Isoleren van LacZ-expressie Cellen van Mouse Inner Ear weefsels met behulp van flowcytometrie

Samenvatting

Flowcytometrie is een krachtig hulpmiddel dat het mogelijk maakt om specifieke celpopulaties te isoleren en te bestuderen. Dit protocol beschrijft de stappen voor het isoleren van LacZ-expresserende cellen uit cochleaire weefsels van neonatale transgene muizen. Gedissocieerde cochleaire cellen werden gelabeld met behulp van fluorescent geconjugeerde substraten van β-galactosidase vóór scheiding via flowcytometrie.

Samenvatting

Isolatie van specifieke celtypen maakt het mogelijk om zeldzame celpopulaties zoals stam-/voorlopercellen te analyseren. Een dergelijke benadering voor het bestuderen van binnenoorweefsels presenteert een unieke uitdaging vanwege het gebrek aan cellen van belang en weinig transgene reporter muismodellen. Hier beschrijven we een protocol met behulp van fluorescentie-geconjugeerde sondes om selectief LacZ-positieve cellen uit de neonatale cochlea te labelen.

De meest voorkomende onderliggende pathologie van sensorisch neuraal gehoorverlies is de onomkeerbare schade en het verlies van cochleaire sensorische haarcellen, die nodig zijn om geluidsgolven om te zetten in neurale impulsen. Recent bewijs suggereert dat de muisauditieve en vestibulaire organen stam-/voorlopercellen herbergen die regeneratief potentieel kunnen hebben^1,2. Deze bevindingen rechtvaardigen verder onderzoek, inclusief het identificeren van specifieke celtypen met stam-/voorlopercellenkenmerken. De Wnt-signaleringsroute is aangetoond als een kritische rol spelen bij het onderhouden van stam-/voorlopercelpopulaties in verschillende orgaansystemen^3-7. We hebben onlangs Wnt-responsieve Axin2-expresserende cellen in de neonatale cochlea geïdentificeerd, maar hun functie is grotendeels onbekend⁸.

Om het gedrag van deze Wnt-responsieve cellen in vitro beter te begrijpen, hebben we een methode ontwikkeld om Axin2-expresserende cellen te isoleren uit cochleae van Axin2-LacZ reporter muizen⁹. Door flowcytometrie te gebruiken om Axin2-LacZ positieve cellen uit de neonatale cochleae te isoleren, konden we op onze beurt een verscheidenheid aan experimenten uitvoeren op levende cellen om hun gedrag als stam-/voorlopercellen te ondervragen. Hier beschrijven we in detail de stappen voor de microdissectie van neonatale cochlea, dissociatie van deze weefsels, labelen van de LacZ-positieve cellen met behulp van een fluorogeen substraat en celsortering. Technieken voor het dissociëren van cochleae in enkele cellen en het isoleren van cochleaire cellen via flowcytometrie zijn beschreven^2,10-12. We hebben aanpassingen aan deze technieken gemaakt om een nieuw protocol te ontwikkelen om LacZ-expresserende cellen uit de neonatale cochlea te isoleren.

Protocol

1. Microdissectie van de cochlea

1. Bereid het dissectiemicroscoop onder de kap voor door de oppervlakken af te vegen met 70% ethanol en ijsblokken neer te zetten.
2. Bereid 10-15 35 mm petrischalen onder steriele omstandigheden voor en vul ze voor de helft (~2 ml) met steriele Hank's Balanced Salt Solution met Calcium (HBSS).
3. Bereid twee 35 mm petrischalen onder steriele omstandigheden voor en vul ze voor de helft (~2 ml) met steriele 1x fosfaat gebufferde oplossing (PBS).
4. Steriseer micro-forceps in een 50 ml conische Falcon buis met 70% ethanol.
5. In een aparte ruimte van de steriele kap, gebruik iris schaar om 12-15 postnatale (P) 0-3-dagen oude Axin2^LacZ/+ reporter muizen te onthoofden en plaats de hoofden op een 60 mm petrischaal op een ijsblok.
6. Gebruik #5 Dumont forceps en iris schaar om de onderkaak en tong te verwijderen en door de basis van de schedel te snijden op het niveau van het verhemelte.
7. Verwijder de overliggende huid van het schedeldak en doorsnijd de basis van de schedel door de schaar in te steken aan de onderkant van het foramen magnum tot het midden van het verhemelte.
8. Maak een andere incisie met iris schaar vanaf de gesneden rand van het verhemelte tot het superieure aspect van het schedeldak aan beide kanten, wees voorzichtig om de otische capsule niet te beschadigen.
9. Voltooi de isolatie van het slaapbeen door twee 45-graden hoekige incisies te maken die beginnen bij het superieure aspect van het foramen magnum en doorlopen tot de coronale snede bij het harde verhemelte.
10. Plaats de geïsoleerde slaapbeenderen in 35 mm petrischalen die HBSS bevatten op een ijsblok.
11. Verzamel slaapbeenderen van ongeveer 12-15 dieren die zijn geofferd, voor een totaal van 24-30 slaapbeenderen.
12. Breng de petrischaal met geïsoleerde slaapbeenderen over naar eerder voorbereide steriele dissectiekap (1.1).
13. Breng vier slaapbeenderen over naar elk voorbereid 35 mm petrischaal met HBSS (1.2) en plaats op een ijsblok.
14. Begin met microdissectie door twee #55 forceps te gebruiken om voorzichtig de cortex, hersenstam en cerebellum in het slaapbeen boven de otische capsule te verwijderen.
15. Zonder de otische capsule te verwijderen, hak delen van de cochleaire capsule weg, beginnend bij de ingang van de vestibulocochleaire zenuw in de otische capsule.
16. Nadat de basis van de cochlea is blootgelegd, trek voorzichtig de cochlea en omliggende weefsels eruit. Verwijder eventueel overgebleven spiraal ganglion en de stria vascularis, beginnend bij de basis.
17. Breng de cochlea over naar 35 mm petrischaal met PBS op een ijsblok.
18. Voor optimale weefselviabiliteit, mag de totale tijd van de dissectie minder dan 60 minuten zijn.
19. Herhaal bovenstaande stappen voor 3-5 wild-type (WT) P0-P3 muizen als controles voor Axin2-LacZ muizen.

2. Celdissociatie (gewijzigd van eerder beschreven methoden)^2,10

1. Plaats 50 μl steriele PBS in het midden van een putje in een 6-putjes non-gecoate kweekschaal.
2. Breng maximaal 20 Axin2^LacZ/+ cochleae over in elke druppel van 50 μl PBS. Een nieuwe druppel van 50 μl PBS moet worden gebruikt voor meer dan 20 cochleae.
3. Verwarm 50 μl aliquoten van 0,125% trypsine gedurende ~2 minuten in een 37°C waterbad.
4. Voeg 50 μl voorverwarmde 0,125% trypsine toe aan PBS dat de cochleae bevat.
5. Plaats de 6-putjes schaal op 37°C gedurende 8 min, zorg ervoor dat de schaal niet wordt geschud.
6. Om de trypsinisatie te beëindigen, voeg 50 μl soja trypsine remmer toe aan elke 100 μl druppel.
7. Voeg een extra 50 μl Volledige Media (FM) (IGF-1, EGF, bFGF, HS, ampicilline in DMEM/F12)² toe
8. Gebruik een 300 μl stompe pipettepunt met een p200 pipetteman ingesteld op 125 μl, tritureer voorzichtig de cellen 80 keer, wees voorzichtig om geen bubbels te creëren.
9. Na trituratie van elke druppel, voeg een extra 200 μl FM toe aan elke putje.
10. Leidt de cellen door een 40 μm blauwe Falcon cel zeef in een nieuwe putje.
11. Breng cellen over naar standaard Falcon FACS buisjes (ongeveer 300 μl blijft na trituratie en filtratie).
    1. Splits cellen van wildtype cochleae in drie buisjes, verdun 100 μl met 300 μl FM in elk buisje. Eén buisje zal worden gebruikt als blanco controle, één zal worden gekleurd met propidium jodide (PI, 1 μg/ml) alleen (niet toe te voegen in deze stap), terwijl de laatste zal worden gekleurd met 3-carboxyumbolymbellefyl β-D-galactopyranosid (CUG, zie 2.15) om achtergrondfluorescentie te detecteren.
    2. Plaats 400 μl van gedissocieerde cellen van Axin2-LacZ cochleae in elk FACS buisje. Als CUG-alleen controle, verdun 10 μl cellen in 390 μl FM (zie buis F in Stap 2.15). Breng het volume van alle overige buisjes op 400 μl.
12. Incubeer cellen in een 37°C bevochtigde incubator gedurende 10 min.
13. Bereid CUG oplossing:
    1. Bereid 20

Discussie

Onafhankelijke onderzoeksstudies hebben een beperkte regeneratieve capaciteit gekenmerkt binnen de neonatale cochleae^2,10,12,13. Met behulp van GFP-reporter muizen en flowcytometrie, hebben White en collega's specifieke cochleaire ondersteunende cellen geïsoleerd en ontdekten dat deze de kenmerken van voorlopercellen hebben¹².

De canonieke Wnt-route is aangetoond om stam/voorlopercellenpopulaties te markeren in meerdere orgaansystemen, inclusief de hersenen, borstklier, h...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Petri dish, polystyrene, sterile Geriner Bio-one 35 x 10 mm	VWR international	82050-540
BD Falcon Cell Strainers, Sterile, BD Biosciences, blauw, 40 μm	VWR international	21008-949
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS). Oplossing met calcium, magnesium, en zonder fenol rood, steriel	VWR international	45000-456
Cellstar centrifuge buizen, polypropyleen, sterieel, greiner bio-one, 50 ml	VWR international	82050-346
Cellstar centrifuge buizen, polypropyleen, sterieel, greiner bio-one, 15 ml	VWR international	82050-278
B-27 Serum-vrij supplement (50x), vloeistof	Invitrogen	17504-044
N-2 Supplement (100x), vloeistof	Invitrogen	17502-048
bFGF, fibroblast growth factor-basic human	Sigma-Aldrich	F0291
IGF-1, insulin-like growth factor-1 van muis	Sigma-Aldrich	I8779
EGF, epidermal growth factor human	Sigma-Aldrich	E9644
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 50/50 Mix: 1X, met L-Glutamine en 15 mM HEPES	VWR international	45000-350
BD Falcon Ronde bodembuizen, wegwerp, polystyreen, 12x75	VWR international	60819-295
Trypsine, 0,25% (1X) met EDTA 4Na, vloeistof	Invitrogen	25200-056
ep Dualfilter TIPS 300uL, 960 TIPS	Eppendorf	22491245
Trypsine remmer, sojaboon, Gezuiverd	Worthington Biochemical	LS003570
BD Falcon 40um Cell Strainers	BD Biosciences	21008-949
Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One, Onbehandelde platen, 6 putjes	VWR international	82050-846
Marker Gene FACS Blue LacZ beta-Galactosidase Detectiekit	Marker Gene Technologies	M0255