Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

Samenvatting

Een methode om organotypische segmenten van de E12.5 muriene embryonale middenhersenen genereren is beschreven. De organotypische slice culturen kan worden gebruikt om het gedrag van dopaminerge neuronen of andere ventrale middenhersenen neuronen te observeren.

Samenvatting

De muis is een uitstekend model organisme om zoogdieren ontwikkeling van de hersenen als gevolg van de overvloed van de moleculaire en genetische gegevens te bestuderen. Echter, de zich ontwikkelende hersenen van muizen is niet geschikt voor eenvoudige manipulatie en imaging in vivo, omdat de muis embryo is ontoegankelijk en ondoorzichtig. Organotypische slice culturen van embryonale hersenen worden dan ook veel gebruikt om de ontwikkeling van de hersenen van muizen in vitro studie. Ex-vivo manipulatie of het gebruik van transgene muizen kan de modificatie van genexpressie, zodat subpopulaties van neuronale of gliale cellen kunnen worden gelabeld met fluorescerende eiwitten. Het gedrag van gelabelde cellen kunnen dan worden waargenomen met behulp van time-lapse imaging. Time-lapse imaging is bijzonder succesvol geweest voor het bestuderen van cel gedrag dat de ontwikkeling van de hersenschors ten grondslag liggen in de late embryonale fase ^1-2. Embryonale organotypische slice cultuur-systemen in de hersenen regio's buiten de voorhersenen zijn minder goed EstablisHed. Daarom wordt de rijkdom van time-lapse imaging data beschrijven van neuronale cel migratie beperkt tot de voorhersenen ^3,4. Het is nog niet bekend, of de beginselen ontdekt voor de dorsale brein opgaan voor het ventrale hersengebieden. In de ventrale hersenen worden neuronen georganiseerd in neuronale clusters in plaats van lagen en ze hebben vaak ingewikkelde migratie trajecten te ondergaan om hun definitieve standpunt te bereiken. Het ventrale middenhersenen is niet alleen een goed modelsysteem voor ventrale ontwikkeling van de hersenen, maar bevat ook neuronale populaties zoals dopaminerge neuronen die relevant zijn bij de ziekte van processen. Terwijl de functie en de degeneratie van dopaminerge neuronen is onderzocht in detail in de volwassen en de ouder wordende hersenen, is er weinig bekend over het gedrag van deze neuronen tijdens hun differentiatie en migratie fase ^5. We beschrijven hier de generatie van de slice culturen uit de embryonale dag (E) 12.5 muis ventrale middenhersenen. Deze slice cultlen zijn potentieel geschikt voor de bewaking dopaminerge neuron ontwikkeling gedurende een aantal dagen in vitro. We belichten de kritische stappen in het genereren van de hersenen plakjes op deze vroege stadia van de embryonale ontwikkeling en discussiëren over de voorwaarden die nodig zijn voor het behoud van een normale ontwikkeling van dopaminerge neuronen in vitro. Presenteren we ook de resultaten van time lapse imaging experimenten. In deze experimenten werden ventrale mesencephalon voorlopers (inclusief de dopaminerge precursoren) en hun nakomelingen geëtiketteerd een mozaïek wijze met een Cre / loxP gebaseerd induceerbaar lot mapping systeem ^6.

Protocol

Delen van dit protocol worden aangepast van Daza et al.., 2007 ^7.

1. Voorbereidingen

1. Kunnen worden bereid een dag van tevoren
   1. Bereid 1X Krebs buffer (1,5 L): 126 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,2 mM NaH ₂ PO _4: H ₂ O, 1,2 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 11 mM glucose, 25 mM NaHCO _3, de pH instellen op 7,4. Filter steriliseren (0,22 um poriëngrootte) en bewaar bij 4 ° C.
   2. Bereid het kweekmedium (20 ml): 5 ml HBSS, 9 ml DMEM hoge glucose, 850 pl van 30% glucose, 5 ml paard serum (25%). Voeg 200 ul 100X Penicllin / streptomycine. Bewaren bij 4 ° C.
2. Bereid voordat de dissectie
   1. Bereiding van 100 ml 4% laagsmeltende agarose (LMP agarose) in 1X Krebs buffer: de magnetron van de oplossing tot de agarose volledig is opgelost en vervolgens de agarose plaats in een 45 ° C waterbad.
   2. Vul de trillingentome bufferbak met ijskoude 1X Krebs buffer en start het koelelement (bewaar bij 4 ° C). Fix een scheermesje in het blad drager en set-up van de vibratome gebied met een scalpel, een fijn penseel en een mini-geperforeerde lepel te halen de plakjes. Bereid steriele petrischalen (35 x 10 mm) met 1x Krebs buffer voor het verzamelen van de plakjes. Te houden op het ijs.
   3. Set-up van de dissectie met een steriel Petrischalen (100 x 15 mm) voor dissectie en kleinere steriele petrischalen (35 x 10 mm) voor inbedding, kleine schaar, twee fijn pincet (Dumont 5), een mini-geperforeerde lepel, een glas Pasteur pipet brand gepolijst met een ronde gesloten punt en een L van 1X Krebs buffer op ijs. Veeg al het dissectie-instrumenten met 70% ethanol.
   4. Voeg kweekmedium aan de putjes van een zes-well plaat (1,5 ml / putje) en plaats deze in een 37 ° C incubator.
   5. Bereid een zes-wells plaat met 1,5 ml / putje steriele 1X Krebs buffer en 15 pi Penicilin / streptomycine (100X) / goed. Onder steriele omstandigheden, plaats Millicell Cel Cultuur inserts in de putten. Plaats de zes-well plaat naast de vibratome, zodat de hersenen plakjes kunnen overgedragen worden op de filter membranen direct na het snijden.

2. Dissectie en inbedding van de embryonale hersenen

1. Verdoof een zwangere vrouw muis met behulp van isofluraan en het offer van de muis door cervicale dislocatie (embryo's moet op het podium E12.5). Ontleden uit de baarmoeder van de muis door omhoog te trekken van de baarmoeder met een tang. Gebruik andere tang om de mesometrium weg te scheiden van de baarmoeder. Plaats de baarmoeder in de ijskoude 1X Krebs buffer. Gebruik een fijne tang om de spierwand van de baarmoeder, Reichert's membraan en de viscerale dooierzak los van het embryo. Verwijder de embryo's uit de baarmoeder. Plaats de ontleed embryo's in een aparte petrischaal met een steriele 1X Krebs buffer.
2. Ontleden van de hersenen onder een stereomicroscoop. Te ontleden van de hersenen, eerst sneed het hoofd van het embryo. Fix het hoofddoor piercing fijne tang door het hoofd (ooghoogte). Gebruik een andere tang voorzichtig verwijderen van de huid en de schedel. Een tang om til de hersenen uit en over te dragen in een petrischaal met steriele 1X Krebs buffer. Het is zeer belangrijk dat de integriteit van het hele brein in stand wordt gehouden tijdens de dissectie, omdat schade aan het hersenweefsel zal problemen (zoals weefsel versnipperen) te creëren tijdens het snijden op de vibratome.
3. Was de hersenen eens in de 4% laag-smeltpunt (LMP) agarose. Embed 2-3 hersenen op een moment in verse 4% LMP agarose. Leg de inbedding gerechten op ijs zo gelijk mogelijk. Gebruik een Pasteur pipet met een vuur-gepolijste ronde tip naar de hersenen tillen totdat de onderkant van de agar is gestold. De hersenen moeten vestigen in een vlakke positie horizontaal aan de onderkant van de agarose blok.
4. Nadat de agarose volledig is gestold (na ongeveer 3 min), trim de agarose rond de hersenen en lijm van de agarose blok op het monster podiumvan de vibratome. Bij het verlijmen van de blokken, zorg ervoor dat de ventrale zijde van de hersenen is parallel aan het platform, omdat de hersenen moeten worden gesneden in een horizontale doorsnede vlak.

3. Vibratome snijden

1. Gebruik een scheermesje voor het snijden. Voor het verkrijgen van intact plakken is het zeer belangrijk om de temperatuur te handhaven op 4 ° C tijdens het snijden.
2. Sectie 300 micrometer dikke horizontale plakken op een frequentie van 50 Hz, blad amplitude van 1,1 mm en een snelheid van 25 mm / sec.
3. Gebruik de fijne penseel om de slice in een mini-geperforeerde lepel duwen naar de hersenen plakjes verzamelen en overbrengen in een schaal met steriele ijskoude 1X Krebs buffer. Kies de slice die ventrale mesencephalon weefsel bevat (zie figuur 1). In een E12.5 hersenen van muizen is er slechts een 300 micrometer horizontale slice dat ventrale middenhersenen weefsel bevat inclusief de dopaminerge neuronen.

4. Slice cultuur

Stappen 4.2-4.5 moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

1. Breng de plakjes hersenen op een Millicell celkweek membraan in te voegen in een zes-wells plaat met 1x Krebs buffer (zie punt 1.2.5). Voor de overdracht van de slice gebruik maken van de mini-geperforeerde lepel (Fine Science Tools) en een fijne penseel. Tot 3 plakjes geplaatst kunnen worden op een membraan.
2. Breng het membraan met de slice om de zes-well plaat met kweekmedium (zie punt 1.2.5). De bovenkant van het membraan mag niet worden gedekt door medium. De hersenen slice ontvangt medium van beneden en de lucht van boven.
3. Plaats de zes-well plaat in een incubator met 5% CO ₂ bij 37 ° C. Het is zeer belangrijk dat de schijfjes worden geplaatst in de incubator binnen 2 uur na de eerste stap van de dissectie. Een meer uitgebreide voorbereiding kan resulteren in een slechte overleving van de plakjes.
4. Slices kunnen worden gehandhaafd in vitro tot 3 dagen. Verandering 50% van het kweekmedium op de 2 ^e dag.

1. Laat de plakjes herstellen in de incubator voor 4-5 uur vóór het begin van time-lapse imaging.
2. Voor time-lapse imaging, houd de plakjes op het membraan insert en breng het in te voegen in een 35 mm Ibidi μ-schotel (de bodem van de schaal bestaat uit materiaal met een hoge optische kwaliteit).
3. Voeg 1 ml kweekmedium plus 1,5 pi ascorbinezuur (200 mm) aan het gerecht. Ascorbinezuur beschermt de schijfjes tegen fototoxiciteit.
4. Incubeer plakjes in een klimaatkamer bij 37 ° C met 5% CO2 gedurende time-lapse imaging.

6. Representatieve resultaten

Figuur 1 illustreert de bereiding van organotypische slice culturen uit E12.5 hersenen van muizen. Figuur 2 toont horizontale organotypische plakken (acute en na een aantal dagen in cultuur) verkregen vorm E12.5 hersenen van muizen. Ter vergelijking, bevroren hersenen secties op de tegenwaarde ontwikkelingsstadiaworden weergegeven. Middenhersenen dopaminerge neuronen worden gevisualiseerd met immunohistochemie voor tyrosine hydroxylase (TH). Middenhersenen dopaminerge neuronen project naar doelen in de voorhersenen. Deze prognoses beginnen te vormen op E12.5 en naar de voorhersenen uit te breiden tijdens de daaropvolgende dag. Wij beschouwen de ontwikkeling van de voorhersenen projecties als een goede indicatie voor de normale ontwikkeling van dopaminerge neuronen in cultuur. In de horizontale plakken middenhersenen dopaminerge neuronen uit te breiden projecties naar de juiste voorhersenen doelgebied. Na 3 DIV (dag in vitro) of wanneer de voorhersenen doelgebieden zijn beschadigd, afwijkend projecties strekt zich naar de dorsale middenhersenen. Voorbeelden van coronale plakjes E12.5 middenhersenen zijn weergegeven in figuur 3. Dopaminerge neuronen gevisualiseerd met immunokleuring voor TH afwijkende projecties uit te breiden tot de dorsale middenhersenen. Figuur 4 geeft een analyse van de proliferatie, necrotische en apoptotische cellen in de organotypische slice culturen. BrdU immunostaining om prolifererende cellen te visualiseren laat zien dat cellen prolifereren onder kweekomstandigheden na een DIV. Proliferatie is verminderd na 4 DIV. Na 3 DIV, veel cellen in het ventrale middenhersenen ondergaan necrose (propidiumjodide kleuring) en apotosis (immunokleuring voor het gesplitst caspase-3). Figuur 5 toont trekkende paden van YFP-gelabeld neuronen gevolgd in een time-lapse imaging experiment in een acute slice .

Figuur 1. Schematische illustratie van de voorbereiding van de organotypische slice culturen. 300 um horizontale plakjes hersenen worden bereid door het snijden van een E12.5 hersenen met behulp van een vibratome. (A) Schematische weergave van een sagittale E12.5 hersenen van muizen. Het niveau van de secties zijn aangegeven. Het gebied met dopaminerge neuronen is afgebeeld in roze, zijn projecties in blauw aangegeven. (B) Schema van de drie segmenten die kunnen vanaf dorsale worden verkregen om buik-en that bevatten zowel voorhersenen (Fb) en de middenhersenen (Mb). Merk op dat slechts een slice dopaminerge neuronen (slice b) bevat. De juiste slice kan worden geïdentificeerd op basis van de positie van de ventrikels en de continuïteit van de middenhersenen en de voorhersenen weefsel (pijlen, vergelijk onderdeel b met sectie A en C). Het gebied met dopaminerge neuronen wordt aangegeven in roze, is het gebied met dopaminerge voorlopers afgebeeld in groen, blauw pijlen geven het ontwikkelen van projecties. (C) Het segment met dopaminerge neuronen is gekweekt op membraan inserts. Afkortingen: VMB, ventrale middenhersenen, DMB-, rug-middenhersenen, Hyp, hypothalamus, Hb, achterhersenen.

Figuur 2. Projecties van de middenhersenen dopaminerge neuronen in organotypische slice culturen zijn afhankelijk van de integriteit van de voorhersenen. Immunohistochemie voor tyrosine hydroxylase (TH) naar dopaminerge neuronen label. (A) Acute slice (0 DIV)met de normale locatie van de dopaminerge neuronen in het ventrale middenhersenen. De witte pijl geeft aan het gebied dat wordt getoond in hogere vergroting in de inzet. Projecties naar de voorhersenen zijn nog niet ontwikkeld. Na een DIV, projecties naar de voorhersenen beginnen te vormen. Projecties uit te breiden in de voorhersenen op 2-3 DIV. Witte pijlpunten wijzen op de locatie van de cellichamen die in een hogere vergroting in de inzetten (wit frame). Gele pijlen wijzen op de normale projecties in intacte plakjes weergegeven in een hogere vergroting in de inzetten (geel kader). Afwijkende projecties te ontwikkelen in schijfjes met beschadigde voorhersenen. Rode pijlen geven de afwijkende projecties naar de dorsale middenhersenen getoond in een hogere vergroting in de inzetten (rode kader). Schade wordt aangegeven met rode sterretjes. Na 3 DIV, de meeste schijfjes (n = 5 / 7) had afwijkende projecties naar de dorsale middenhersenen. (B) TH immunokleuring op horizontale bevroren hersenen secties in de verschillende ontwikkelingsstadia van de ontwikkeling tonenvan dopaminerge projecties in vivo. Witte pijlpunten wijzen op de locatie van de cellichamen die in een hogere vergroting in de inzetten (wit frame). Gele pijlen wijzen op de positie van de projecties die in een hogere vergroting in de inzetten (geel kader). Het niveau van de vriescoupes werd gekozen nauw overeenkomt met de hoogte van de organotypische slice culturen. Merk op dat een enkele vriescoupes (12 micrometer) niet de gehele organotypische slice (300 um) vertegenwoordigen. Daarom werden projecties getoond op E13.5 en E14.5 waargenomen op delen 120 micrometer meer ventraal dan het gedeelte met de cellichamen (gele sterretjes).

Figuur 3. Middenhersenen coronale slice culturen gekleurd voor tyrosine hydroxylase (TH) als een marker voor dopaminerge neuronen. (AC) Slices na 1, 2 of 3 DIV. Dopaminerge neuronen ontwikkelen afwijkende projecties naar de dorsale middenhersenen (rred. pijlen). Pijlpunten tonen de locatie van de dopaminerge cellichamen.

Figuur 4. Cel proliferatie en levensvatbaarheid van de cellen in de middenhersenen organotypische slice culturen. (A) Delende cellen werden gelabeld door de toevoeging van BrdU (50 ng / mL, Sigma) aan het kweekmedium gedurende 18 uur Slices werden vervolgens immunostained voor BrdU. Na een DIV, zijn BrdU gelabelde cellen zich in de ventriculaire zones (rode pijlen). Na 4 DIV, woekerende cellen zijn meer verspreid en een duidelijke ventriculaire zone wordt niet langer onderhouden. (B) necrotische cellen werden gemerkt door de toevoeging van propidiumjodide (1μg/μL, Sigma) aan het kweekmedium gedurende 2 uur en gevisualiseerd met behulp van fluorescentie microscopie. Na een DIV, de ventrale middenhersenen (VMB) is niet necrotisch, maar veel propidiumjodide gelabelde cellen kan worden gezien in het dorsale middenhersenen en de voorhersenen. Na 3 DIV de levensvatbaarheid van de cellen afneemt in het ventrale midbrainch Schaal bar: 500 pm (C) Immunostaing voor gekliefde caspase-3 tot en met apoptotische cellen te visualiseren. Op 1 of 2 DIV, slechts een paar dopaminerge neuronen (TH) zijn apoptotisch. Na 3 DIV, dopaminerge neuronen beginnen om apoptose te ondergaan. Panelen in het midden en aan de rechterkant zijn een vergroting van de boxed gebied in de linker panelen. De hogere vergrotingen beelden zijn maximale intensiteit projecties van de z-stacks van 14-16 frames. Foto's werden genomen om de 0,5 micrometer met een Zeiss apotome set-up.

Figuur 5. Trekkende route van YFP-gelabeld neuronen in een acute slice. (A) Horizontale slice gebruikt voor time-lapse beeldvorming van YFP-gelabelde neuronen. De slice werd geïncubeerd gedurende 5 uur voorafgaand aan de beeldvorming. Cellen werden gelabeld met behulp van een induceerbare Cre / loxP systeem ^6. Shh ^Creer muizen ⁸ en ROSA ^{loxP-STOP-loxP-EYFP} reporter muizen ⁹ wegewend bent. Recombinatie van de ROSA reporter allel (en EYFP expressie) wordt geïnduceerd in cellen die uitdrukken Creer (Shh tot expressie brengen cellen), maar slechts na toediening van Tamoxifen (Sigma). In dit voorbeeld was Tamoxifen (3 mg/40 g lichaamsgewicht) toegediend aan zwangere muizen op E8.5. Deze experimentele set-up resulteert voornamelijk in de etikettering van de voorlopers van dopaminerge neuronen en hun nakomelingen in het ventrale middenhersenen ^10,11. Schaal bar: 500 pm. (B) Het opsporen van de migratieroute van YFP-gelabeld neuronen in een acute slice. Time-lapse beelden van YFP-gelabeld lot in kaart gebracht neuronen werden verworven om de 30 minuten voor een totale tijd van 5 uur 30 min op een Zeiss Axio Observer-microscoop (objectieve EC PlnN 10x / 0,3). Plakjes werden geïncubeerd in een klimaatkamer (incubator XLS1 Pecon) bij 37 ° C en worden geleverd met 5% CO ₂ tijdens de beeldvorming. De beginpositie van de cellen is gemarkeerd met rode pijlen, migratie posities zijn gemarkeerd met rode sterretjes.

Discussie

De organotypische slice kweekmethode hier wordt gepresenteerd biedt een systeem voor de korte termijn in vitro analyse van de ontwikkeling van dopaminerge neuronen en hun migratie-en projectie routes in de embryonale ventrale middenhersenen. Wij vonden dat er een aantal kritische stappen in het protocol dat zorgvuldig moet worden bijgewoond in om te plakken, dat de normale ontwikkeling van ventrale middenhersenen dopaminerge neuronen maken krijgen. De meest kritische stap is de dissectie van de embryonale herse...

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
DMEM	Sigma-Aldrich	D6429
Glucose 30%	Sigma-Aldrich	G7528-250
Paard Serum	Invitrogen	26050-088
DMEM (4,5 g / L Glc., Met L-Gln, Na Pyr, NaHCO3)	Sigma-Aldrich	D6429-500
Penicilline / streptomycine 100x	Sigma-Aldrich	P4333-20
L-ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A4403	voor te bereiden 200MM voorraad en bewaar bij -20 ° C
UltraPure LMP agarose	Invitrogen	15517-022
Millicel inserts	Millipore	PICMORG50
μ-schaal 35 mm, een laag	Ibidi	80136
Vibratome	Microm	HM 650V
Scheermesje	Plano GmbH	121-6
Histoacryl lijm	BRAU9381104	Braun Aesculap
Geperforeerde Spoon Dia diameter 15 mm	Fine Science Tools	10370 -18
Pincet 5 Dumoxel	Fine Science Tools	11252-30

Naam van het antilichaam	Vennootschap	Catalogus nummer	Commentaar (optioneel)
Konijn anti-tyrosine hydroxylase	Millipore	AB152	Verdunning 1:500
Muis anti-tyrosine hydroxylase	Millipore	MAB318	Verdunning 1:500
Muizen anti-BrdU	BD Pharmingen	555627	Verdunning 1:200
Konijn anti-gesplitst caspase 3	Cell Signaling Technology	9661	Verdunning 1:200
Donkey anti-konijn IgG-Alexa 488	Invitrogen	A21206	Verdunning 1:500
Donkey anti-muis IgG-Cy3	Jackson ImmunoResearch	715-165-150	Verdunning 1:200