Tracking Hypoxische Signalering binnen Encapsulated Cell Aggregaten

Samenvatting

Een methode voor het foto-inkapseling van cellen in een verknoopt PEG hydrogel wordt beschreven. Hypoxische signalering binnen ingekapseld murine insulinoom (MIN6) aggregaten is gevolgd met behulp van een fluorescerende marker-systeem. Dit systeem maakt serie onderzoek van de cellen binnen een hydrogel steiger en correlatie van hypoxische signalering met veranderingen in de cel fenotype.

Samenvatting

In Diabetes mellitus type 1, auto-immune vernietiging van de pancreas β-cellen resulteert in het verlies van de productie van insuline en potentieel dodelijke hyperglykemie. Als een alternatieve behandelingsoptie zijn voor exogene insuline-injectie, is transplantatie van functionele pancreas weefsel onderzocht ^1,2. Deze aanpak biedt de belofte van een meer natuurlijke, lange termijn herstel van normoglycemia. Bescherming van de donor weefsel van het immuunsysteem van de gastheer nodig om te voorkomen dat afwijzing en inkapseling is een methode die wordt gebruikt om te helpen dit doel te bereiken.

Biologisch afgeleide materialen, zoals alginaat ³ en ⁴ agarose, zijn de traditionele keuze voor de capsule de bouw, maar kan een ontsteking of een fibrotische overgroei ⁵ die voedingsstoffen en zuurstof transport kunnen belemmeren induceren. Als alternatief, synthetische poly (ethyleenglycol) (PEG)-gebaseerde hydrogels zijn niet-afbrekende, gemakkelijk gefunctionaliseerde, beschikbaar op hoge zuiverheid,hebben regelbare poriegrootte, en zijn extreem biocompatibel, ^6,7,8. Als bijkomend voordeel, kan PEG hydrogels snel worden gevormd in een eenvoudige foto-crosslinking reactie die niet nodig is de toepassing van niet-fysiologische temperaturen ^6,7. Een dergelijke procedure wordt hier beschreven. In de verknopingsreactie, UV degradatie van de foto-initiator, 1 - [4 - (2-hydroxyethoxy)-fenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propaan-1-een (Irgacure 2959), produceert vrije radicalen die aanval de vinyl koolstof-koolstof dubbele bindingen van dimethacrylated PEG (PEGDM) induceren verknoping aan de ketting uiteinden. Verknoping kan worden bereikt binnen 10 minuten. PEG hydrogels gebouwd op een zodanige wijze is aangetoond dat ze positief te ondersteunen cellen ^7,9, en de lage fotoinitiator concentratie en korte blootstelling aan UV-straling is niet schadelijk voor de levensvatbaarheid en functie van de ingekapselde weefsel ^10. Terwijl we methacrylaat onze PEG met de hierna beschreven methode, kan PEGDM ook directly gekocht van leveranciers zoals Sigma.

Een inherent gevolg van inkapseling is isolatie van de cellen van een vasculaire netwerk. Aanvoer van voedingsstoffen, met name zuurstof, is daarom verminderd en beperkt door diffusie. Deze verminderde beschikbaarheid van zuurstof kan met name gevolgen voor β-cellen waarvan de insuline secretie functie is sterk afhankelijk van zuurstof ^11-13. Capsule samenstelling en de geometrie zal ook gevolgen hebben diffusie tarieven en lengtes voor zuurstof. Daarom hebben we ook een beschrijving van een techniek voor het identificeren van hypoxische cellen binnen onze PEG capsules. Infectie van de cellen met een recombinant adenovirus zorgt voor een fluorescent signaal wordt geproduceerd wanneer intracellulaire hypoxia-induceerbare factor (HIF) paden worden geactiveerd ^14. Omdat HIFs zijn de belangrijkste regulatoren van de transcriptionele respons op hypoxie, zij vertegenwoordigen een ideaal doelwit marker voor de detectie van hypoxische signalering ^15. Deze aanpak zorgt voor eenvoudige en snelle detectie van HYPOXIc cellen. Kortom, het adenovirus is de sequentie voor een rood fluorescerend eiwit (Ds Red DR uit Clontech) onder de controle van een hypoxie-responsief element (HRE) trimeer. Stabilisatie van HIF-1 door lage zuurstofgehalte zal rijden transcriptie van het fluorescente eiwit (figuur 1). Aanvullende details over de bouw van dit virus zijn eerder ¹⁵ gepubliceerd. Het virus wordt opgeslagen in 10% glycerol bij -80 ° C zoveel 150 pi porties in 1,5 ml centrifugebuis bij een concentratie van 3,4 x ¹⁰ 10 PFU / ml.

Eerdere studies in ons laboratorium hebben aangetoond dat MIN6 cellen ingekapseld als aggregaten behouden hun levensvatbaarheid gedurende vier weken van de cultuur in 20% zuurstof. MIN6 aggregaten gekweekt op 2 of 1% zuurstof beide tekenen van necrotische cellen (nog ongeveer 85-90% levensvatbare) toonde door kleuring met ethidiumbromide en morfologische veranderingen ten opzichte van cellen in 20% zuurstof. De gladde bolvormige vorm van de aggregaten worden weergegeven op 20% was lost en aggregaten leek meer op ongeorganiseerde groepen van cellen. Terwijl het lage zuurstof-spanning niet leiden tot een uitgesproken daling van de levensvatbaarheid, is duidelijk van invloed MIN6 aggregatie en functie zoals gemeten door glucose-gestimuleerde insuline secretie ^15. Western blot analyse van ingekapselde cellen in 20% en 1% zuurstof toonde ook een significante toename van HIF-1α voor cellen gekweekt in het lage zuurstofgehalte, die correleert met de expressie van de DsRed DR eiwit.

Protocol

1. PEGDM synthese en fotoactieve PEGDM macromer oplossing voor de voorbereiding

1. Weeg 2g van PEG (lineair, 10.000 Da) in een 40 ml glazen flacon met een hard plastic dop.
2. Voeg ongeveer 308μL van methacrylzuuranhydride en losjes dop van de flacon.
3. Magnetron de flacon op hoge gedurende 2 minuten in een standaard huishoudelijk magnetron. Het dragen van hittebestendige handschoenen, grondig vortex de flacon, dan is de magnetron op hoog voor een extra 5 minuten.
4. Kort zodat de flacon genoeg koelen worden behandeld met handschoenen. Haal het beschermkapje het en voeg langzaam methyleenchloride, terwijl wervelende de flacon. Voeg genoeg, zodat de oplossing blijkt duidelijk en homogeen, vortexen het monster als dat nodig is. Het totale volume van de gebruikte methyleenchloride moet 1,5 - 2 ml.
5. Neerslag PEGDM in 200 ml koud, geroerd diëthylether door het toevoegen van de oplossing druppelsgewijs.
6. Verzamel de PEGDM door vacuümfiltratie en laat het drogen.
7. Los de PEGDM in voldoende mategedeïoniseerd water (meestal 100 -150 ml).
8. Dialyze de oplossing tegen gedemineraliseerd water gedurende 5 dagen in dialyse buis met een moleculair gewicht van cut-off van 1000 Da. Vervang het water eenmaal daags.
9. Aliquot de oplossing in daarvoor bestemde containers en invriezen bij -80 ° C gedurende de nacht. Lyophilize de oplossing voor 4 dagen naar een gezuiverde witte poeder PEGDM opleveren. Bewaar het poeder bij 4 ° C wanneer niet in gebruik.
10. Ter voorbereiding op een fotoactieve PEGDM oplossing, prepareert u eerst een 0,5 gewichtsprocent fotoinitiator stockoplossing door het oplossen van Irgacure 2959 in gedeïoniseerd water. Vortex de oplossing en bewaar het in het donker.
11. Bereid een 10 gew% PEGDM en 0,025 gew% Irgacure 2959 oplossing in Balanced Salt Solution Hank's (HBSS). Vortex grondig op ontbinding van de PEGDM te verzekeren. We meestal voor te bereiden 1 ml van deze oplossing op een moment.
12. Steriliseer de oplossing door te filteren door middel van een injectiespuit 0,2 um filter in een 1,8 ml microcentrifugebuis. Wikkel de buis in aluminiumfolieen bewaar bij 4 ° C

2. Cultuur, infectie en aggregatie van MIN6 cellen

1. MIN6 cellen worden gekweekt in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, 7mm glucose, 100 eenheden / ml penicilline / streptomycine, en 0,5 pg / ml amphotercin B in een vochtige omgeving bij 37 ° C en 5% CO _2.
2. Vrij te geven de cellen van het behandelde oppervlak cultuur fles, zuig het medium, spoel de cellen met 37 ° C calcium / magnesium-vrij HBSS, aspiratie van de HBSS, voeg vervolgens 2 ml van 37 ° C trypsine-EDTA oplossing en laat de cellen incubeer gedurende 3 minuten.
3. Stevig potje aan de zijkant van de buis om de cellen te kloppen gratis, voeg vervolgens 8 mL van 37 ° C medium en krachtig de celsuspensie omhoog pipet en neer zorg niet te bellen introduceren.
4. Pipetteer de cellen in een steriele 15 ml centrifugebuis en het uitvoeren van een celgetal met behulp van een hemocytometer of een andere cel tellen procedure.
5. Bij de voorbereiding van de cellen te infecteren met de makervirus, eerst bepalen het totale aantal cellen besmet worden en bereken het volume van het virus suspensie nodig is om de gewenste multipliciteit van infectie (MOI) (50 tot 100 besmettelijke deeltjes per cel) te bereiken.
6. Verdun het virus in HBSS door voorzichtig pipetteren de juiste hoeveelheid van het virus suspensie in een pre-gealiquoteerd volume van HBSS in een 1,8 ml microcentrifugebuis. 50 ul van HBSS per putje van de samenvoeging van cellen geschikt is.
7. De verspreiding van de cellen door pipetteren ze op en neer in hun buis, dan pipet het nodige volume van 400.000 cellen per putje te bereiken in de putjes van een 6-well ophanging cultuur plaat.
8. Voeg de juiste volume verdund virus aan elk putje om de gewenste MOI te bereiken.
9. Voeg medium in elk putje om het totale volume aan te passen aan 1,7 ml.
10. Plaats de plaat op een rondschudapparaat in de incubator. Zet de shaker op een lage stand, zodat het medium voorzichtig wast rond de putten (~ 100 rpm). Laat de cellen aggregatieniveaute voor 24-36 uur. Aggregaten met een geschatte diameter van 75 tot 175 micrometer moet worden gevormd.

3. Inkapseling van cellen in PEGDM

1. Cellen kunnen worden ingekapseld als een dispersie (stap 2.4), of na aggregatie (stap 2.10). Sinds de hydrogel precursor PEGDM oplossing is een vloeistof, kunnen cellen hebben de neiging om zich te vestigen voorafgaand aan verknoping en hydrogel vorming. Indien de afwikkeling zal naar verwachting snel plaatsvinden, zoals met grotere aggregaten, kan het nuttig zijn om de hydrogel te produceren in twee stappen, zodat de cellen af ​​te wikkelen naar een centrale vlak van de gel. Een een-stap hydrogel synthese procedure geschikt is voor verspreide cellen wordt getoond (Figuur 2) en de twee-staps procedure wordt getoond als goed (Figuur 3) en gedetailleerde hieronder (3,2 tot +3,9).
2. Maak een vat waarin de hydrogel wordt gevormd door het snijden van de taps toelopende tip van een 1 ml plastic spuit en het plaatsen van het open uiteinde in een rack.
3. Pipetteer 20 ul van fotoactieve PEGDM zolutie in het open uiteinde van de spuit op de zuiger ervoor te zorgen dat het volume beslaat de gehele zuiger oppervlak. Pas de zuiger in kleine stappen op een vlakke ondergrond vloeistof te bereiken.
4. Plaats de pipet in het rek en plaats het rek onder een UV-lamp (365nm, ~ 7 mW / cm ²⁾ voor ongeveer 8 minuten zodat voor de hydrogel verknoping. Gedurende deze tijd kan de voorbereiding van de cellen worden begonnen
5. Pipet een volume met het gewenste aantal cellen / aggregaten in een 1,8 ml microcentrifugebuis, cap, en centrifugeer de buis op 130 g gedurende 5 minuten.
6. Met behulp van een micropipettor, verwijder voorzichtig de media zonder de celpellet aan het uiteinde van de buis. Zoals de media het hoofd nadert de korrel, kan het nuttig zijn om een ​​fijner te gebruiken, 10 pi pipet tip.
7. Voorzichtig resuspendeer de cel pellet in 20 ul fotoactieve PEGDM oplossing (gebruik van een brede mond pipet tip bij het werken met aggregaten) en voeg de celsuspensie aan de spuit op de top van ee eerder verknoopt hydrogel gedeelte.
8. Expose de spuit om een ​​extra 8 minuten van het UV-licht voor de bouw van de hydrogel te voltooien. Wanneer u klaar bent, moet de cellen volledig worden ingekapseld in de cilindrische hydrogel (figuur 3).
9. Verwijder de hydrogel uit de spuit in 1 ml van HBSS in het putje van een 24-well plaat om kort was de gel. Breng de gel tot 1 ml van media in het putje van een 24-wells plaat en cultuur onder de gewenste condities.

4. Hypoxie tracking

1. Op elk moment tijdens de cultuur, het imago van de cellen met behulp van fluorescentie microscopie om de opening van hypoxische signalering track. Afhankelijk van wat wordt afgebeeld kunt u beeld in de multi-well plaat of de gel op een objectglaasje voor transfer naar plaatsing op de microscoop podium. Peak excitatie van Ds Red is bereikt bij 556nm en de piek emissie vindt plaats bij 586nm. -Emissie is vrij intens en dus fotobleking is niet waarneembareed te zijn problematisch. Vertraging tussen de aanvang van de eiwitproductie en eerste signaal detectie is ongeveer 12 uur. Signaal is specifiek genoeg voor bepaalde signalering cellen te identificeren, maar resolutie kan onvoldoende voor het bepalen van intracellulaire signaal lokalisatie. Bij het signaleren van cellen, is het signaal meestal uniform tijdens de hele het cytoplasma. Intensiteit van het signaal kan ook toenemen bij langdurige blootstelling aan hypoxie, al hebben we nog niet volledig vastgesteld of dit te wijten is aan verhoogde eiwitexpressie, de totale eiwit ophoping, of vertraagd eiwit rijping.

5. Representatieve resultaten

Een representatief voorbeeld van MIN6 aggregaten ingekapseld in een PEG hydrogel is weergegeven in Figuur 4. De verknoopte gel wordt sterk zijn, waarbij de vorm van het vat waarin de reactie werd uitgevoerd. Een gel met gladde buitenkant is de voorkeur voor implantatie te helpen bij de preventie van een vreemd lichaam response. In de gel, moet cel aggregaten volledig worden ingesloten in de matrix en homogeen verdeeld om een ​​betere transport van nutriënten.

Representatief beeld van hypoxische signalering in MIN6 aggregaten zijn afgebeeld in figuur 5. Identieke MIN6 aggregaten besmet met het virus marker werden gekweekt in een van beide 20% O ₂ (5 bis) of 1% O ₂ (5b) voor 44 uur voordat de foto vast te leggen.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de activiteit van onze hypoxie merker-systeem. Adenovirale het inbrengen van de Ds Red DR gen en upstream HRE promotor zorgt voor hypoxie-geïnduceerde productie van het fluorescerende eiwit onder de controle van HIF-1.

Figuur 2. Procedurele stroomschema voor de single-step inkapseling van MIN6 cellen verspreid in een crosslinked PEGDM hydrogel. Voor elke gel, worden de verspreid cellen gesuspendeerd in 40μL van de fotoactieve PEGDM macromer oplossing. Dit is geplaatst in een onthoofd 1 ml spuit en de hydrogel wordt gevormd onder 365nm UV-licht na 10-12 minuten. Na voltooiing wordt de hydrogel schijf verwijderd uit de spuit, gewassen en geplaatst in een medium-gevulde wells plaat voor incubatie.

Figuur 3. Procedurele stroomschema voor de dual-stap inkapseling van geaggregeerde MIN6 cellen in een verknoopt PEGDM hydrogel. Voor elke gel, is een half-gel eerst gemaakt door middel van UV verknoping van 20μL van de fotoactieve PEGDM macromer oplossing gedurende 8 minuten. MIN6 aggregaten zijn zorgvuldig gesuspendeerd in een extra 20μL van fotoactieve macromer oplossing die wordt toegevoegd op de top van de voorgevormde half-gel. De volledige gel wordt gevormd door een extra 8 minuten van UV-straling met aggregaten volledig ingekapseld in de medialevlak van de gel.

Figuur 4. Afbeelding van een 40μL hydrogel onder een vergroting van 20x. MIN6 aggregaten (~ 400.000 totaal-cellen) zijn duidelijk te zien in de gel. Hydrogel diameter is ongeveer 6 mm (bar = 1mm).

Figuur 5. Fluorescent hypoxie signalisatie in geaggregeerde MIN6 cellen in een PEGDM hydrogel. Cellen die zijn ingekapseld en vervolgens geplaatst in de incubatie bij 20% O ₂ voor 44 uur doen hypoxie signalisatie (a) niet weergegeven, terwijl cellen die vervolgens werden ingekapseld geïncubeerd in 2% O ₂ voor 44 uur een leeg scherm alomtegenwoordig signaal. (Bar = 100 urn) (b).

Discussie

De hier gepresenteerde methode biedt een snelle en eenvoudige techniek voor mobiele inkapseling in een PEG hydrogel met minimale gebruik van niet-fysiologische omstandigheden. PEG is een zeer nuttige inkapseling materiaal voor de biocompatibiliteit en het gemak van de wijziging. Eenvoudige variatie van PEG percentage in het fotoactieve oplossing, bijvoorbeeld, kan worden gebruikt om mechanische eigenschappen, zoals druk-modulus, en transport eigenschappen aan te passen door middel van poriegrootte. Ook is PEG eenvoudig worden aangepast door de toevoeging van zijketens. PEG hydrogels, dus, is zowel een veelbelovende klinische apparaat en een flexibel platform voor in-vitro-onderzoek

Een methode voor het bijhouden van hypoxie in de PEG-ingekapselde cellen is ook gepresenteerd. Deze methode is handig voor de eenvoud van hypoxie detectie en voor het voorkomen van de noodzaak om de cellen van belang te offeren. De techniek kan worden toegepast op een verscheidenheid van soorten cellen in een uiteenlopende omstandigheden te maken zijn wijefulness breed. Zo kan hypoxie als een cue voor de stamcellen differentiatie worden bijgehouden in stamcellen Micromass culturen. Toch kan deze methode alleen worden toegepast op cel-systemen of systeem waarin verspreide cellen zijn later samengevoegd verspreiden. Ook kan de detectie van het fluorescentie-signaal moeilijk zijn in grotere of dichter weefsels.

Materialen

Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties (optioneel
PEG	Sigma-Aldrich	309028-500G
Methacrylzuuranhydride	Sigma-Aldrich	276685-100ML
Magnetron	Emerson	MW8784SB
Vortexer	Wetenschappelijke Industries	SI-A236
Methyleenchloride	Sigma-Aldrich	D65100-1L
Diethylether	Sigma-Aldrich	346136-1L
Dialyse Tubing	Spectrum	132640
	Laboratoria
Vriezer
Vriesdroger	Labconco	7670521
Vacuümpomp	Bedriegen	8917Z-01
Irgacure 2959	Ciba-Geigy	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21-022-CV
Spuitfilter	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	* Custom formulering
FBS	PAA Laboratories	A15-351
Penicilline-streptomycine	Mediatech	30 tot 002-CI
Amfotericine B	Mediatech	30 tot 003-CF
Couveuse	Thermo Scientific	3597	Napco Series 8000 WJ w / O2 onderdrukking
Trypsine EDTA	Mediatech	25 tot 052-CI
Orbital Shaker	VWR	12620-926
UV-lamp	Sanyo Denri	FLR40SBLB / M	Heeft twee 40W, 365nm blacklight blauw UV-lampen
Centrifuge	Eppendorf	5811 000.010 *	* Ordernummer. Model 5810 R
Microscoop	Nikon	TI-Pd6-PFS	Met filterset voor 556nm excitatie / 586nm emissie