Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Ons doel is het verkrijgen van een uitgebreide beschrijving van moleculaire processen die zich op cellulaire membranen in verschillende biologische functies. Wij richten ons op het karakteriseren van de complexe organisatie en de dynamiek van het plasmamembraan bij single-molecule-niveau, door het ontwikkelen van analytische tools gewijd aan Single-Particle Tracking (SPT) bij hoge dichtheid: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Single-molecule videomicroscopy, het aanbieden van milliseconde en nanometrische resolutie 1-11, laat een gedetailleerde weergave van membraan organisatie 12-14 door nauwkeurig in kaart brengen van omschrijvingen zoals mobiele receptoren lokalisatie, mobiliteit, opsluiting of interacties.
We herzien SPT, zowel experimenteel als algoritmisch. Experimentele aspecten omvatte het optimaliseren van installatie-en cel etikettering, met een bijzondere nadruk op het bereiken van de hoogst mogelijke etikettering dichtheid, met het oog op een dynamische momentopname van moleculaire dynamica a. het verstrekken vans het plaatsvindt binnen het membraan. Algoritmische problemen betrokken elke stap wordt gebruikt voor de wederopbouw van trajecten: pieken detectie, schatting en opnieuw verbinden, aangepakt door specifieke tools van beeldanalyse 15,16. Uitvoering van deflatie na detectie kan redden van pieken in eerste instantie verborgen door naburige, sterkere pieken. Van de nota, het verbeteren van detectie direct invloed op heraansluiting, door vermindering van de lacunes binnen de trajecten. Optredens zijn onderzocht met behulp van Monte-Carlo simulaties voor verschillende etikettering dichtheid en geruisloosheid, die doorgaans de twee belangrijkste beperkingen voor parallelle metingen bij hoge spatio-temporele resolutie.
De nanometrische nauwkeurigheid 17 verkregen voor enkele moleculen, met behulp van opeenvolgende aan / uit photoswitching of niet-lineaire optica, kan leveren uitputtend waarnemingen. Dit is de basis van nanoscopy methoden 17 zoals STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 of STED 22,23, whilel kan vaak beeldvorming gefixeerde monsters. De centrale taak is het opsporen en de schatting van diffractie-beperkte pieken afkomstig van enkele moleculen. Vandaar dat het verstrekken van adequate veronderstellingen, zoals het hanteren van een constante positionele nauwkeurigheid in plaats van de Brownse beweging, wordt MTT ronduit geschikt voor nanoscopische analyses. Bovendien kan MTT fundamenteel worden gebruikt op elke schaal: niet alleen moleculen, maar ook voor cellen of dieren, bijvoorbeeld. Vandaar dat MTT is een krachtige tracking algorithme, dat toepassing vindt op moleculair en cellulair schalen.
Protocol
In deze video presenteren wij een volledige Single Particle Tracking experiment, met behulp van quantum-dots gericht op een specifieke membraan receptor. Het belangrijkste doel van dit experiment bestaat bij het onderscheiden van verschillende soorten moleculaire diffusie gedrag gemeten binnen de plasmamembraan van levende cellen. Inderdaad, moleculaire bewegingen die zich voordoen in het membraan meestal afwijken van Brownse diffusie door te worden lineair gericht of beperkt binnen nanodomains 26-29, bijvoorbeeld. Wij streven naar gelijktijdig na zo veel receptoren als technisch mogelijk is, een momentopname van de variëteit die in de dynamiek die zich in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In enkele deeltjes volgen, naast de cel en microscopie aspecten de analyse een aanzienlijk deel van het werk. Dit heeft betrekking op het algoritme gebruikt om de drie belangrijkste taken uit te voeren: het opsporen, schatten en opnieuw aansluiten van toppen boven elk frame. Maar de daaruit voortvloeiende aspect van dit werk ligt in de uitwerking van het algoritme zelf, die dienen te worden aangepast voor een nieuw speciaal onderzoek, hoofdzakelijk voor de laatste, extra stappen (zoals het ontcijferen van vormen van bew.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van ons team, met name MC Blache voor technische bijstand, maar ook M Irla en B Imhof, voor hun steun en vruchtbare discussies. De cijfers voor deflatie en opsluiting gereproduceerd met toestemming van Nature Methods. Dit project wordt ondersteund door institutionele subsidies van de CNRS, INSERM en Marseille University, en door specifieke subsidies van de regio Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 Blan 1214 01) & Fondation pour la Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wordt ondersteund door een beurs van de Ligue Nationale Contre le Cancer.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Hoeveelheid |
| Cos-7 cellijn | ATCC | CRL-1651 | 5.000 cellen / well |
| HBSS zonder Ca2 + | GIBCO | 14175 | 1 ml |
| 0,05% Trypsine EDTA | GIBCO | 25300 | 1 ml |
| 8-en Lab-tek | NUNC | 155441 | 1 |
| Qdot-605 streptavidine | Invitrogen | Q10101MP | 20 mM |
| Gebiotinyleerd Fab (voor Fab synthese, zie referentie 21) | |||
| Fab van mAb 108 | ATCC | HB-9764 | 200 ug |
| NHS-biotine | Thermo Scientific | 21435 | 18,5 microgram |
| Compleet medium | |||
| DMEM | GIBCO | 41965 | 500 ml |
| Foetaal runderserum | SIGMA | F7524 | 50 ml |
| L-Glutamine | GIBCO | 25030 | 5 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 5 ml |
| Natriumpyruvaat | GIBCO | 11360 | 5 ml |
| Imaging medium | |||
| HBSS met Ca2 + | GIBCO | 14025 | 25 ml |
| HEPES | GIBCO | 15630 | 250 pi |
Bijlage: voorbeeld script van MTT aanvullende analyse
functie MTT_example (bestandsnaam)
%%% Basic voorbeelden waaruit blijkt hoe de MTT-uitgang resultaten te herstellen
%%% Elk trac uitzettene en het histogram bouwen
%%% Van fluorescentie-intensiteiten
Als nargin <1% geen bestandsnaam voorzien?
files = dir ('* stk.');
Als IsEmpty (bestanden), disp ('geen gegevens in de huidige dir'), rendement, eind
. bestandsnaam = bestanden (1) naam;% Standaard: in de eerste stk bestand
disp (['met behulp van' bestandsnaam 'standaard'])
einde
file_param = [bestandsnaam '_tab_param.dat'];% output file
%% Load data
cd (output23)% of (output22) volgens versie gebruikt
% Disclaimer: versie 2.2 genereert slechts 7 parameters,
% Een extra parameter, geluid, werd toegevoegd in versie 2.3
% Om alle parameters te lezen in een keer, in een enkele tabel
% Tab_param = fread_all_param (file_param);
% Tab_i = tab_param (2:8: eind, :); tab_j = ...
% Om alle parameters (behalve frame_number) te lezen in afzonderlijke tabellen
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);
tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);%-index is 3 omdat trace nummer en framenummer, niet informatief, worden verwijderd!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);
%% Lus over sporen
N_traces = grootte (tab_i, 1);
% Tabellen zijn N_traces lijnen door N_frames kolommen
voor itrc = 1: N_traces
No_blk_index = tab_blk (itrc, :)> 0;% niet knipperen stappen alleen
plot (tab_i (itrc, No_blk_index), tab_j (itrc, No_blk_index))
& Nbsp; xlabel ('i (pixel)'), ylabel ('j (pixel)')
titel (['spoor #' num2str (itrc)])
disp ('Gelieve te slaan op een willekeurige toets voor de volgende trace'), pauze
einde
%% Fluo histogram
N_datapoints = som (tab_blk (:)> 0);% niet knipperen stappen alleen
gesch (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% met behulp van 2sqrt (N) bakken
xlabel ('intensiteit (AU)'), ylabel ('voorkomen')
titel ('histogram van deeltjes fluorescentie-intensiteit')
Referenties
- Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
- Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusio....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
