Methodenartikel

Het meten van Peptide Translocatie in grote unilamellaire Blaasjes

13.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3571

⸱

27 januari 2012

 ,  , 
1Department of Chemistry, Wellesley College

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol details een methode voor de kwantitatieve meting van peptide translocatie in grote unilamellaire lipide blaasjes. Deze methode biedt ook informatie over de snelheid van de membraan translocatie en kan worden gebruikt om peptiden die efficiënt en spontaan kruisen lipidendubbellagen te identificeren.

Samenvatting

Er is een actieve interesse in peptiden die gemakkelijk celmembranen passeren zonder de hulp van celmembraan receptoren 1. Veel van deze worden aangeduid als cel-penetrerende peptiden, die vaak bekend om hun potentieel als drug delivery vectoren 1-3. Bovendien is er toenemende belangstelling voor antimicrobiële peptiden die werken via niet-membraan lytische mechanismen 4,5, in het bijzonder degenen die bacteriële membranen kan passeren zonder dat de cel-lysis en doden cellen door te interfereren met intracellulaire processen 6,7. In feite hebben de auteurs in toenemende mate gewezen op de relatie tussen de cel-penetrerende en antimicrobiële peptiden 1,8. Een goed begrip van het proces van het membraan translocatie en de relatie tussen peptide structuur en zijn vermogen om transloceren moeten doeltreffend, reproduceerbare assays voor translocatie. Verschillende groepen hebben voorgesteld methoden om translokatie meten in grote unilamellar lipide bolletjes (LUVS) 9-13. LUVS dienen als nuttige modellen voor bacteriële en eukaryote cel membranen en worden vaak gebruikt in TL-peptide studies 14,15. Hier beschrijven we onze toepassing van de methode voor het eerst ontwikkeld door Matsuzaki en collega's op antimicrobiële peptiden, zoals magainin en buforin II 16,17 overwegen. Naast het leveren van ons protocol voor deze methode, presenteren we ook een directe benadering van de data-analyse die translocatie kunnen het gebruik van deze assay kwantificeert. De voordelen van deze translocatie test in vergelijking met anderen, dat het de potentie om informatie over de snelheid van de membraan translocatie te bieden en vereist niet dat de toevoeging van een fluorescent label, dat kan veranderen peptide eigenschappen 18, aan tryptofaan-bevattende peptiden is. In het kort wordt translocatie mogelijkheid in lipide vesicles gemeten als functie van de Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen autochtone tryptofaan residu's en dansyl fosfatidylethanolamine als eiwitten worden geassocieerd met de externe LUV membraan (figuur 1). Cel-penetrerende peptiden worden gesplitst als ze tegenkomen ongeremd trypsine ingekapseld met de LUVS, wat leidt tot distantiëring van de LUV membraan en een daling van de FRET signaal. De daling van de FRET signaal waargenomen voor een transloceren peptide is aanzienlijk hoger dan die waargenomen voor dezelfde peptide wanneer de LUVS zowel trypsine en trypsine-remmer, of wanneer een peptide dat niet spontaan kruis lipidemembranen is blootgesteld aan trypsine-bevattende LUVS bevatten. Deze verandering in fluorescentie biedt een directe kwantificering van peptide translocatie in de tijd.

Protocol

1. De voorbereiding van grote unilamellaire lipide bolletjes (LUVS)

  1. Bereid LUVS om te dienen als celmembraan nabootst voor de test 19.
  2. Mix fosfatidylcholine (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl fosfatidylethanolamine (DNS-PAUS, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipiden), opgelost in chloroform in een 50 : 45:5-ratio. Zoals elke test vereist de aparte voorbereiding van zowel de experimentele en controle LUVS, moeten twee lipide cake flacons worden voorbereid. 0,376 mg van het totaal lipide (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, en 0,019 mg DNS-PAUS) is meestal voldoende om genoeg blaasjes te maken voor een translocatie proces.
  3. Verdampen chloroform met behulp van een N-2 gasstroom.
  4. Droog de lipide taart 9-14 uur in een vacuüm exsiccator.
  5. Maak een voorraad 10 mM HEPES bufferoplossing (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES buffer is stOR gecombineerd bij 4 ° C.
  6. Bereid een voorraad oplossing van 0,4 mM varkens trypsine (23,3 kg / mol) in 10 mM HEPES buffer boven voorbereid. Trypsine wordt bewaard bij -20 ° C en in onze praktijk, meestal niet meer dan 2 vries-dooi cycli ondergaan voor gebruik.
  7. Bereid een voorraad oplossing van 4,0 mM Bowman-Birk trypsine-remmer (8 kg / mol) in 10 mM HEPES bufferoplossing en bewaar bij -20 ° C. In ons gebruik, is deze voorraad aangevuld maandelijkse en meestal niet ondergaat meer dan drie vries / dooi cycli voordat het weer gemaakt.
  8. Reconstitueer experimentele multilamellaire blaasjes (MLV's) in een 0,2 mM trypsine-oplossing door het toevoegen van een gelijk volume van 0,4 mM trypsine voorraad en 10 mM HEPES bufferoplossing om de gedroogde lipide taart. Voor een enkele steekproef van 0.376 mg totale lipide, een mengsel van 150 pi van trypsine-oplossing en 150 ul HEPES buffer is voldoende.
  9. Reconstrueren controle MLVs in een oplossing met 0,2 mM trypsine en 2,0 mM Bowman-Birk trypsine-remmer door het toevoegen van een gelijk volume van 0.4 mM trypsine voorraad en 4,0 mM trypsine-remmer om de gedroogde lipide cakes. Voor een enkele steekproef van 0.376 mg totale lipide, een mengsel van 150 pi van trypsine-oplossing en 150 pi van trypsine-remmer is voldoende.
  10. Transfer MLV oplossingen van glazen flesjes tot 1,7 ml microcentrifugebuis.
  11. Onder voorbehoud van MLV oplossingen voor 5 vries / dooi cycli in vloeibare stikstof.
  12. Bereid lipide extruder (Avanti Polar lipiden) door het plaatsen van twee filter ondersteunt bevochtigd in HEPES buffer op elk Teflon extruder stuk. Plaats een nuclepore circuit geëtst membraan met 0,1 um poriën (Whatman, Verenigd Koninkrijk) in tussen de twee Teflon extruder stukken, en leg de stukken in de extruder extruder metalen bus. Plaats de donut spacer over de twee extruder stukken voor het aandraaien van de metal top van de extruder bus en te plaatsen in de houder.
  13. Vul de leegte volume binnen de extruder met 500 pL 10 mM HEPES buffer met behulp van een 250 ui glazen injectiespuit om het verlies van vesicles monster te voorkomen.
  14. Laad elk MLV monster in de extruder en duw het monster door het membraan op zijn minst 21 keer om een ​​uniforme unilamellaire blaasjes grootte te verzekeren. LUVS worden verkregen uit de MLV oplossing na extrusie.
  15. Bewaar LUVS bij 4 ° C en gebruik binnen 48 uur.

2. Kwantificering van LUV Concentratie

  1. LUV concentratie werd gekwantificeerd door het bepalen van het totale fosforgehalte in het monster 20.
  2. Bereid 8.9 NH 2 SO 4 in nanopure water en bewaar bij kamertemperatuur.
  3. Bereid een 2,5% w / v ammoniummolybdaat VI (588,04 g / mol) oplossing in nanopure water. Bereid een 10% w / v ascorbinezuur (176,1 g / mol) oplossing in nanopure water. Bescherm de ascorbinezuuroplossing van blootstelling aan licht door het bedekken van de buis met folie. Bewaar beide oplossingen bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden.
  4. Bereid 0,65 mM fosfaatbuffer-oplossing (monobasisch watervrij natriumfosfaat, 120 g / mol).
  5. Bereid zes standaard tubes. Normen moeten bevatten 0,0 pL, 50 pL (0,0325 μmoles), 100 pi (0.065 μmoles), 175 pi (0.114 μmoles), 250 pi (0.163 μmoles), of 350 pL (0.228 μmoles) van fosfor oplossing.
  6. Bereid LUV monsterbuizen in drievoud. Elk monster tube moet bevatten ongeveer 0,1 μmoles van LUVS. Experimentele en controle LUV concentraties moeten afzonderlijk worden gemeten.
  7. Om te corrigeren voor eventuele gedroogde fosfor zouten in de Bowman-Birk-remmer poeder, een controle LUV leeg moet worden voorbereid. Het blanco moet bevatten hetzelfde volume van de 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk remmer oplossing werd geplaatst in de controle LUV monsterbuis.
  8. Plaats 450 pi van 8,9 NH 2 SO 4 in elk van de steekproef, standaard en blanco buizen.
  9. Warmte monsters, normen en blanks gedurende 25 minuten bij 175-210 ° C in een oven.
  10. Verwijder alle buizen en laat ze afkoelen. Voeg 150 ul van 30% H 2 O 2 aan elk van de tubes.
  11. Warmte monsters, normen en blanks gedurende 30 minuten bij 175-210 ° C.
  12. Verwijder de monsters, standaarden en blanks van het vuur. Als een van de oplossingen zijn nog niet kleurloos, voeg 50 uL H 2 O 2 om alle buizen en warmte voor een extra 15 minuten op 175-210 ° C.
  13. Voeg 3,9 mL nanopure H 2 O, 0,5 ml ammoniummolybdaat-oplossing en 0,5 ml ascorbinezuur oplossing voor elke buis.
  14. Warmte alle buizen voor 5-7 minuten in een bad met kokend water.
  15. Meet de absorptie van elke standaard en monster bij 820 nm met behulp van een Agilent 8453 UV-zichtbaar spectrofotometer. De buis met 0,0 mmol fosfor gebruikt moet worden als de blanco kaart voor alle normen en experimentele LUV monsters. De buis met de 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk-remmer oplossing dient te worden gebruikt als de blanco kaart voor de controle LUV monster.
  16. Een lineaire absorptie vs fosforgehalte standaard curve kan worden geproduceerd en gebruikt om de totale phosph te berekenenOrus inhoud en LUV concentratie van de monsters.

3. Voorbereiden Peptide Solutions

  1. Los peptide in nanopure H 2 O. Peptiden die in deze test, zoals beschreven moet bevatten een tryptofaan residu.
  2. Meet de extinctie van de peptide-oplossing bij 282 nm in drievoud. Bereken peptide concentratie met behulp van de molaire extinctiecoëfficiënt voor tryptofaan van 5700 M -1 cm -1.
  3. Verdunnen peptide in nanopure water tot een uiteindelijke concentratie van 30 uM. Bewaren bij -20 ° C

4. Translocatie Kwantificering

  1. Bereid experimentele en controle monsters in 1,7 ml microcentrifugebuizen. Voeg genoeg LUVS aan elke oplossing voor een uiteindelijke concentratie van 250 uM. Voeg genoeg Bowman-Birk inhibitor oplossing, zodat remmer is een uiteindelijke concentratie 10x groter is dan het trypsine concentratie. Voeg genoeg 10 mM HEPES buffer om de uiteindelijke oplossing volume tot 450 ul te brengen.
  2. Plaats 50 uL peptide-oplossing in een Starna micro quartz fluorometer cel. De verhouding tussen LUVS en peptide is hoog genoeg om ervoor te zorgen dat vrijwel alle intact peptiden zijn in dicht genoeg nabijheid van een dansyl deze groep een FRET signaal, zelfs als niemand heeft translocatie in het blaasje. Dit komt overeen met de vergelijkbare FRET waargenomen in control voorwaarden voor peptiden die wel en niet verplaatsen in de blaasjes.
  3. Voeg de experimentele of controle monster van de peptide-oplossing in de cuvet. Dit moet de uiterste peptide concentratie 3 uM.
  4. Begin een 25 minuten tl-kinetiek experiment onmiddellijk na toevoeging van de experimentele of controle LUV oplossing, het nemen van een fluorescentie het lezen van ten minste een keer per seconde. Stel de excitatie golflengte bij 280 nm, de emissie golflengte bij 525 nm, en de temperatuur tot 25 ° C. Met behulp van een Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, zetten we de PMT gevoeligheid hoog is.

5. Het genereren van een Kwantitatieve Translocatie Ratio

  1. Definieer de eerste fluorescentie (F o) als de fluorescentie te lezen na vijftien seconden van het verzamelen van gegevens. In ons instrument opstelling, hebben we ontdekt dat de eerste vijftien seconden van de verzamelde fluorescentie gegevens onbetrouwbaar zijn te wijten aan het mengen van, het sluiten van de monsterkamer, en andere storingen in het systeem op monster toevoeging. Verdeel elke volgende lezing door F o om de relatieve fluorescentie (F / F 0) te verkrijgen op elk tijdstip.
  2. Gemiddelde alle relatieve fluorescentie metingen van de laatste minuut van het experiment tot een definitieve gemiddelde relatieve fluorescentie te verkrijgen figure-protocol-1 .
  3. Verdeel de figure-protocol-2 voor controle monsters door de figure-protocol-3 voor experimentele monsters om een ​​gecorrigeerde fluorescentie uiteindelijke waarde te verkrijgen.
le "> 6. representatieve resultaten

Figuur 2 toont de resultaten van deze test voor een representatieve peptide dat robuuste translocatie zien. Het signaal in dit experiment (zwart trace) toont een duidelijke daling van de FRET-signaal in de tijd. Het is echter belangrijk om te controleren voor het mogelijke verlies van de FRET signaal als gevolg van onvolledige trypsine remming of andere factoren die niets van translocatie vermogen. Daartoe hebben we ook altijd meten van de FRET signaal tussen peptide en LUVS die zowel trypsine en Bowman-Birk trypsine-remmer (grijs trace, figuur 2). In onze handen, is het belangrijk om deze controle uit te voeren voor elk peptide elke keer dat een experiment wordt uitgevoerd. Dit stelt ons in staat om duidelijk te corrigeren voor eventuele veranderingen in het signaal te wijten aan de verschillen tussen de lipide bolletjes preparaten of instrument geluid, die aanzienlijk kunnen zijn voor de relatief zwakke tl-signalen meestal waargenomen bij deze concentraties.

Het belang van de controle ervariment met behulp van LUVS met trypsine-remmer wordt gemarkeerd door de gegevens in figuur 3. In dit geval is de peptide signaal af een vergelijkbaar bedrag met die in figuur 2 in de experimentele steekproef (zwart trace). Echter, de te controleren steekproef een snellere daling voor dit peptide shows, zodat de netto-translocatie is lager.

Deel 5 van ons protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het kwantificeren van translocatie van dit experiment. Hogere translocatie ratio's zijn een indicatie van peptiden die efficiënt verplaatsen; de translocatie-ratio voor de cel indringende peptide weergegeven in figuur 2 is 1,16, terwijl de zwak transloceren peptiden hebben translocatie verhouding dichter bij 1. In onze ervaring, de standaardfout voor drie onafhankelijke experimenten uitgevoerd met verschillende blaasje de voorbereidingen in het bereik van 0,01 tot 0,06.

figure-protocol-4
Figuur 1. Schema van translocation-test. Experimentele LUV monsters (A) zijn gedoteerd met fluorescerende dansyl PAUS (zwarte balken) en ingekapseld trypsine (schaar) bevatten. Trypsine-remmer (rode cirkel) wordt gebruikt om trypsine remmen buiten het LUVS. De LUVS worden blootgesteld aan peptide (paars). Peptide associatie met LUV membranen levert een FRET signaal (groen), die afneemt naarmate translocting peptiden ontmoeting onbevangen interne trypsine. Zowel de trypsine en trypsine-remmer zijn ingekapseld in control LUV monsters (B) daalt meten in FRET signaal niets met translocatie.

figure-protocol-5
Figuur 2. Representatieve gegevens voor een cel-penetrerende peptide. Een vertegenwoordiger transloceren antimicrobiële pepide toont een significante daling van de FRET-signaal in vergelijking met de controle.

figure-protocol-6
Figuur3. Representatieve gegevens benadrukken het belang van de controle. Onvolledige remming van de tryptische vertering van een niet-transloceren peptide leidt tot een daling in het FRET signaal na verloop van tijd in zowel de experimentele en controle LUV-oplossingen. Omdat het verschil tussen de controle en experimentele sporen is relatief klein is, wordt deze mutant gekarakteriseerd als een zwak transloceren peptide.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol hier gepresenteerde kan worden gebruikt om de relatieve verandering in de concentratie van peptiden binnen en buiten van lipide vesicles te beoordelen. Deze veranderingen hebben betrekking op translocatie vermogen. Dit protocol kan worden gebruikt om cel-penetrerende peptiden te identificeren met potentieel als drug delivery vectoren. Naarmate de belangstelling in cel-penetrerende peptiden groeit, zal het interessant om te zien hoe methoden die rechtstreeks de translocatie evenement worden ontwikkeld en geb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Eleanor Fleming en Jessica Chen bedanken voor nuttige discussies. De financiering werd verstrekt door de Nationale Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIH-NIAID) Award R15AI079685 en een Research Corporation Cottrell College Science Award. Extra student ondersteuning werd geleverd door de Howard Hughes Medical Institute en de Staley fonds.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Naam van het reagens Vennootschap Catalogus nummer
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipiden 840457C
01:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipiden 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipiden 850457C
Porcine trypsine Sigma T-0303
Bowman-Birk trypsine / chymotrypsine-remmer Sigma T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipiden 610000
Ammoniummolybdaat (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbinezuur Sigma A1417
Waterstofperoxide, 30%-oplossing Mallinckrodt chemicaliën 5240-05
HEPES Sigma H-3375
NaCl Sigma S-9625
EDTA Sigma E5134
NaH 2 PO 4 Sigma S-0751

Referenties

  1. Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399 (1), 1-1 (2006).
  2. Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58 (2), 209-209 (2004).
  3. Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9 (23), 1012-1012 (2004).
  4. Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5 (6), 951-951 (2007).
  5. Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276 (22), 6464-6464 (2009).
  6. Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61 (7), 2978-2978 (1993).
  7. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244 (1), 253-253 (1998).
  8. Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17 (5), 335-335 (2011).
  9. Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. , (2011).
  10. Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345 (2), 387-387 (2005).
  11. Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89 (4), 2513-2513 (2005).
  12. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44 (30), 10189-10189 (2005).
  13. Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (7), 1523-1523 (2009).
  14. Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285 (2), 235-235 (2000).
  15. Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
  16. Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39 (29), 8648-8648 (2000).
  17. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34 (19), 6521-6521 (1995).
  18. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579 (20), 4498-4498 (2005).
  19. Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. , Oxford University Press. New York. (2003).
  20. Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686 (34), 8083-8083 (2009).
  21. Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15610 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fluorescentie resonantie energietransfertryptofaanbevattende peptidentrypsineverteringsassaybereiding van lipidevesikelsmembraannaboonsmodelfluorescentiekinetiekexperimentfosforgehalteanalysecelpenetrerende peptiden

Gerelateerde artikelen