Gemodificeerde gist-twee-hybride systeem aan eiwitten Interactie met de groeifactor progranuline identificeren

Samenvatting

We hebben gewijzigd de conventionele gist twee-hybride screening, een effectief middel bij het identificeren van genetische eiwit interactie. Deze wijziging verkort aanzienlijk het proces, vermindert de werkdruk, en het belangrijkst, vermindert het aantal false positives. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar.

Samenvatting

Progranuline (PGRN), ook wel bekend als granulin epithelin precursor (GEP), is een 593-amino-acid autocriene groeifactor. PGRN is bekend dat het een cruciale rol te spelen in een verscheidenheid van fysiologische en ziekte-processen, waaronder vroege embryogenese, wondgenezing ^1, ontsteking ^{2, 3} en ⁴ afweer. PGRN functioneert ook als een neurotrofe factor ^5, en mutaties in het gen resulteert in PGRN gedeeltelijk verlies van de PGRN eiwit veroorzaken frontotemporale dementie ^{6, 7.} Onze recente studies hebben geleid tot de isolatie van PGRN als een belangrijke regulator van het kraakbeen ontwikkeling en degradatie ^8-11. Hoewel PGRN, ontdekte bijna twee decennia geleden, speelt cruciale rol in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden, inspanningen om de acties van PGRN te benutten en te begrijpen betrokken mechanismen zijn aanzienlijk gehinderd door ons onvermogen om de binding receptor (s) te identificeren. Om dit probleem op, ontwikkelden we een modigespecificeerd gist twee-hybride (MY2H) aanpak, gebaseerd op de meest gebruikte GAL4 op basis van twee-hybride systeem. Vergeleken met de conventionele gist two-hybrid screen, MY2H verkort drastisch het scherm en vermindert het aantal vals positieve klonen. Daarnaast is deze aanpak is reproduceerbaar en betrouwbaar, en we hebben met succes toegepast dit systeem in het isoleren van de bindende eiwitten van verschillende aas, waaronder ion-kanaal ^12, extracellulaire matrix eiwit ^{10, 13,} en de groei factor ^14. In dit artikel beschrijven we deze MY2H experimentele procedure in detail met behulp van PGRN als een voorbeeld dat tot de identificatie van TNFR2 geleid als de eerste bekende PGRN-geassocieerde receptor ^{14, 15.}

Protocol

1. Achtergrond informatie

De gist twee-hybride systeem is een krachtige genetische techniek die wordt gebruikt om eiwit-eiwit interacties ^{16, 17} te ontdekken. Verschillende soorten van twee-hybride systemen, zoals LexA-gebaseerde systemen, het Sos Recruitment System en bacterie-of zoogdiercellen op basis van twee-hybriden, zijn commerciële beschikbaar zijn, dit artikel richt zich specifiek op de wijzigingen van de meest gebruikte GAL4 op basis van gist twee-hybride systeem. In het kort, is de methode gebaseerd op de eigenschappen van de gist GAL4 eiwit dat bestaat uit scheidbare domeinen die verantwoordelijk is voor DNA-binding en transcriptionele activering. Het aas eiwit wordt uitgedrukt als een fusie met de GAL4 DNA-bindende domein (DNA-BD), terwijl de prooi eiwitten worden uitgedrukt als fusies aan het GAL4 activatie domein (AD). Interactie tussen aas en prooi fusie-eiwitten leidt tot de transcriptionele activeringen van GAL4-bindende sites die reporter genen die geïntegreerd zijn in de gist genome. Het principe van Y2H wordt geïllustreerd in Fig. 1 en de experimentele procedure is samengevat in Fig. 2.

2. Benodigde materialen en oplossingen

1. YPD groeimedium (een mix van pepton, gistextract, en dextrose in een optimale verhouding voor het kweken van de meeste stammen Saccharomyces cerevisiae).
2. Minimale SD Bases (Minimal synthetische gedefinieerd (SD) basen zijn onder meer een yeast nitrogen base, ammoniumsulfaat, en een koolstofbron, dextrose. Dropout (DO) supplementen kunnen worden toegevoegd aan de Minimal SD-Base een synthetisch, gedefinieerd medium zonder de opgegeven te maken nutriënten).
3. Leu /-Trp Dropout (DO) aan te vullen (met daarin alle essentiële aminozuren, behalve voor leucine en tryptofaan)
4. -His/-Leu/-Trp/-Ura Dropout (DO) Supplement (bevat alle essentiële aminozuren, behalve voor leucine, tryptofaan, histidine en uracil)
5. Luria-bouillon (LB) (Trypton 10 g / L, gistextract 5 g / L, NaCl 5 g / L)
6. X-Gal (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) oplossing: bereid als een 20 mg / ml voorraad oplossing in N, N-dimethylformamide
7. 10X TE (100 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA, geautoclaveerd)
8. Gesoniceerde Haring of zalmsperma DNA, gekookt (10 mg / ml)
9. 10X LiAc (1 M lithium-acetaat, geautoclaveerd)
10. 50% PEG-3350-oplossing, filter-gesteriliseerd
11. 3-Amino-1, 2, 4-triazool (3AT)
12. Kanamycine
13. Ampicilline
14. ElectroMax DH5a cellen
15. Z buffer: 16,1 g Na2HPO4 7H2O (of 8,52 g watervrij), 5,5 g NaH2PO4 H2O (of 4,8 ganhydrous), 0,75 g KCl, 0,246 g MgSO4 7H2O (of 0,12 g watervrij), opgelost in 1 L geautoclaveerd, gedestilleerd water en aangepast aan pH 7,0.

3. Bait generatie (pDBLeu-PGRN)

Een cDNA-fragment dat codeert voor PGRN ontbreekt het signaal peptide (aa21-588) werd directioneel gekloneerd in de Sal I-Not I sites van de pDBLeu vector (de ProQuest twee-hybride systeem, Invitrogen),het houden van dezelfde vertaling te lezen frame als de GAL4 DNA-bindende domein aan pDBLeu-PGRN te genereren.

1. Versterken het cDNA-fragment van PGRN hierboven beschreven door middel van PCR met behulp van oligonucleotide primers ontworpen om restrictieplaatsen (Sal ik op de 5'-uiteinde en niet ik aan het 3 'uiteinde) om in-frame fusie toe bevatten.
2. Gel zuiveren het PCR-product, te verteren met een restrictie-endonucleasen Sal I en Not I.
   Bereid de DB vector pDBLeu door dubbele restrictievertering met dezelfde restrictie-endonucleasen.
3. Afbinden de beperking PGRN fragment in de gelineariseerde pDBLeu vector en zetten in DH5a met de selectie voor LB + kanamycine bij 25 ug / ml.
4. Controleer of de correctie van het construct door DNA-sequencing.

4. Kleinschalige transformatie van aas plasmide

1. Inoculeer 5 ml van YPD met een kolonie van Mav203 (Invitrogen) toe, schud 's nachts bij 30 ° C.
2. Verdun de nacht cultuur op in 50 ml YPD. Grow een toe te voegennele 2-4 uur.
3. Pellet de cellen bij 3000 rpm gedurende 5 min bij RT. Resuspendeer de pellet in 40 ml van geautoclaveerd, gedestilleerd water.
4. Re-pellet de cellen. Resuspendeer in 2 ml oplossing I, incubeer bij RT 10 minuten.
   Oplossing I: 0,5 ml 10xLiAc, 0,5 ml 10xTE, 4 ml H ₂ O
5. Doseer het DNA van buizen: 2-3 pi pDBLeu-PGRN (0.25μg/μl) en 10 ul van gedenatureerd, geschoren zalmsperma DNA (10μg/μl). Voeg 100μl gistcellen, goed mengen.
6. Voeg 700μl oplossing II, meng goed. Incubeer bij 30 ° C gedurende 30 minuten. Oplossing II: 0,2 ml 10xLiAc, 0,2 ml 10xTE, 1,6 ml 50% PEG3350.
7. Heat shock bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
8. Pellet gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet in 200 ul geautoclaveerd, gedestilleerd water.
9. Het bord van de ophanging op SD-Leu platen met seriële verdunningen. Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2-3 dagen.

5. Bait validatie

Voordat u jast two-hybrid screen, test pDBLeu-PGRN voor zelfwerkzaamheid en bepalen de basale expressie niveaus van de HIS3 reportergen. Deze test bepaalt of aas transcriptie te activeren, en of de zelf-activatie kan worden geneutraliseerd door inhibitoren. 3-Amino-1, 2, 4-triazool (3-AT) is een competitieve remmer van de HIS3-gen product en kan gebruikt worden om het minimumniveau van HIS3 expressie die nodig zijn voor groei op de histidine-deficiënte media titreren.

1. Transformeer de pDBLeu-PGRN in gist Mav203 stam, het bord van de transformatie op SD-Leu platen, en incubeer 48-72 uur bij 30 ° C.
2. Patch kolonies van elke transformatie met behulp van geautoclaveerd tandenstokers op SD-Leu-Zijn platen met 3-AT bij concentraties van 10 mm, 25 mm, 50 mm, 75 mm, en 100 mm. 3-AT is een competitieve remmer van het enzym HIS3 en enige aas dat zelf-activatie vertonen in staat zal zijn om te groeien in de aanwezigheid van de 3-AT.
3. Aas stammen die groeien op platen containing 100 mm 3-AT zijn niet geschikt voor gebruik in de twee-hybride scherm. Voor aas dat gebruikt kan worden, gebruik maken van de laagste drie-AT concentratie dat de celgroei remt. In veel gevallen is 25 mM 3-AT wordt gebruikt voor de screening.

6. cDNA-bibliotheek screening

De pDBLeu-PGRN plasmide wordt geïntroduceerd in MaV203 met behulp van een kleinschalig transformatie zoals hierboven beschreven. Het introduceren van pPC86-bibliotheek (Invitrogen) in MaV203 (pDBLeu-PGRN), de hieronder beschreven procedure meestal geeft ~ 4 x 10 ⁴ kolonies met 0,5 ug van plasmide-DNA-bibliotheek. Daarom zal 2,5 x 10 ⁶ gist-transformanten nodig ~ 30,0 microgram pPC86-cDNA bibliotheek plasmide DNA, 25 transformaties, en vijftig 10-cm platen (SD-Leu-Trp-His-Ura +3 AT).

1. Bereid het juiste aantal van 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura +3 AT platen (50 voor de procedure hieronder). Ook voorbereiden op ten minste vier 10-cm SD-Leu-Trp platen voor het schatten van het aantal transformanten.
2. Transformeer de bibliotheek inde MaV203 met pDBLeu-PGRN volgens de hieronder beschreven procedure.
   1. Te schorten verschillende geïsoleerde kolonies van MaV203 (pDBLeu-PGRN) in ~ 100μl geautoclaveerd, gedestilleerd water en verdeel ze op een 10-cm SD-Leu plaat. Herhaal de procedure voor een tweede SD-Leu plaat. Incubeer beide platen voor 18-24 uur bij 30 ° C.
   2. Schraap en volledig de cellen te schorten in 10 ml autoclaaf, gedestilleerd water. Voeg een voldoende hoeveelheid van de celsuspensie tot 500 ml vloeistof YPD medium in een kolf een OD ₆₀₀ van ~ 0,1 te geven.
   3. Controleer of de OD is ~ 0.1 na de inenting.
   4. Schudden bij 30 ° C totdat de OD ₆₀₀ bereikt ~ 0.4.
   5. Bereid vers:
      1. 110 ml 1X TE / LiAc door het combineren van 11 ml 10x TE, 11 ml 10x LiAc, en 88 ml geautoclaveerd water.
      2. 16 ml PEG / LiAc door het combineren van 1,6 ml 10X TE, 1,6 ml 10x LiAc, en 12,8 ml 50% PEG-3350.
   6. Pellet de cellen bij 3000g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Gooi tHij supernatants en voorzichtig resuspendeer de pellet door en neer te pipetteren in 100 ml autoclaaf, gedestilleerd water op kamertemperatuur.
   8. Centrifugeer bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   9. Verwijder het supernatant van de cellen en gecentrifugeerd resuspendeer de cel pellet in 50 ml 1X TE / LiAc oplossing.
   10. Centrifugeer bij 3000 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   11. Verwijder de supernatants en resuspendeer de pellet in een uiteindelijk volume van 2,5 ml 1X TE / LiAc oplossing.
   12. Uit te voeren 25 transformaties. Combineer 2,5 ml cellen, 125 ul (10μg/μl) gedenatureerd, geschoren zalmsperma DNA, en 30 ug cDNA-bibliotheek. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren. Voeg 15 ml PEG / LiAc-oplossing toe en meng voorzichtig. Aliquot in 25 geautoclaveerd 1,5 ml microcentrifugebuizen van 700 ui per stuk.
   13. Incubeer gedurende 30 minuten in een 30 ° C waterbad.
   14. Heat shock gedurende 15 minuten in een 42 ° C waterbad.
   15. Centrifugeer bij 6.000 g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant. Voorzichtig hersuspenderen elke pellet in 400 ul geautoclaveerd, gedestilleerd water door en neer te pipetteren.
3. Het bord van de 200 ul transformatie mengsel van elke transformatie naar een 10-cm SD-Leu-Trp-His-Ura +3 AT (3AT concentratie: 25 mm) platen met behulp van een spread bar, dus 25 geautoclaveerd 1,5 ml microcentrifugebuizen kunnen 50 platen te maken (SD-Leu-Trp-His-Ura +3 AT).
4. Incubeer de platen gedurende 5-10 dagen bij 30 ° C.
5. Worden uitgeplaat op SD-Leu-Trp plaat, om de transformatie-efficiëntie van de reactie, seriële verdunningen van een reactie (1:400 en 1:4000 01:40) te schatten. Na incubatie gedurende 3 dagen bij 30 ° C, het aantal kolonies wordt geteld en het totaal aantal berekende transformanten.

7. X-gal-test

1. Overdracht kolonies te YPD plaat; incubeer bij 30 ° C gedurende de nacht.
2. Plaats afgeronde Nitrocellulose membraan op de YPD plaat, zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen het membraan en de YPD plaat. Na 1-2 min, make ervoor dat alle kolonies worden overgebracht naar membranen (nitrocellulose papier).
3. Plaats het membraan kolonie kant naar boven in de boot gemaakt van aluminiumfolie papier.
4. Leg het membraan in vloeibare stikstof, wacht twintig seconden, en dompel in vloeibare stikstof voor een paar minuten.
5. Neem membraan te ontdooien.
6. Ondertussen mix van de volgende reagens:
   1,5 ml Z buffer
   20μl X-gal (20 mg / ml)
7. Drop Z buffer / X-gal in een petrischaaltje, plaats Whatman papier op de top van dat.
8. Plaats voorzichtig nitrocellulose papier op de top van Whatman papier.
9. Incubeer bij 37 ° tot de blauwe kolonies verschijnen.

8. Retransformation assay

Prey fusie-eiwitten (AD-Y) geïsoleerd uit de bibliotheek van screening moet behouden de interactie met aas fusie-eiwit (DB-X) om het rapport genen induceren, en de retransformation van prooi klonen en aas construct in gist kan verder uit te bannen false positives en faciliteren toe te voegennele analyse.

1. Plasmide DNA te isoleren uit giststammen mogelijk met interagerende proteïnen.
2. Transformeren DNA in E. coli DH5a-cellen, het bord van de transformaties op LB +100 ug / ml ampicilline platen om selectief te isoleren van de pPC86-cDNA bibliotheek, en 's nachts bij 37 ° C. incubeer
3. Kies een aantal kolonies van de plaat te zetten in LB +100 ug / ml ampicilline bouillon.
4. Bereid Miniprep DNA en onderzoeken door dubbele restrictie-analyse met Sal I en Not I.
5. Co-transformatie de prooi plasmide en aas plasmide in MaV203, het bord van de transformatie mengsels op SC-Leu-Trp platen, en incubeer gedurende 2-3 dagen bij 30 ° C.
6. Kies drie verschillende kolonies van de SC-Leu-Trp plaat, uitvoeren van X-gal Assay.

9. Sequencing en bioinformatica-analyse

Volgorde het plasmide DNA dat werd geïsoleerd uit waarschijnlijk echte positieve klonen, vergelijk deze sequenties met die in de GenBank het gebruik van de BLAST-programma, en identificeer die twee-hybride klonen die corresponderen met bekende genen. Sequencing gegevens bleek dat twee van de 12 positieven hierboven verkregen werden celoppervlak TNFR2 (TNFRSF1B/CD120b; toetreding # NM_130426). Daarnaast werd de interactie tussen de PGRN en TNFR geverifieerd met behulp van diverse eiwit-eiwit interacties assays, zoals in vitro vaste-fase bindingstest, Co-immunoprecipitatie, Surface Plasmon Resonance-analyse, en Flow cytometrie assay ^14.

10. Representatieve resultaten

Het stroomschema van de screening is geschetst in Fig. 3. Typisch 50-100 positieve kloon kandidaten zijn te verkrijgen op deze stap. We in eerste instantie 54 positieve kloon kandidaten geïsoleerd onder de 2,5 miljoen transformanten gescreend met de PGRN aas. Positieve kloon kandidaten werden vervolgens gecontroleerd door het uitvoeren van X-gal-test. Typisch, zijn ongeveer 50% vals positieve klonen verwijderd via X-gal-test. We kregen 23 een positieve kloon candid Ates bij deze stap voor de PGRN aas (afb. 4). Retransformation van de prooi klonen en aas te bouwen in gist verder uit te bannen false positives en klonen die nog steeds het activeren van de reporter genen waarschijnlijk de ware positieven te vertegenwoordigen. Typisch, zal ongeveer 50% positieve kloon kandidaten worden verwijderd. We hebben eindelijk geïsoleerd 12 positieve klonen die interageren met PGRN in gist.

Figuur 1. Principe van de gist twee-hybride systeem

Figuur 2. Pipeline van het identificeren van eiwit binding partners met behulp van gist twee-hybride systeem

Figuur 3. Stroomdiagram van de screening gist twee-hybride bibliotheek.rge.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een ​​full-sized versie van deze foto te bekijken.

Figuur 4. Beta-galactosidase test van positieve kloon kandidaten. A, Positieve klonen verkregen uit de bibliotheek van het scherm werden overgebracht naar YPD-plaat en geïncubeerd bij 30 ° C gedurende de nacht, B, Alle kolonies op YPD plaat werden overgebracht naar nitrocellulose membranen en beta-galactosidase test uitgevoerd.

Discussie

Gist twee-hybride screening heeft zich bewezen als een effectief middel bij het ​​identificeren van eiwit interacties ^{16, 17} worden. In vergelijking met andere benaderingen voor het identificeren van eiwit-bindende partners, zoals biochemische co-zuivering en eiwit chips, gist twee-hybride systeem is een gevoelige genetische benadering die kan worden gebruikt voor het screenen van zeer grote aantallen van de coderende sequenties in een relatief eenvoudig experiment, in Daarnaast detecteert de in vivo interact...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer
ProQuest twee-hybride systeem	Invitrogen	10835
YPD groeimedium	Clontech	630409
YPD Agar Medium	Clontech	630410
Minimale SD-agar Base	Clontech	630412
-Leu DO Supplement	Clontech	630414
-Leu/-Trp DO Supplement	Clontech	630417
-His/-Leu/-Trp/-Ura DO Supplement	Clontech	630425
3-Amino-1 ,2,4-triazool (3AT)	Sigma-Aldrich	A8056
Luria-bouillon (LB)	Sigma-Aldrich	L3022
X-Gal	Invitrogen	15520-034
Gesoniceerd zalmsperma DNA	Stratagene	201190
Ampicilline	AMRESCO	0339
Kanamycine Sulfaat	Invitrogen	11815-024
Subkloning Efficiency ™ ™ DH5a competente cellen	Invitrogen	18265-017
Trizma ® bodem	Sigma-Aldrich	T6066
Lithium-acetaat	Sigma-Aldrich	L4158
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	Sigma-Aldrich	ED
Nitrocellulose membraan	Bio-Rad	162-0115
10-cm petrischaal	ITI Wetenschappelijke	CT-903
Incubator (30 ° C)	ATR (Ecotron)