Visualisatie van Caenorhabditis elegans Cuticle structuren met behulp van de lipofiele vitale kleurstof, DII

Summary

Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende C. elegans Het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in C. elegans Om het milieu worden blootgesteld neuronen te visualiseren. Met dit geoptimaliseerde protocol, zijn alae en ringvormige structuren cuticulair gekleurd door DII en geobserveerd met behulp van microscopie compound.

Abstract

De cuticula van C. elegans is een zeer resistent structuur die de buitenkant van het dier ^1-4 omringt. De nagelriem beschermt niet alleen het dier uit de omgeving, maar ook bepalend voor lichaamsvorm en speelt een rol in de motiliteit ^4-6. Meerdere lagen afgescheiden door epidermale cellen bestaan ​​uit de nagelriem, waaronder een buitenste lipide laag ^7.

Omtrek ribbels in de cuticula genoemd annuli patroon de lengte van het dier en zijn aanwezig tijdens alle stadia van ontwikkeling ^8. Alae zijn richels in de lengterichting die aanwezig zijn tijdens specifieke stadia van ontwikkeling, waaronder L1, Dauer, en volwassen stadia ^2,9. Mutaties in genen die cuticulair collageen organisatie beïnvloeden kan veranderen cuticulair structuur en dierlijk lichaam morfologie ^5,6,10,11. Terwijl cuticulair imaging met behulp van microscopie compound met DIC optiek is het mogelijk, de huidige methoden die de aandacht vestigen cuticulair structuren omvatten fluorescentielampencent transgenexpressie ^12, antilichaam vlekken ^13, en elektronenmicroscopie ^1. Gelabeld tarwekiemen agglutinine (WGA) is ook gebruikt om cuticulair glycoproteïnen visualiseren, maar is beperkt in het oplossen van fijnere structuren cuticulair ^14. Kleuring van cuticulair oppervlak met behulp van fluorescerende kleurstof is waargenomen, maar nooit in detail gekarakteriseerd ^15. Wij presenteren een methode om cuticula te visualiseren in levende C. elegans het gebruik van de rode fluorescerende kleurstof lipofiele DII (1,1 '-dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat), die veel gebruikt wordt in C. elegans om milieuvriendelijke blootgesteld neuronen te visualiseren. Dit geoptimaliseerde protocol voor DII kleuring is een eenvoudige, robuuste methode voor hoge resolutie fluorescentie visualisatie van annuli, alae, vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete piek in de C. elegans.

Protocol

1. Voorbereiding van de Dii vlek

1. Bereid een voorraad oplossing van 20 mg / ml DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) in DMF. Dii is licht gevoelig, dus bescherming tegen licht DII door inpakken in folie.
2. Maak een werkverdunning van Dii door het toevoegen van 0,6 ul DII voorraad 399,4 pi M9 voor elke populatie. Dit moet een laatste werkverdunning van 30 ug / ml DII in M9. Dit kan worden opgeschaald voor het beitsen van verschillende bevolkingsgroepen tegelijk. Shield Dii van het licht door het wikkelen van de buis (s) in folie.

2. Voorbereiding van de nematoden

1. Gebruik een 60 mm plaat met een bevolking van ni....

Discussion

De Dii kleuringsmethode hier gepresenteerde zorgt voor een relatief snelle en gemakkelijke manier om de cuticula in C. elegans te visualiseren. Door herbestemming en optimaliseren van een methode die vaak wordt gebruikt om de afbeelding milieuvriendelijke blootgesteld sensorische neuronen ^15,17, kan DII worden gebruikt om de fluorescent vlek zowel alae en ringvormige structuren (figuren 1 en 2), evenals de vulva, mannelijke staart, staart en hermafrodiete spike (Figuur 3). We hebben geconstateerd dat.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagentia	Synoniemen	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
Dii	1,1 '-Dioctadecyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Biotium, Inc	60010	Stock verdunning: 20 mg / ml in DMF werkverdunning: 30 mg / ml
DMF	Dimethylformamide	Sigma-Aldrich, Inc	D4551
Triton X-100	Octylphenoxypolyethoxyethanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm NaCl, 1 mM MgSO 4
NGM	Nematode groeimedium	IPM Scientific, Inc	11006-501	Kan worden bereid volgens NGM agar-protocol 18
Agar-agar		Merck Chemicals, Inc	1,01614	4% in water
Levamisol	Levamisol hydrochloride	Sigma-Aldrich, Inc	31742	100 uM - 1 mM levamisole zoals vereist
Objectglaasjes		VWR International, LLC.	16005-106
Microscoop dekglaasjes		VWR International, LLC.	16004-302
Compound bereik		Carl Zeiss, Inc	A1M	Gebruik de doelstellingen aan de behoeften van het experiment overeenkomt
TRITC of andere compatibele filter		Chroma Technology Corp	49005	ET - DsRed (TRITC/Cy3) gesputterd filterset