbeeld²). Schroef de laser (met een verhogingsplaat indien nodig), de periscooppal en de verhoogde railsteunen vast.
2. Positioneer de microscoop zodat deze is uitgelijnd met de as van de rail. Lijn deze uit met de doorgelaten lichtstraal van de condensorlens van de microscoop. Lijn de railhoogte (gebruik een waterpas) en positie uit met een instelbare diafragma of een lens die aan de rail is bevestigd. Het diafragma of de lens moet aan beide uiteinden van de rail worden uitgelijnd met de condensorstraal. Labkrikken kunnen helpen bij de hoogteafstelling van de rail.
3. Lijn de Glan-Thompson polarisator en de halve-golfplaat uit met de laserstraal. De laser hoeft niet aan te staan om deze uitlijning uit te voeren. De straal moet simpelweg door beide componenten gaan zonder de randen te raken. Draai de polarisator om een handige oriëntatie en positie voor de beam dump te verkrijgen (fig.1). De halve-golfplaat wordt gedraaid om het laservermogen aan te passen. Bevestig de componenten aan het breadboard.
4. Zet de laser aan, stel de pulsfrequentie in op 100, kies de continue modus en reduceer het vermogen tot een minimum met behulp van de halve-golfplaat. Gebruik een Post-it of lenspapier om de laserstraal zichtbaar te maken.
5. Stel de kinematisch gemonteerde spiegels in volgorde vanaf de laser af en fixeer deze om de straal naar de spiegel te leiden die aan het uiteinde van de verhoogde rail is gemonteerd. De laserstraal moet ongeveer in het midden van de spiegels zijn uitgelijnd. De spiegels moeten ongeveer 45 graden ten opzichte van de as van de laserstraal zijn georiënteerd (fig.1).
6. Stel de kinematisch gemonteerde spiegel bovenop het periscoop en aan het uiteinde van de rail grof af om de laserstraal uit te lijnen met het midden van de doorgelaten lichtstraal van de microscoop. Zowel de laserstraal als de doorgelaten lichtstraal van de microscoop kunnen gelijktijdig worden gevisualiseerd door papier in het straalpad te plaatsen. Zorg ervoor dat eventuele ND-filters en diafragma's in de tussenmodule zijn verwijderd of volledig openstaan.
7. Lijn de laserstraal nauwkeurig uit met het midden van de doorgelaten lichtstraal met de fijninstellingen op de bovenste periscoop- en railspiegels. Houd het papier dicht bij de railspiegel en lijn de laserstraal uit met het midden van de doorgelaten lichtstraal met de bovenste periscoopspiegel. Houd het papier nabij de microscoopopening en lijn de laserstraal uit met het midden van de doorgelaten lichtstraal met de instellingen van de railspiegel (fig.2).
8. Plaats een Post-it in het straalpad tussen de uitgelijnde condensorlens en de open objectieftoren. De doorgelaten lichtstraal moet zichtbaar zijn, met de kleinere laserstraal nabij het centrum. Gebruik de fijninstellingen op de railspiegel om de laserstraal te centreren. Fixeer de microscoop op zijn plaats met klemmen.

Stappen 1.9-1.12 zijn optioneel, maar het is eenvoudig en nuttig om de uitlijning en laserablatie te beoordelen voordat de bundeluitbreidingslenzen worden geplaatst.

9. Schakel de laser uit en sluit de mechanische veiligheidssluiter. Draai de 50% dichroïsche spiegel uit de straalpad. Hoewel er geen direct laserlicht naar de oculairs zal gaan, kan het gereflecteerde licht zeer intens zijn. Plaats het target-preparaat voor de fijne uitlijning en beeldvorming met het 60X olie-objectief. Focus op krassen op het preparaat. Plaats het ND4- en ND8-filter in de tussenmodule.
10. Maak beelden van het target-preparaat met uw CLSM-, spinning disk- of CCD-camerasysteem. Draai de 50% dichroïsche spiegel in het laserpad. Vanaf dit punt mag u nooit door de oculairs kijken terwijl de ablatielaser aan staat. Schakel de ablatielaser in en stel de modus in op 'triggered', de frequentie op 100 en het aantal pulsen op 10. Zorg ervoor dat het vermogen nog steeds op minimum staat met de halve-golfplaat en open vervolgens de mechanische veiligheidssluiter. U kunt gelijktijdig beelden maken en de ablatielaser gebruiken.
11. Activeer de ablatielaser terwijl u beelden van het target-preparaat maakt. Controleer het target-preparaat op een ablatieplek van 1-10 µm in diameter. Verwijder opeenvolgend de ND-filters totdat er een ablatieplek zichtbaar is. Pas de ablatieplek aan naar het midden van het beeld met de railspiegel. Het is raadzaam om een ND-filter terug te plaatsen om ruimte te hebben om het laservermogen met de halve-golfplaat nauwkeurig te verhogen voor een ablatieplek van <1 µm. Maak beelden bij 0,2 µm/pixel of minder en pas de ablatieplek nauwkeurig aan naar het midden van het beeld (positie 256,256 bij een 512X512 beeld).
12. Controleer de scherptediepte en de as van de laserstraal. Focus 1-2 µm omhoog en omlaag en controleer de ablatiepositie en de grootte van de ablatieplek. Als de laserstraal axiaal is uitgelijnd, zal de ablatieplek niet verschuiven. De ongeconditioneerde laserstraal verdeelt het vermogen over meerdere µm (ongeveer 3-5 µm van de bovenkant naar de onderkant van de focus).

2. Voeg lenzen toe om de laserstraal uit te breiden zodat deze de achteropening van het objectief vult en pas de convergentie aan om de focus te regelen

1. Dit systeem maakt gebruik van dubbele Galileïsche straalverbreeders om de laserstraal te verbreden zodat deze de achteropening van het objectief (10 mm) vult. Monteer de 4 lenzen op houders en bevestig deze aan de rail (L1f1+L2f2 en L3f1'+L4f2'). Pas de posities aan zodat alle lenzen op dezelfde optische as liggen en exact orthogonaal staan ten opzichte van de laserstraal (fig. 2).
2. Zet de laser aan en stel deze in op het minimale vermogen en de continue modus. Stel de uitlijning van de straal door elke lens grofweg af door papier te gebruiken om de laserstraal en de doorgelaten lichtstraal van de microscoopcondensor te zien. Zet de laser uit en sluit de sluiter.
3. Verwijder de klemmen aan één zijde van de microscoop en schuif de microscoop uit het pad van de laserstraal. Zet de laser aan en verwijder de veiligheidssluiter.
4. De fijne uitlijning van de lenzen en de laserstraal kan worden uitgevoerd door de verbrede laserstraal op een nabijgelegen muur te bekijken. De straal moet symmetrisch uitbreiden en inkrimpen wanneer de lenzen worden verplaatst. Pas de laatste twee kinematisch gemonteerde spiegels aan om de straal uit te lijnen (fig.3).
5. Het uitgelijnde en verbrede straalprofiel moet cirkelvormig zijn en een uniforme helderheid hebben (fig.3). De grootte en uniformiteit van de straal kunnen worden bekeken met een Post-it op de geschatte positie van de achteropening van het objectief.
6. De straal moet worden ingesteld op nul convergentie voor optische systemen voor oneindig. Convergentie kan worden geschat door te observeren hoe de straalgrootte verandert terwijl u een Post-it verder van de lenzen weg beweegt. Zet de laser uit en sluit de mechanische sluiter.
7. Schuif de microscoop terug in het pad van de laserstraal, waarbij de vaste klemmen worden gebruikt om de juiste uitlijning te definiëren. Plaats de klemmen aan de vrije zijde van de microscoop terug, maar draai ze niet vast.
8. Zet de laser aan en verwijder de veiligheidssluiter. Draai de objectieftorens naar een open positie. Plaats een Post-it op de tafel. U moet de verbrede en uniforme laserstraal zien, gecentreerd op de doorgelaten lichtstraal van de condensor (fig.4). Mogelijk moet u deze centreren door de microscoopklemmen los te maken en de microscoop voorzichtig te verschuiven.
9. Sluit de veiligheidssluiter en stel de laser in op de triggermodus. Draai het 60X objectief op zijn plaats en beeld de oppervlakse krassen op het target-preparaat af.
10. Verwijder de veiligheidssluiter, trigger de ablatielaser en pas het laservermogen aan voor de kleinste ablatiespot. De ablatiespot moet cirkelvormig zijn en zich binnen 5-10 µm van het midden van het beeld bevinden.
11. Centreer de ablatiespot met fijne aanpassingen van de kinematisch gemonteerde railspiegel. U zult de op de rail gemonteerde spiegel en de bovenste periscoopspiegel iteratief moeten afstellen om zowel de ablatiespot te centreren als een uniform straalprofiel te behouden.
12. Evalueer de Z-focus van de laser door de focus systematisch in stappen van 1 µm omhoog en omlaag te verplaatsen en de ablatielaser te triggeren. De verbrede, uitgelijnde en op convergentie ingestelde straal moet maximaal ablateren bij de beeldfocus en zwak of helemaal niet 1 µm boven of onder de focus (fig 5).
13. Pas de Z-focus van de verbrede straal aan door lens L3 van de Galileïsche telescoop te verplaatsen (fig.2).

3. Laseraxotomie en time-lapse microscopie van axonregeneratie

1. Verhit 10% agarose (RPI Molecular Biology Grade EEO 0.1 A20090) in gebalanceerde zoutoplossing in de magnetron tot het volledig is gesmolten. Plaats het op een warmteplaat om het gesmolten te houden tijdens het gebruik voor montage.
2. Een druppel gesmolten agarose wordt op een glazen objectglas geplaatst en met een ander objectglas platgedrukt tot een plaatje van ongeveer 200 um dik (een enkele laag tijdstape op aangrenzende glazen wordt als afstandhouder gebruikt).
3. Een dop van een "Sharpie"-stift wordt gebruikt om een cirkelvormig plaatje met een uniforme diameter van 13 mm uit te snijden.
4. Anestheticum (1ul Muscimol 20mM) en microsferen (Chris Fang-Yen, persoonlijke communicatie) (1ul 2,65% polystyreen 0,1 um in water) worden aan het midden van het plaatje toegevoegd, gevolgd door 3-5 wormen die zo zijn georiënteerd dat ze op hun linkerzijde liggen. Een glazen dekglas wordt aangebracht en vervolgens wordt vaseline gebruikt om het dekglas af te dichten en verdamping van het monster te voorkomen (fig.6).
5. De ablatielaser wordt aan het begin van elke sessie uitgelijnd op het vizier, zoals hierboven beschreven. Sluit de laserbeveiligingssluiter.
6. Verwijder het laseruitlijningstarget en maak een afbeelding van een gemonteerde volwassen worm met een geschikte fluorescente marker in de doelneuronen. Maak afbeeldingen van axonen bij een vergelijkbare vergroting (0,2 um/pixel of hogere vergroting) en positioneer deze onder het vizier (fig.7).
7. Open de laserbeveiligingssluiter en activeer de ablatielaser tijdens het beelden. Evalueer het axon na het activeren van de laser en verhoog langzaam het laservermogen totdat het axon is doorgesneden. Voor het doorsnijden van axonen is ongeveer 10X meer laservermogen nodig dan voor het maken van een ablatieplek op het uitlijningstargetglas (ongeveer 1uJ/ ns puls). Wij snijden doorgaans met 100 pulsen bij 2,5 kHz en een vermogen ingesteld op ongeveer 0,27mW (gemiddeld vermogen gemeten bij het specimen met een Coherent FieldMaxII vermogensmeter en de laser ingesteld op continu bij 2500 Hz). De instelling voor het ablatielaservermogen zal consistent blijven voor het doorsnijden van axonen in toekomstige experimenten (fig.7).
8. Een succesvol doorgesneden axon vertoont een onderbreking van ongeveer 0,5-1 um zonder verlies van helderheid in de twee doorgesneden uiteinden (fig.7). Een groot verlies van helderheid of een grote opening (2-10 um) duidt vaak op uitgebreide schade voorbij het axon door een cavitatiebel. De proximale en distale axonen zullen zich scheiden en in de volgende 30 minuten retractiebolletjes vormen (fig. 8 en Movie).
9. Laat uw gemonteerde wormen 30 minuten equilibreren met uw microscooptafel voordat u begint met de time-lapse opname. Dit minimaliseert drift als gevolg van temperatuurverschillen en krimp van de agarose.
10. ) Time-lapse beeldparameters worden ingesteld met de beeldsoftware die bij uw systeem hoort. Wij maken doorgaans afbeeldingen van 10-20 Z-stappen (1um/stap) bij 0,1-0,2 um/pixel met instellingen voor gain, pinhole, scansnelheid en laservermogen die de blootstelling minimaliseren terwijl de gewenste ruimtelijke resolutie wordt behaald. De bemonsteringsintervallen zijn gewoonlijk 1-5 minuten over 15 uur, afhankelijk van de gewenste temporele resolutie (fig. 8 en Movie).
11. Time-lapse beeldgegevens worden omgezet in movies met NIS Elements of ImageJ.

4. Representatieve resultaten:

Laser-axotomie met dit systeem is betrouwbaar en routinematig. De resultaten in figuur 7 zijn typerend. Time-lapse imaging van axonale regeneratie is zeer robuust met dit protocol. Wij snijden en beelden routinematig tot 5 axonen in 5 verschillende wormen op één enkele slide met behulp van een gemotoriseerde tafel. De enige beperking is de tijd die nodig is om de beelden van elk axon te verzamelen; als het bijvoorbeeld 20 seconden duurt om een stack voor een axon te verzamelen, kun je maximaal 9 axonen (9 stacks) samplen als je elke 180 seconden samplt. Het voorbeeld in figuren 8 en 9 is een representatief resultaat. Ongeveer 10% van de experimenten levert resultaten van deze kwaliteit op. De overige experimenten leveren goede gegevens over het regeneratiefenotype, maar zijn esthetisch minder aantrekkelijk vanwege kleine trillende bewegingen van de worm die over het algemeen beginnen na 5-8 uur immobilisatie.

Figuur 1 Laserablatiesysteem. De 532 nm Nd:Yag-laser is gemonteerd op een verhogingsplaat om deze op gelijke hoogte met de andere componenten te brengen en is vastgeschroefd aan de optische tafel. (De optische isolator is optioneel en waarschijnlijk niet nodig). De Glan-Thompson-polarisator en de halve-golfplaat worden gebruikt om het laservermogen nauwkeurig te regelen. Deze bevinden zich in nauwkeurig gekalibreerde rotatiehouders. Let bij het plaatsen van de beam dump goed op. De hoekspiegel richt de laserstraal naar de onderste periscoopspiegel. De bovenste periscoopspiegel richt de straal naar de railspiegel. De rail is gemonteerd op twee door stangen ondersteunde platforms. Dubbele Galileïsche lenzen zijn bevestigd aan schuifrailhouders. Let op de toegevoegde tussenmodule die specifiek voor de ablatielaser is bestemd. Het systeem zou compacter gemaakt kunnen worden door de optische isolator en de hoekspiegel te verwijderen en de laser, de Glan-Thompson-polarisator en de halve-golfplaat aan de achterrand van de optische tafel te positioneren.

Figuur 2 Dubbele Galileïsche conditioneringslenzen worden gebruikt om de 300 um TEMoo laserstraal uit te breiden tot een uniforme grootte van 10 mm met nul convergentie. Een laboratoriumkrik is geplaatst onder een van de platforms die de rail ondersteunen. Dit helpt bij het aanpassen van de railhoogte tijdens de uitlijnstappen. Pas de railhoogte grofweg aan door de L1-lens op de rail te monteren en de condensatorstraal als uitlijngids te gebruiken. Stel de rail zo in dat de condensatorstraal aan beide uiteinden van de rail is uitgelijnd met het centrum van de lens. Dit garandeert dat de rail parallel is uitgelijnd met de optische as van de microscoop. Mogelijk moet u eerst de microscoop aanpassen om overeen te komen met de optische as van de rail. Gebruik klemmen om de positie van de microscoop vast te zetten (zie fig. 1). Verwijder de op de rail gemonteerde lens. Lijn nu de laserstraal uit met het centrum van de condensatorstraal aan beide uiteinden van de rail. Een stuk papier in het straalpad is een handige manier om beide stralen gelijktijdig te zien. Gebruik de bovenste periscoopspiegel om de laserstraal uit te lijnen met de condensatorstraal nabij de op de rail gemonteerde spiegel. Gebruik de op de rail gemonteerde spiegel om de laserstraal uit te lijnen met de condensatorstraal aan het verre uiteinde van de rail (het dichtst bij de microscoop). Monteer nu alle vier de lenzen op de rail zoals weergegeven in de figuur. De lengte van de rail, de brandpuntsafstand van de lenzen en de lensopstellingen variëren afhankelijk van uw microscoop en fysieke opstelling. Kritische parameters zijn de diameter van de laserstraal en de grootte van de achteropening van het gekozen objectief. Oneindig-optische systemen zullen een perfect parallelle laserstraal focussen (nul convergentie). De afstand tussen L1 en L2 moet de som zijn van de brandpuntsafstanden van de lenzen, f1+f2, en de afstand tussen L3 en L4 moet dienovereenkomstig f1'+f2' zijn. De afstand tussen de dubbele Galileïsche paren is niet kritisch. De positie van L3 kan nauwkeurig worden afgesteld om de straalconvergentie te beheersen; aanpassingen van <1mm zullen nodig zijn om de focus van de laser aan te passen aan de beeldfocus. Zorg ervoor dat alle lenzen, filters, diafragma's, etc. uit de tussenmodule worden verwijderd die zich in het straalpad kunnen bevinden (of wees u bewust van hun werking en pas uw systeem dienovereenkomstig aan).

Figuur 3 Uitlijning van de laserstraal door de dubbele Galileïsche lenzen. Verwijder de microscoopklemmen aan één zijde van de microscoop, zodat de microscoop uit het straalpad kan worden bewogen, terwijl de resterende klemmen het mogelijk maken om de microscoop nauwkeurig opnieuw te positioneren. Denk aan laserveiligheid. Zorg ervoor dat het laservermogen met de Glan-Thompson-polarisator tot een minimum is ingesteld. Schakel de laser in en bekijk het laserstraalpatroon op de muur. Het kan helpen om een vel papier op de muur te plakken om de laserspot beter te kunnen zien. Pas de posities van de lenzen systematisch aan om een gevoel te krijgen voor hun effect op de straalgrootte en het uiterlijk. U zou iets moeten zien dat lijkt op paneel A, waarbij een intense spot excentrisch is gelegen in een zwakker profiel. Gebruik de op de rail gemonteerde spiegel om de intense spot naar het centrum te verplaatsen, zoals getoond in paneel B. Gebruik nu de spiegel van de bovenste periscoop om een uniform perifeer profiel te verkrijgen. Als alles correct is uitgelijnd, zult u merken dat het verplaatsen van de lenzen ervoor zorgt dat de straal symmetrisch uitbreidt en inkrimpt. Verplaats de lenzen terug naar de startposities zoals getoond in figuur 2. Onderbreek nu de straal op de afstand van de achteropening van het objectief. Deze moet circulair zijn, minstens groot genoeg om de achteropening te vullen, en van een uniforme helderheid. Het is geen probleem als de straal groter is, zolang u voldoende laservermogen heeft voor uw ablaties. Evalueer de convergentie door de straaldiameter op de afstand van de achteropening van het objectief te vergelijken met die op de muur. Voor een straal met nul convergentie moet de straaldiameter identiek zijn. De schaalbalk is 10mm.

Figuur 4 Uitlijning van de uitgebreide laserstraal op de condensorstraal. Sluit de laserluik en schuif de microscoop terug in het pad van de laserstraal, waarbij de klemmen als uitlijningsstops dienen. Zet de condensorstraal aan, lijn deze uit en focus deze met behulp van een objectief. Plak papier over de oculairs om te voorkomen dat iemand het intense gereflecteerde laserlicht bekijkt. Draai de objectiefrevolver naar een open positie. Plaats een stuk papier op de tafel om de condensorstraal af te dekken. Zet de laser in de continue modus en verwijder het mechanische veiligheidsluik. Er zou nu laserlicht door de microscoop moeten komen. Draai de microscoopklemmen los en verschuif de microscoop voorzichtig om de laserstraal uit te lijnen met de condensorstraal. De laserstraal moet cirkelvormig zijn en een uniforme helderheid hebben. Het is soms nuttig om de op de rail gemonteerde lenzen aan te passen. Als de uitlijning correct is, zou u de laserstraal gelijkmatig moeten kunnen uitbreiden en inkrimpen. U kunt de ingekrompen laserstraal met de op de rail gemonteerde spiegel centreren ten opzichte van de minimaal gecentreerde condensorstraal en deze vervolgens uitbreiden tot de gewenste grootte. Zodra u de positie van de ingekrompen straal met de railspiegel heeft aangepast, moet u de bovenop gemonteerde periscoopspiegel opnieuw afstellen om een uniforme helderheid van de uitgebreide straal te behouden. Als u geen cirkelvormige, gecentreerde laserstraal kunt verkrijgen, moet u de eerdere uitlijningsstappen opnieuw doorlopen.

Figuur 5 Centreer de ablatieplek en pas de convergentie van de laserstraal aan voor een optimale focus. Schakel de laser uit en sluit de sluiter. Verwijder het papier en monteer het gespiegelde target-objectglas (u kunt ook permanente markerinkt op een dekglas als target gebruiken²). Maak beelden van krassen op het gespiegelde oppervlak met de 60X 1.4na olie-lens. Maak nu beelden van het oppervlak met een confocale microscoop of CCD. Kijk niet door de oculairs terwijl de laser aan staat. Schakel de laser in en open de sluiter. Zet de laser in trigger-modus, op het laagste vermogen en 100 Hz. Trigger ongeveer 10 pulsen. U zou een ablatieplek met een diameter van 1-5 µm moeten zien binnen 10 µm van het centrum van het gezichtsveld. Als u geen ablatieplek ziet, kunt u het laservermogen in stappen van 5-10% verhogen. Zodra u een ablatieplek identificeert, centreert u deze in het gezichtsveld. Plaats het kruisdraad op coördinaten 256, 256 bij weergave van een 512X512 beeld. Als u de laserplek centreert, zal deze niet van positie veranderen bij het zoomen. Gebruik de op de rails gemonteerde spiegel om de ablatieplek naar het centrale kruisdraad te verplaatsen. Evalueer de uniformiteit van de laserstraal opnieuw door naar de straal te kijken met het objectief verwijderd, zoals hierboven beschreven in Figuur 4. Pas de uniformiteit van de straal aan met de bovenop de periscoop gemonteerde spiegel. Herhaal de evaluatie van de positie van de ablatieplek. Dit is een iteratief proces dat moet worden herhaald totdat de ablatieplek gecentreerd is en de uitgebreide straal uniform is. Indien correct uitgevoerd, zal de ablatieplek cirkelvormig zijn, zoals te zien is bij 'Focus' in de figuur. Evalueer vervolgens de focus van de laserstraal in de Z-as. Trigger de laser om een ablatieplek van ongeveer 1 µm in het centrum te produceren. Verplaats nu het objectglas ongeveer 5 µm zijdelings en focus 1 µm onder het oppervlak van het target-objectglas. Trigger de laser met dezelfde laserinstellingen als u voor de eerste ablatieplek heeft gebruikt. Herhaal dit na het focussen op 1 µm boven het oppervlak van het target-objectglas. Als de laserstraal is gefocust op de beeldfocus, zou u een patroon moeten zien dat vergelijkbaar is met dat in deze figuur. De grootste ablatieplek zou moeten overeenkomen met de beeldfocus en de ablatieplekken boven en onder de focus zouden symmetrisch kleiner moeten worden. Pas lens L3 aan om de brandvlakken uit te lijnen. Door lens L3 van de microscoop af te bewegen, wordt de straal convergenter en komt de ablatieplek dichter bij het objectief te liggen. Kleine aanpassingen van <1 mm zullen nodig zijn nabij de focus. U bent nu klaar om axonen door te snijden. De schaalbalk is 1 µm.

Figuur 6 Monteren van wormen voor laseraxotomie en time-lapse imaging. Agarose 10% in zoutoplossing wordt verhit tot het volledig is gesmolten. Een kleine druppel wordt op een glazen microscoopglaasje geplaatst en vervolgens platgedrukt met een ander glaasje om een plat pad te vormen. De dikte van het pad wordt bepaald door tape op twee aangrenzende glaasjes. Het pad krijgt ongeveer 1 minuut de tijd om te stollen, waarna de glaasjes worden gescheiden. De dop van een "Sharpie" wordt als uitsteekvorm gebruikt om een pad van een uniforme grootte van ongeveer 13mm te vormen. 1 µL van 10mM Muscimol en 1 µL microsferen worden aan het centrum van het pad toegevoegd (persoonlijke communicatie Fang-Yen). Wormen worden toegevoegd aan de druppel van 2 µL en georiënteerd voordat het glazen dekglas wordt geplaatst. Vaseline wordt vervolgens met een spuit (20-25 ga. naald) op de rand van het dekglas aangebracht om het af te dichten.

Figuur 7 Typische resultaten van laseraxotomie bij C. elegans. In A is het intacte axon kort voor en na de laseraxotomie te zien. De opening is gewoonlijk ongeveer 0,5-1 µm. B toont de laseraxotomie van één axon zonder schade aan een nabijgelegen axon op ongeveer 1 µm afstand. De laser was ingesteld op ongeveer 10% vermogen (gemiddeld 0,3 mW bij 2500 Hz) en 100 pulsen. De schaalbalk is 5 µm.

Figuur 8. Typische regeneratie bij wildtype L4. Dit is een tijdserie die de ablatie en time-lapse opname van axonale regeneratie laat zien. Kort na de laseraxotomie op 0 minuten is de retractiebol zichtbaar. Tegen 138 minuten is de retractiebol tot het uiterste teruggetrokken en is de remodellering begonnen. Sporadische membraanuitstulpingen (microspikes of filopodia) zijn zichtbaar langs de axonschacht (pijlen bij 138 en 324). De rechterstomp vertoont een goed gevormde, compacte groeikegel bij 360 minuten. Bij 414 minuten hebben beide stompen groeikegels uitgestrekt. De initiële embryonale groeikegels worden dystrofisch terwijl ze zich in de richting van het dorsale zenuwstreng uitstrekken (414, 519 en 597 minuten). De dystrofe groeikegels stagneren vlak voor het dorsale zenuwstreng (960 minuten). Pijlpunten duiden de proximale stomp en de groeikegels aan. Pijlen duiden membraanuitstulpingen langs de proximale axonschacht aan. Schaalbalk 20um.

Film 1. Film van axonregeneratie bij het wildtype. Deze film komt overeen met de tijdspunten die worden weergegeven in Figuur 8. Wormen werden gemonteerd zoals beschreven in het protocol en axonen werden elke drie minuten gedurende ongeveer 10 uur in beeld gebracht. Z-stacks (20 X 1um) werden op elk tijdstip genomen en samengevoegd tot enkele beelden door middel van een maximumprojectie-algoritme (NIS Elements). Klik hier om de film te bekijken.

Discussie

Er zijn verschillende goede discussies over laser-microchirurgie met verschillende lasersystemen^3,5-11. Femtoseconde IR-lasers zijn de "gouden standaard" voor subcellulaire laserablatie¹² en zijn handig indien gecombineerd met een imaging-faciliteit, maar ze zijn vaak te kostbaar voor individuele gebruikers. Als u een femtoseconde IR-laser nodig heeft voor de beeldvorming van uw monster vanwege de beelddiepte, dan heeft u er waarschijnlijk ook een nodig voor laser-axotomie. Transparante weefsels met doelaxonen binnen 30-50 µm van het oppervlak zijn waarschijnlijk haalbaar met blauwe en groene pulslasers in het bereik van 20 µJ/pulse, gericht via een immersielens met een hoge na. Er zal meer collaterale schade optreden met nano- en picoseconde-lasers vergeleken met de femtoseconde-laser, vooral naarmate de diepte van het doelaxon toeneemt. C. elegans is transparant en alle axonen bevinden zich binnen 20-30 µm van het oppervlak. Wij snijden routinematig motorische axonen die zich binnen 5 µm van het oppervlak bevinden. We hebben ook met gemak axonen in de zenuwring gesneden die ongeveer 20 µm van het cuticulaoppervlak liggen. We stelden vast dat de limiet voor het snijden van axonen ongeveer 30-50 µm bedraagt over de diameter van een volwassen worm. Het is waarschijnlijk dat het hier beschreven laserablatiesysteem goed zou werken met veel verschillende preparaten die voldoen aan de criteria van transparantie en diepte van de doelaxonen. Toch is het enigszins verrassend, gegeven de theoretische voordelen van femtoseconde IR-lasers, dat nano- en picoseconde 355 nm en 532 nm lasers zo goed presteren voor laser-axotomie in C. elegans^6,13. We zien geen verschillen in axonregeneratie als reactie op laser-axotomie met nanoseconde 440 nm, nanoseconde 532 nm en femtoseconde IR-lasers.

Solid-state 355 nm UV-lasers kosten ongeveer hetzelfde als de 532 nm diode-gepompte passief Q-geswitchte solid-state laser, maar vereisen ofwel hogere vermogens of optica die deze kortere golflengten efficiënt doorlaten. De meeste optica zijn ontworpen om goed te functioneren met zichtbaar licht tussen 400-700 nm. 355 nm lasers bieden enkele voordelen⁶, zoals een lagere plasmadrempel en een kleinere spotgrootte; bovendien zou een long-pass dichroïsche spiegel 100% van de ablatielaser efficiënt naar het doel richten en gelijktijdige imaging van GFP mogelijk maken zonder verlies van het samplesignaal. Blauwe 440 nm lasers behouden de voordelen van het werken met een laser met zichtbaar licht (goede prestaties met standaardoptica en veiligheid). Helaas zijn de kosten van een DPP Q-geswitchte solid-state 440 nm laser op dit moment 3 keer zo hoog als die van een 355 nm of 532 nm laser met vergelijkbaar vermogen. Als we een nieuw systeem zouden ontwerpen voor C. elegans, waarbij de doeldiepte minimaal is, zouden we kiezen voor een UV-transparante lens (kosten ongeveer $3.000 voor een 40X 1.3na olielens met 50-70% transmissie bij 355 nm) en een 355 nm laser die 5-10 uJ/puls produceert bij 1-20 kHz.

Men vermoedt dat axonablatie wordt veroorzaakt door plasmavorming. Kortere pulsen produceren plasmadrempels bij een lager vermogen en de plasmavolumes zullen kleiner zijn⁶. Het doel is om het kleinste en kortstlevende plasma te produceren door de pulsenergie naar het laagste vermogen aan te passen. Grotere, langdurige plasma's genereren cavitatiebellen die omringende cellen beschadigen. Wij hebben over het algemeen vastgesteld dat ablatie met ongeveer 50-100 pulsen bij de hoogste frequentie (d.w.z. 2,5kHz) de beste resultaten geeft. Dit suggereert dat schade geleidelijk kan worden opgebouwd over een reeks pulsen om de omvang van de schade beter te beheersen. Het hier beschreven laserablatiesysteem is zeer vergevingsgezind mits de straal nauwkeurig is uitgelijnd en uitgebreid. We beginnen met het doorsnijden van axonen in volwassen wormen bij 10% laservermogen (gemiddeld 0,3 mW gemeten bij 2500 Hz en geschat op 1 uJ/puls) en kunnen snijden met beperkte lokale schade tot 14% vermogen. Grotere beschadigde gebieden zijn waarneembaar bij 15-39% laservermogen, maar pas boven 40% vermogen (gemiddeld ongeveer 1 mW gemeten bij 2500 Hz) exploderen de wormen door grote cavitatiebellen en beschadiging van de cuticula van de worm.

Het artikel van Steinmeyer et al. 2010² is een uitstekende bron voor het construeren van een laserablatiesysteem. Leon Avery heeft ook een goede praktische beschrijving van een laserablatiesysteem gebaseerd op een goedkope N2-gaslaser van 337 nm en hij geeft enkele waardevolle praktische tips (elegans.swmed.edu/Worm_labs/Avery/). Bij het ontwerpen van uw eigen systeem moet u eerst overleggen met uw microscoopvertegenwoordiger om te bepalen hoe de ablatielaser op het microscoopobjectief kan worden gericht. Uw microscoop moet worden geplaatst op een trillingsisolatietafel (Newport, TMI, Thor). Een breadboard-blad is optimaal, maar een massief stalen blad kan nog steeds worden gebruikt met magnetische positioneers. Een speciale tussenmodule op een rechtopstaande microscoop is gunstig omdat alle optische elementen op hun plaats kunnen blijven. Het kan echter goedkoper en handiger zijn om een cameraport (inverted) of een "combiner" te gebruiken die is bevestigd aan een epi-fluorescentiepoort. U moet de grootte van de achteropening en de transmissie (bij de golflengte van de ablatielaser) van het objectief kennen dat u wilt gebruiken. Zodra u een laser heeft gekozen (bijv. Crylas, TEEM, Crystal of CRC), kunt u contact opnemen met Thor of Newport voor hulp bij het selecteren van de juiste optische elementen, hardware en veiligheidsapparatuur. Wij hebben gekozen voor een dubbele Galileïsche straaluitbreider om ruimte te besparen, maar een eenvoudigere Kepleriaanse uitbreider is een optie (f2/f1=uitbreidingsfactor). Een op maat gemaakte straaluitbreider is de goedkoopste optie, maar Newport, Thor en verschillende laserfabrikanten bieden commerciële straaluitbreiders van uitstekende kwaliteit aan. Sommige laserfabrikanten bieden ook handmatige en elektronisch gestuurde attenuatoren aan die kosteneffectief en ruimtebesparend kunnen zijn, maar minder veelzijdig zijn dan de Glan-Thompson polarisator en de halve-golfplaat. U moet ook beslissen hoe u de laser wilt aansturen. U kunt een LabView-gebaseerde controller ontwerpen, een commerciële TTL-generator gebruiken of software gebruiken die door het laserbedrijf wordt geleverd. Bespreek de opties met de specifieke laserfabrikant.

We hebben een lijst van de gebruikte hardware bijgevoegd, uitsluitend als algemene richtlijn. Het hier beschreven systeem kostte ongeveer $15.000 toen het aan ons bestaande imagingsysteem werd toegevoegd. Uw lokale afdeling Natuurkunde heeft vaak iemand die bereid is een praktische introductie te geven over het veilig werken met open straallasers.

Alternatieve methoden voor immobilisatie en time-lapse imaging van C. elegans zijn onlangs beschreven.¹⁴

Probleemoplossing

De meest moeilijke en kritische stap is de uitlijning van de gecentreerde uitgebreide bundel met de optische as van de microscoop. Zodra de bundel gecentreerd en uitgebreid is via de Galileï-lenzen, dient u er alles aan te doen om deze binnen 5 µm van de optische as van de microscoop uit te lijnen VOORDAT u de stuurspiegels gebruikt voor de uiteindelijke uitlijning naar het midden. Overmatig gebruik van de stuurspiegels om de bundel op de microscoop uit te lijnen, zal ervoor zorgen dat deze uit de as van de bundeluitbreider raakt. MET UITERSTE VOORZICHTIGHEID kunt u de laserbundel attenueren met het juiste ND-filter en het laserbundelprofiel direct bekijken op een reflecterend doel (front-surface spiegel). U kunt de microscoop voorzichtig verschuiven om de bundel precies in het gezichtsveld van het 60X objectief te centreren (als dit binnen het op/neer-bereik niet kan, moet de hoogte van de rail worden aangepast). Het bundelprofiel kan worden gebruikt om de optische as van de microscoop nauwkeurig uit te lijnen, zodat er een gecentreerde bundel ontstaat die circulair is en symmetrisch "uitwaaiert". Een asymmetrische uitwaaiering is een indicatie dat de as van de microscoop niet perfect is uitgelijnd (of dat de rail niet waterpas staat). Ten slotte dient u L3 aan te passen, waarna een gelijkmatige en symmetrische expansie en contractie van de bundel zichtbaar moet zijn. Stel de microscoop nauwkeurig scherp op het doeloppervlak en pas vervolgens L3 aan om de laserbundel te focussen tot de kleinste spot. U zult nu merken dat de laserbundel zich binnen 5 µm van het centrum bevindt wanneer deze via LSCM of een CCD-systeem wordt afgebeeld, en dat de ablatiespot zich binnen 1 µm van de Z-focus bevindt.

Als u merkt dat u wormen "opblaast" of consistent grote cavitatiebellen genereert bij het doorsnijden van axonen, ligt het probleem zeer waarschijnlijk bij de fijne uitlijning van de ablatielaser. Zorg ervoor dat de minimale (<500nm) ablatiespot is gelokaliseerd op de Z-focus (pas de convergentie aan met de L3-lens) en op het XY-fiduciale punt (pas aan met de laatste kinematisch gemonteerde spiegel).

Het targeten van axonen dichter bij het oppervlak vereist minder laservermogen. Evenzo is voor kleinere dieren (L1 en L2) minder laservermogen nodig voor axotomie in vergelijking met het targeten van dezelfde axonen bij volwassenen.

Als uw wildtype axonen niet regenereren of als de axonen bleken, dient u te proberen het vermogen van de imaginglaser te verlagen of de bemonsteringssnelheid te verminderen. Als uw wormen sterven of ziek worden, probeer dan het percentage agarose in stappen van 1% te verlagen. Zorg ervoor dat u het dekglas niet verschuift na het monteren van de wormen, aangezien dit vaak leidt tot sterfte bij gebruik van een hoog percentage agarose en microsferen.

Als uw wormen knappen of sterven tijdens een time-lapse sessie, is dit te wijten aan: 1. Het percentage agarose is te hoog. 2. Beschadiging van de cuticula door de ablatielaser. 3. Verschuiving van het dekglas na het monteren. Als beschadiging van de cuticula de oorzaak is, zal dit alleen invloed hebben op gemonteerde wormen die met de ablatielaser zijn behandeld.

Als uw worm te veel beweegt tijdens een time-lapse sessie, probeer dan het agarosepercentage met stappen van 0,5% te verhogen. Gezonde axonen in gezonde wormen zijn altijd "actief" en vertonen een consistent fluorescentieniveau. Als u een plotselinge afname in fluorescentie of activiteit ziet, is de worm stervende of dood. Meerdere gekraalde of gefragmenteerde axonen zijn een zeker teken van een stervende of dode worm.

Als u problemen heeft met het in focus houden van uw axonen gedurende de volledige time-lapse sessie, kunnen daar verschillende oorzaken voor zijn. Controleer eerst de drift van uw tafel door gedurende 10 hrs een inert monster op een glazen objectglas te beelden. Een drift van enkele microns kan worden veroorzaakt door thermische instabiliteit, maar een drift van meer dan 5 um is waarschijnlijk te wijten aan mechanische problemen met uw microscoop. Problemen met de montage komen vaker voor. Laat uw gemonteerde wormen 30 minuten equilibreren met de tafel van uw microscoop voordat u met de time-lapse begint. Controleer of de Vaseline-afdichting geen lekken heeft ontwikkeld tijdens de time-lapse sessie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
535 nm laser	Crylas	FDSS532Q3	(TEEM, Crystal en CRC bieden ook vergelijkbare lasers aan)
Alle optica en hardware			(Thor biedt vergelijkbare optica en hardware aan)
SUPREMA optische houder, 1,0-inch diameter	Newport Corp.	SS100-F2KN	2
Stut, 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stutvork, 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Achromatische nulde-orde golfelplaat, ½ golfvertraging, 400-700nm	Newport Corp.	10RP52-1	1
Rotatietrap, 1" apertuur	Newport Corp.	RSP-1T	1
Stut, 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stutvork, 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Glan-Laser calcietpolarisator, 430-700nm	Newport Corp.	10GL08AR.14	1
Rotatiehouder voor polarisator	Newport Corp.	RM25A	1
¼" spacer voor stut van 1" diameter	Newport Corp.	PS-0.25	1
½" hoogte, stut van 1" diameter	Newport Corp.	PS-0.5	1
Vork, stut van 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
Beam dump	Newport Corp.	PL15	1
Microscoopobjectiefhouder	Newport Corp.	LH-OBJ1	1
Stut, 1" diameter, 1" hoogte	Newport Corp.	PS-1	1
Stutvork, 1" diameter	Newport Corp.	PS-F	1
High-Energy Nd:YAG laserspiegel, 25,4 mm diameter, 45°, 532 nm	Newport Corp.	10Q20HE.2	4
SUPREMA optische houder, 1,0 inch diameter, montagegat met speling	Newport Corp.	SN100C-F	2
Hoge-precisie knopafstelschroef, 12,7mm slag, 100TPI	Newport Corp.	AJS100-0.5K	4
Schroefdrapadapter, ¼-20 mannelijk, 8-32 vrouwelijk	Newport Corp.	SS-1-B	2
Stangklem voor stang van 1,5 inch diameter	Newport Corp.	340-RC	2
Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog	Newport Corp.	40	1
Raildrager voor X26, vierkant 40mm lengte	Newport Corp.	CN26-40	4
Stalen rail, 384mm (15") lengte	Newport Corp.	X26-384	1
Stangplatform voor stang van 1,5 inch diameter	Newport Corp.	300-P	2
Stang, 14 inch (35,5 cm) hoog	Newport Corp.	40	2
Plano-concave lens, 12,7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPC025AR.14	2
Plano-convexe lens, 25,4mm diameter, 50,2mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPX082AR.14	1
Plano-convexe lens, 25,4mm diameter, 62,9mm EFL, 430-700nm	Newport Corp.	KPX085AR.14	1
Vaste lenshouder, 0,5" diameter, 1,0" ashoogte	Newport Corp.	LH-0.5	2
Vaste lenshouder, 1,0" diameter, 1,0" ashoogte	Newport Corp.	LH-1	2
Microsferen 0,1 µm	Polysciences, Inc.	00876
Agarose	Research Products International Corp.	A20090	EEO-kwaliteit
Muscimol	Sigma-Aldrich	M1523