Pull-down van calmoduline-bindende eiwitten

Samenvatting

Calmoduline (CAM) pull-down test is een effectieve manier om de interactie van CaM te onderzoeken met verschillende eiwitten. Deze methode maakt gebruik van CAM-sepharose kralen voor een efficiënte en specifieke analyse van de CAM-bindende eiwitten. Dit levert een belangrijk instrument om CaM signalering verkennen in cellulaire functie.

Samenvatting

Calcium (Ca ^{2 +)} is een ion van vitaal belang bij het ​​reguleren van cellulaire functie door een verscheidenheid van mechanismen. Een groot deel van Ca ^{2 +} signalering wordt gemedieerd door de calcium-bindende eiwit bekend als calmodulin (CAM) ^1,2. CaM is betrokken op verschillende niveaus in bijna alle cellulaire processen, met inbegrip van apoptose, metabolisme, gladde spiercontractie, synaptische plasticiteit, zenuwgroei, ontsteking en de immuunrespons. Een aantal van de eiwitten helpen reguleren deze routes door hun interactie met Cam. Veel van deze interacties zijn afhankelijk van de conformatie van CAM, dat is duidelijk anders wanneer gebonden aan Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +-CAM)} in tegenstelling tot de Ca ^{2 +-vrije} staat (ApoCaM) ^3.

Terwijl de meeste doelwit eiwitten binden Ca ^{2 +-CAM,} bepaalde eiwitten binden aan ApoCaM. Sommige binden CaM door middel van hun IQ-domein, met inbegrip neuromodulin ^4, neurogranin (Ng) ^5, en bepaalde myosins 7, postsynaptische functie ^8, en samentrekken van de spieren ⁹ te spelen, respectievelijk. Hun vermogen om te binden en laat CaM in de afwezigheid of aanwezigheid van Ca ^{2 +} staat centraal in hun functie. In tegenstelling tot vele eiwitten binden Ca ^{2 +-CaM} en vereisen deze binding voor hun activering. Voorbeelden hiervan zijn myosine lichte keten kinase ^10, Ca ^{2 +} / CAM-afhankelijke kinasen (CaMKs) ¹¹ en fosfatasen (bijv. calcineurine) ^12, en spectrin kinase ^13, die een verscheidenheid van directe en downstream effecten ¹⁴ hebben.

De effecten van deze eiwitten op cellulaire functie zijn vaak afhankelijk van hun vermogen om te CaM te binden in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier. Bijvoorbeeld, testten we de relevantie van Ng-CaM verbindend in synaptische functie en hoe de verschillende mutaties deze binding beïnvloeden. We genereerden een GFP-gelabelde Ng construct met specifieke mutaties in het IQ-domein dat het vermogen van Ng om CaM te binden in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier zou veranderen. De studie van deze verschillende mutaties gaf ons veel inzicht in belangrijke processen die betrokken zijn bij synaptische functie ^8,15. Echter, in deze studies, is het essentieel om aan te tonen dat de gemuteerde eiwitten de verwachte gewijzigde binding aan CaM hebben.

Hier presenteren we een methode voor het testen van het vermogen van proteïnen om naar CaM te binden in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca ^{2 +,} met behulp van CaMKII en Ng als voorbeelden. Deze methode is een vorm van affiniteitschromatografie aangeduid als een CAM pull-down test. Het maakt gebruik van CAM-Sepharose kralen om te testen eiwitten die zich binden aan CaM en de invloed van Ca ^{2 +} op deze bindend. Het is aanzienlijk meer tijd efficiënter en vereist minder eiwit ten opzichte van kolomchromatografie en andere testen. Alles bij elkaar levert dit een waardevol instrument is om Ca ^{2 +} verkennen / CAM-signalering en eiwitten die interact met CAM.

Protocol

Zie figuur 1 voor een basis-schema van de procedure te beginnen met de homogenaat. Geschatte tijd vanaf de voorbereiding van de cellulaire extracten om elutie van CAM-gebonden eiwitten is ongeveer zes tot zeven uur.

1. Tissue voorbereiding

1. Injecteer organotypische hippocampale plakken met een virus met een plasmide dat het recombinante eiwit van belang (in dit voorbeeld, groen fluorescerend eiwit (GFP)-gelabeld Ng) en laat een nacht weefsel te drukken eiwit.
2. Ongeveer 12 tot 18 uur na virale injectie (afhankelijk van het virale uitdrukking tijd), voor te bereiden op de weefsels te verzamelen. Voeg 1 ml dissectie buffer (10 mM glucose, 4mm KCl, 26mm NaHCO3, 233mm sucrose, 5mM _MgCl2, 1 mM _CaCl2, en 0,1% fenol-rood, vergast met 5% CO ₂ van 95% O ₂₎ tot een petrischaal. Transfer gekweekte weefsel / insert aan petrischaal en voeg 2 ml buffer dissectie van de voegen onder water het weefsel.
3. Collect organotypische hippocampus weefsel (tussen 5 en 10 plakjes) door voorzichtig schrapen het weefsel vrij zijn van de insert membraan met behulp van een scalpel. In het bijzonder het verwijderen van een bepaalde regio van belang (bijvoorbeeld CA1) is ook een optie. Overdracht van het gesuspendeerde vaatweefsel op een 1,5 ml microcentrifugebuis met behulp van een omgekeerde Pasteur pipet.
4. Centrifugeer monsters op 1500 RCF gedurende 1 minuut aan het weefsel te scheiden van de dissectie buffer. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie. Zorg ervoor dat niet aan de pellet te verstoren.
5. Voor elk segment gebruikt, voeg 30 tot 60 ul van homogenisering buffer (150mm NaCl, 20mm Tris pH 7,5, 1 mM DTT, 1μg/mL leupeptin, 1μg/mL chemostatin, 1μg/mL antipain, 1μg/mL pepstatine, en 1% Triton X -100) naar het weefsel en grondig gehomogeniseerd met stamper.
6. Met het oog op cellulair vuil te verwijderen, centrifuge de resterende homogenaat in 1100 RCF gedurende 10 minuten en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie terwijl het vermijden van verontreiniging van de pellet.
7. Nemen 10% van de supernatant als een voorbeeld van de input (sample 1). Bewaar de overblijvende supernatant op het ijs tijdens de bereiding van de CAM-sepharose kralen voor gebruik in stap 3.

Opmerking: Het weefsel hier gebruikt zijn organotypische hippocampus plakjes. Kan echter een gebruik losgekoppeld neuronen of een andere cel kweken systeem. In een dergelijk geval, te beginnen bij stap 1.4 na het verzamelen van uw weefsel op de juiste manier.

2. Voorbereiding van de kralen voor pull-down

Bij de afhandeling van de korrels, is het belangrijk om de kralen te redden en de efficiëntie van de reacties te maximaliseren door te voorkomen dat de kralen van het drogen aan de zijkanten van de buis. Om dit te doen, is het het beste om je tubes draaien aan hun kant, waardoor oplossing voor de kralen nat op de wanden van de buis, vlak voor centrifugeren.

1. Voor elke pull-down, pipet 400 pi van zwevende Calmoduline-Sepharose kralen in een 2 ml microcentrifugebuis met een relatief flaT-bottom aan de oppervlakte en de interactie van uw oplossingen te maximaliseren met de kralen tijdens uw incubaties.
2. Centrifugeer kralen aan 21.000 RCF gedurende 30 seconden en voorzichtig het supernatant te verwijderen door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren.
3. Te wassen de kralen, voeg 100 ul van de respectievelijke homogenisering buffer bestaande uit 2 mM CaCl ₂ die wordt gebruikt om pull-down Ca ^{2 +-CaM} bindende eiwitten en 2 mM EDTA (een bekende Ca ^{2 +} chelator) voor kralen naar beneden te trekken ApoCaM bindende eiwitten. Tik voorzichtig de buis om opnieuw te schorsen kralen en centrifugeer op 1500 RCF gedurende 1 minuut. Verwijder voorzichtig het supernatant door aspiratie, ervoor te zorgen dat niet op de kralen te verstoren.

Opmerking: Voor alle aspiratie stappen, is het aanbevolen om een ​​pipet tip dat een fijne opening (bijv. een gel laden tips) om de verwijdering van de oplossing mogelijk te maken zonder het verwijderen van kralen moet gebruiken.

3. Cam-Sepharose binding van eiwitten

1. Splits uw supernatant in twee condities met een gelijk volume. Afhankelijk van uw conditie, voeg de juiste hoeveelheid CaCl ₂ of EDTA om uw supernatant tot 2 mM concentratie voor elk.
2. Voeg supernatans van stap 1.7 tot kralen gewassen in de overeenkomstige homogenisering buffer. Tik voorzichtig de buis om te mengen.
3. Incubeer monsters bij 4 ° C gedurende 3 uur op een shaker. Re-schorten kralen elke 30 minuten of zo om de efficiëntie van binding te verhogen.
4. Centrifugebuis met de monsters en kralen op 1500 RCF gedurende 3 minuten.
5. Neem 50μL van supernatant als een steekproef van niet-gebonden eiwit (voorbeeld 2) en voorzichtig de resterende supernatant te verwijderen door aspiratie en gooi ze weg.
6. Was kralen drie keer, zoals beschreven in stap 2.3 met behulp van 100μL van de respectieve homogenisering buffer.

4. Elutie

1. Voeg 50μL van elutie buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, en 150 mm NaCl) met het tegenovergestelde toestand (10mm Cacl ₂ of 10mm EDTA) om de kralen. Bijvoorbeeld, monsters die werden gehomogeniseerd en gebonden in een buffer met Ca ^{2 +} worden geëlueerd in elutiebuffer met EDTA en vice-versa.

Optioneel: Warming de elutiebuffer tot 37 ° C voor het toevoegen aan korrels kunnen het rendement te verbeteren.

2. Broed-oplossing met kralen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op een shaker. Meng de kralen door zachtjes tikken op de buis ongeveer om de 5 minuten.
3. Centrifugeer kralen bij 1.500 RCF gedurende 3 minuten en zorgvuldig de 50μL van de supernatant te verwijderen voor het gebonden eiwit (voorbeeld 3) door aspiratie. Zorg ervoor dat u de kralen te verstoren.
4. Voeg eiwit laadbuffer om alle monsters (dwz homogenaat, ongebonden en gebonden eiwit evenals die nog steeds gebonden aan de beads).

Opmerking: Om elutie (vooral in het geval van inefficiënte elutie) te maximaliseren, voeg 50μL van de overeenkomstige elutiebuffer (bv. toevoeging van EDTA met buffer aan kralen gebonden zijn in de CaCl ₂₎ om de kralen vóór het verwarmen monsters te helpen elueren resterende gebonden eiwit en herhaal de stappen beschreven in 4.3 van de resterende gebonden eiwitten te verwijderen.

5. SDS-PAGE en western blot

Gedrag SDS-PAGE en analyseren met behulp van western blot door te zoeken naar uw proteïne van interesse en probe voor een eiwit waarvan bekend is CaM binden in de tegenovergestelde toestand als een positieve controle.

6. Representatieve resultaten

Figuur 2B toont een voorbeeld van een CAM-pull-down test het testen van de CaM binding van GFP-gelabelde Ng ten opzichte van endogene Ng. Om dit te doen, was GFP-Ng tot overexpressie gebracht in onze organotypische hippocampale slices 's nachts en het weefsel werd gehomogeniseerd. Het homogenaat werd geïncubeerd met CaM-sepharose kralen in de aanwezigheid van een Ca ^{2 +} of EDTA. Homogenaat ingang toont aan dat de GFP-Ng werd uitgedrukt in naast endogeen Ng en Ca ^{2 +} / CAM-afhankelijke kinase II(CaMKII). Zoals verwacht op basis van de bekende binding van endogene Ng (geïllustreerd in Fig. 2A), GFP-gelabelde Ng werd geëlueerd in de afwezigheid van Ca ^{2 +} (EDTA gebonden eiwit) en ongebonden in de aanwezigheid van Ca ^{2 +} (Fig. 2B) . Daarentegen was de controle, CaMKII, geëlueerd alleen in de aanwezigheid van Ca ^{2 +} (gebonden eiwit) en was ongebonden in zijn afwezigheid (EDTA). Hieruit blijkt dat de CAM kralen goed zijn functioneren en de eluties waren efficiënt. Het belangrijkste is, toont dit aan dat GFP-Ng bindt aan ApoCaM in een vergelijkbare wijze als de endogene vorm, wat suggereert dat het GFP-tag niet de functie van onze recombinant eiwit te veranderen.

Figuur 1. Schets van de Cam pull-down test
(A) Tissue homogenaat wordt afgedraaid om cellulaire vuil te verwijderen. Ongeveer 10% van de supernatant wordt beschouwd als een monster van de input (1). De overige supernatant is gelijk verdeeld voor de verschillendevoorwaarden en de juiste reagentia (CaCl ₂ of EDTA) worden toegevoegd aan bindend te testen in deze voorwaarden. Elke supernatant (met of CaCl ₂ of EDTA) is geladen op de respectievelijk voorbereide CaM-sepharose kralen en (B) geïncubeerd om bindend. Niet-gebonden eiwitten worden verwijderd (2) en (C) de gebonden eiwitten (3) worden geëlueerd off van de kralen met behulp van elutiebuffer (EB) met de tegenovergestelde voorwaarde als bindend. De eiwitsamenstelling van deze drie eiwit monsters kunnen worden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE en western blot-analyse.

Figuur 2. A.) Schematische voorstelling van Ca ^{2 +-afhankelijke} CaM binding en elutie in pull-down test worden voorbeelden gegeven van twee soorten eiwitten die zich binden CaM in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier. Neurogranin (Ng) vertegenwoordigt eiwitten die zich binden apo-CAM en CaMKII eiwitten die zich binden aan Ca ^{2 +-rijke} vertegenwoordigtCam. CaM is te zien in de gedissocieerde toestand voorafgaand aan incubatie met de homogenaat eiwitten. Zodra geïncubeerd onder omstandigheden van hoge Ca ^{2 +-concentraties} (2 mm) of in de aanwezigheid van een Ca ^{2 +} chelator, EDTA (2 mM), de eiwitten zal dienovereenkomstig binden aan CAM. Ng bindt CaM in de EDTA staat omdat er weinig tot geen Ca ^{2 +} aanwezig is, en zou worden geëlueerd uit de CAM-Sepharose kralen in de aanwezigheid van Ca ^{2 +.} CaMKII zou echter binden aan CaM in de aanwezigheid van grote hoeveelheden Ca ^{2 +} en zou distantiëren zodra de Ca ^{2 +} was chelaatvorm.
B.) De resultaten van bijvoorbeeld CaM pull-down test. Deze figuur toont het verwachte eindresultaat van een CAM-sepharose naar beneden trekken met de monsters gepeild Voor aardgas-en CaMKII. Zowel de endogene Ng en GFP-Ng aanwezig zijn in de lanen van eiwitten gebonden aan CaM in de aanwezigheid van EDTA. Geen Ng is gebonden wanneer monsters worden geïncubeerd met CaM in de aanwezigheid van Ca ^{2 +,} waaruit blijkt dat Ng bindt alleen apo-Cam. Onze positieve controle, CaMKII, aan de andere kant, bindt zich aan CaM alleen in de aanwezigheid van Ca ^{2 +.}

Discussie

De verstrekte protocol maakt gebruik van CaM-sepharose kralen te onderzoeken van de Ca ^{2 +-afhankelijkheid} van de CAM-bindende eiwitten. Veel eiwitten binden CaM in een Ca ^{2 +-afhankelijke} manier. Deze interacties zijn van groot belang gezien het aantal van de Cam-bindende eiwitten en hun kritische rol in vele signaleringsroutes. In dit protocol zijn CaM-sepharose kralen gebruikt voor het CAM-bindende eiwitten te scheiden van weefsel homogenaat in de aanwezigheid of afwezigheid van Ca ^{2 +.}

Materialen

Product	Vennootschap	Catalogus nummer	Opmerkingen
Calmodulin-Sepharose kralen	GE Healthcare	17-0529-01
Anti-CaMKII Alpha	Sigma-Aldrich	C6974
Anti-neurogranin	Millipore	07-425
Gel wordt geladen Pipet Tips	Visser	02-707-138	Gebruik voor aspiratie van supernatantia
Microcentrifugebuizen (2,0 ml)	Visser	05-408-146	Te gebruiken voor alle stappen met betrekking tot calmodulin-sepharose kralen