Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)

16.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/3599

⸱

27 mei 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, UMR 631, Parc scientifique de Luminy, 2Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6102, Parc scientifique de Luminy, 3Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, Aix-Marseille University, 4École Centrale Marseille, Technopôle de Château-Gombert, 5Institut Fresnel, Aix-Marseille University, 6Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 6133, Aix-Marseille University

In dit artikel

Samenvatting

Multiple-Target Tracing is een zelfgemaakte algoritme dat is ontwikkeld voor het bijhouden van individueel gelabelde moleculen in het plasmamembraan van levende cellen. Efficiënt opsporen, schatten en het opsporen van moleculen loop van de tijd bij hoge dichtheid zorgen voor een gebruiksvriendelijke, uitgebreide tool om nanoschaal membraan dynamiek te onderzoeken.

Samenvatting

Ons doel is het verkrijgen van een uitgebreide beschrijving van moleculaire processen die zich op cellulaire membranen in verschillende biologische functies. Wij richten ons op het karakteriseren van de complexe organisatie en de dynamiek van het plasmamembraan bij single-molecule-niveau, door het ontwikkelen van analytische tools gewijd aan Single-Particle Tracking (SPT) bij hoge dichtheid: Multiple-Target Tracing (MTT) 1. Single-molecule videomicroscopy, het aanbieden van milliseconde en nanometrische resolutie 1-11, laat een gedetailleerde weergave van membraan organisatie 12-14 door nauwkeurig in kaart brengen van omschrijvingen zoals mobiele receptoren lokalisatie, mobiliteit, opsluiting of interacties.

We herzien SPT, zowel experimenteel als algoritmisch. Experimentele aspecten omvatte het optimaliseren van installatie-en cel etikettering, met een bijzondere nadruk op het bereiken van de hoogst mogelijke etikettering dichtheid, met het oog op een dynamische momentopname van moleculaire dynamica a. het verstrekken vans het plaatsvindt binnen het membraan. Algoritmische problemen betrokken elke stap wordt gebruikt voor de wederopbouw van trajecten: pieken detectie, schatting en opnieuw verbinden, aangepakt door specifieke tools van beeldanalyse 15,16. Uitvoering van deflatie na detectie kan redden van pieken in eerste instantie verborgen door naburige, sterkere pieken. Van de nota, het verbeteren van detectie direct invloed op heraansluiting, door vermindering van de lacunes binnen de trajecten. Optredens zijn onderzocht met behulp van Monte-Carlo simulaties voor verschillende etikettering dichtheid en geruisloosheid, die doorgaans de twee belangrijkste beperkingen voor parallelle metingen bij hoge spatio-temporele resolutie.

De nanometrische nauwkeurigheid 17 verkregen voor enkele moleculen, met behulp van opeenvolgende aan / uit photoswitching of niet-lineaire optica, kan leveren uitputtend waarnemingen. Dit is de basis van nanoscopy methoden 17 zoals STORM 18, PALM 19,20, RESOLFT 21 of STED 22,23, whilel kan vaak beeldvorming gefixeerde monsters. De centrale taak is het opsporen en de schatting van diffractie-beperkte pieken afkomstig van enkele moleculen. Vandaar dat het verstrekken van adequate veronderstellingen, zoals het hanteren van een constante positionele nauwkeurigheid in plaats van de Brownse beweging, wordt MTT ronduit geschikt voor nanoscopische analyses. Bovendien kan MTT fundamenteel worden gebruikt op elke schaal: niet alleen moleculen, maar ook voor cellen of dieren, bijvoorbeeld. Vandaar dat MTT is een krachtige tracking algorithme, dat toepassing vindt op moleculair en cellulair schalen.

Protocol

In deze video presenteren wij een volledige Single Particle Tracking experiment, met behulp van quantum-dots gericht op een specifieke membraan receptor. Het belangrijkste doel van dit experiment bestaat bij het onderscheiden van verschillende soorten moleculaire diffusie gedrag gemeten binnen de plasmamembraan van levende cellen. Inderdaad, moleculaire bewegingen die zich voordoen in het membraan meestal afwijken van Brownse diffusie door te worden lineair gericht of beperkt binnen nanodomains 26-29, bijvoorbeeld. Wij streven naar gelijktijdig na zo veel receptoren als technisch mogelijk is, een momentopname van de variëteit die in de dynamiek die zich in de membraan van een levende cel te geven. Dit zal uiteindelijk om ontcijferen van de mechanismen reguleren celoppervlaktereceptor signalering.

1. Cel Cultuur

  1. Bereid de mobiele monster: gebruik aanhanger COS-7 cellen die endogeen drukken de epidermale groeifactor receptor (EGFR) 30. Wanneerhet werken met levende cellen zonder antibiotica zorg ervoor dat er geen latente sub-detecteerbaar besmetting door gebruik te maken de juiste steriele technieken te allen tijde tijdens de bereiding.
  2. Groei cellen in compleet medium (DMEM met 10% kalfserum, 1% glutamine, 1% HEPES en 1% natriumpyruvaat, zie tabel specifieke reagentia hieronder), bij 37 ° C met 7% CO2 zorg te hebben in sub-confluent, exponentiële groei vóór het uitrijden ze in Lab-Tek.
  3. Op de dag voor het experiment, gespreid 5.000 cellen / putje in 8-zowel kamers (Lab-Tek) en incubeer overnacht. Het tellen van cellen zorgt voor een constante celdichtheid, dus een reproduceerbare verhouding van quantum-dots per cel.

2. Cell Labeling

Bereid quantum-dots met een specifieke coating. Quantum-dots zijn fluorescerende nanodeeltjes bestaan ​​uit halfgeleiders. Deze nanodeeltjes zijn van groot belang omdat ze erg licht en fotostabiel in vergelijking met klassiekefluorescerende probes 31,32, die het bereiken van een geschikt signaal maakt het mogelijk om ruis verhouding (SNR) voor single molecule imaging.

  1. Voor het experiment produceren Fab fragmenten tegen EGFR van hybridoma cellijn (mAb 108 ATCC HB-9764), door digestie met papaïne als eerder beschreven 21.
  2. Conjugaat Fab met biotine, volgens de instructies van de fabrikant (EZ-link sulfo-NHS-LC-biotinylatie Kit; Thermo Scientific, fig. 1A.).
  3. Gebruik quantum-dots gefunctionaliseerd met streptavidine (Invitrogen) en die uitzendt bij 605 nm (optimale emissie golflengte glans, detectie en scheiding van cellulaire autofluorescentie).
  4. Bereid de labelingoplossing in compleet medium (zie tabel specifieke reagentia), teneinde de streptavidins aanwezig rond de quantum-dots, alsmede aggregatie en niet-specifieke binding aan de cellen en het dekglaasje te voorkomen verzadigen.
  5. Bereid twee tussenoplossingen:een met quantum-dots-streptavidine en een andere met gebiotinyleerd Fab, elk met 20 Nm.
  6. Meng een gelijk volume van deze twee oplossingen gemengd de quantum-stippen Fab in een 1:1 verhouding tot een uiteindelijke concentratie van 10 werkende nM Fab verkrijgen: quantum-dots complex. Met behulp van een equimolaire verhouding gunstig is voor de vorming van mono-gefunctionaliseerde complexen, bestaande uit een quantum-dot en een gebiotinyleerd Fab-fragment. Dit bevordert monovalente etikettering, het beperken van artefact waarnemingen te wijten aan receptor verknoping 33,34.
  7. Incubeer gedurende 15 minuten bij 25 ° C met een schudder bij 1200 omwentelingen per minuut om aggregatie te voorkomen. De mix is ​​dan klaar voor gebruik op levende cellen.
  8. Incubeer cellen in 100 pi van het mengsel gedurende 5 minuten bij 37 ° C met 7% CO2.
  9. Was cellen niet-autofluorescente beeldvormende medium (HBSS buffer, 1% HEPES, zie tabel specifieke reagentia) voorverwarmd bij 37 ° C.
  10. Verwijder voorzichtig het overtollige van de labels van de VN te voorkomennodig bederven de SNR van ongebonden, onscherp quantum-dots, door uitgebreid te wassen elke well met beeldvorming medium, meestal 5 keer bij kamertemperatuur, met minstens 5 minuten vertraging voor de laatste wasbeurt.

3. Optische Setup

De video-microscopie setup bestaat uit vier grote delen:

  1. Een omgekeerde microscoop met een specifieke fluorescentie kubus (FF01-457/50 excitatie, FF495-DI02 dichroïde en FF01-617/73 emissie filters, Semrock) en een hoge numerieke apertuur (1.3 of 1.49) olie-immersie 100x objectief.
  2. Een 100 W kwiklamp (gekoppeld aan de microscoop via een optische vezel, het vermijden van interferentie met thermoregulatie).
  3. Een 512 x 512 pixels hoge gevoeligheid EMCCD camera aan op een voldoende SNR te bereiken.
  4. Een incubator biologische monsters te houden op 37 ° C tijdens het experiment.

4. Acquisitie

  1. Selecteer geïsoleerd en goed gespreide cellen. Dezeis voorstander van de uitbreiding van de mooie, platte lamellipodia, best aangepast om te zoeken naar vlakke beweging van membraanmoleculen.
  2. Evalueer de cellulaire fysiologische status door zijn verschijning, zowel in doorvallend licht en fluorescentie: intens vesiculaire verkeer, het ontbreken van necrotische of apoptotische tekenen, lage autofluorescentie, en de gemiddelde man sterke quantum-dot etikettering (meestal tot 1.000 quantum-dots per cel, zie Fig. 1B, C).
  3. Selecteer een hoge etikettering dichtheid, die van cruciaal belang voor het gelijktijdig de controle zo veel receptoren mogelijk te maken. Dit is in feite beperkt, zowel door fysiologische (oppervlakte-expressie, epitoop toegankelijkheid, zijdelingse beweging) en algoritmische parameters (niet-overlappende point-spread functies (PSV), zelfs rekening houdend met vervaging als gevolg van beweging, om een ​​goede detectie en heraansluiting mogelijk te maken).
  4. Voor elke cel in de eerste verwerven van een helderveld veld beeld (bij voorkeur met behulp van DIC, indien beschikbaar), dat verder kan laten controleren op de cel aspecten ruimtelijke grenzen van de lamellipodia.
  5. Sla deze afbeelding met dezelfde naam als de video-stack (zoals cell1.tif & cell1.stk bijvoorbeeld), in een sub-map met de naam DIC, want met deze verdragen, kan het algoritme automatisch terug te vinden van de passende afbeelding voor elke stapel.
  6. Verwerven van 1 tot 3 video's per cel, continu, meestal op 36-ms tarief, de hoogste snelheid haalbaar is in full frame met deze camera. Echter kan verkrijgen bij hogere frequenties tot 1 ms geval gebruik van speciale CCD met verhoogde gevoeligheid en / of minder pixels. Het frame-transfer technologie biedt te verwaarlozen vertraging tussen frames.
  7. Electron meervoudig verbetering dient altijd op maximum (net onder verzadiging, indien nodig) om bereiken enkel molecuul gevoeligheid met een voldoende SNR ten minste meer dan 20 dB (een efficiënte piekdetectie 1), gewoonlijk ongeveer 25-30 dB.
  8. Typisch verwerven 300 frames per video, zondece trajecten worden gereconstrueerd meer dan ~ 100 frames gemiddeld, vooral beperkt door lange knipperen gebeurtenissen. Video frequentie en lengte kunnen worden aangepast voor een bepaalde handeling, waardoor een langere sporen bijvoorbeeld.

5. MTT Analyse

  1. Selecteer het pad naar de directory met de video-bestanden naar een bepaalde dataset met Matlab of Octave te evalueren.
  2. Om de volledig geautomatiseerd analyse 1,35 te starten, typ het commando detect_reconnex23 in Octave, of MTT23i in Matlab. Dit programma staat voor "versie 2.3, met gebruikersvriendelijke interface" en is beschikbaar om te downloaden, samen met de vorige versie 2.2. Het wordt eerst een grafische interface met alle gebruikte parameters, zoals in Fig. 2.

6. Representatieve resultaten

MTT analyseert automatisch in bij elk recorder video, om te leveren sporen van gevonden en naar schatting doelen, aangevuld met verder inopsporingsonderzoeken, zoals opsluiting detectie. Hierdoor kunnen uiteindelijk in kaart brengen van sporen op cel beelden (afb. 1C en 3).

MTT Beschrijving

De kern MTT analyse wordt uitgevoerd op elk frame, zich beroepend op 3 belangrijke taken (afb. 3):

  1. Detectie van de aanwezigheid of afwezigheid van een trefplaat (quantum-punt) binnen een glijdende deelgebied achtereenvolgens rond elke pixel, waarbij hypothesen worden vergeleken: aanwezigheid of van een signaal met de PSF Gemodelliseerd een bi-dimensionale Gaussische piek of slechts ruis, met een drempelwaarde verzekeren laag genoeg vals alarm minder dan een parasitaire detectie per frame. Dit leidt tot een kaart van detectiekans. Elk lokaal maximum wordt beschouwd als een mogelijk doelwit, verzekeren dat de kans hoger is dan een minimum waarde, ingesteld volgens de gewenste Kans op False Alarm (PFA). Deze limiet is ingesteld laag genoeg om efficiënt te discrimineren sigsignalen van lawaai, het vermijden van in het beste geval valse detecties (PFA van 10 -6 standaard, tot minder dan een fout in 512 x 512 pixel beelden verzekeren), terwijl u toch een voldoende hoge pakkans, het bereiken van de theoretisch voorspelde optimale 1. De eis dat het gebruik van een deelgebied betekent dat het beeld randen (3 pixels voor een venstergrootte van 7 x 7 pixels) niet kan worden geëvalueerd.
  2. Estimation voor elke gedetecteerde doel van de relevante parameters, zoals deelelement positie signaalintensiteit. Voor elke gedetecteerde doel wordt een kleinste kwadraten Gauss-Newton geschikt naast uitgevoerd om de positie, breedte en hoogte van de gedetecteerde Gaussische schatten. Dit geeft met name de sub-beeldpuntsplaats van de kleurstof (10 tot 20 nm nauwkeurigheid typische SNR-waarden en onbeweeglijk of langzaam diffunderende kleurstoffen, waardoor tot ongeveer 100 nm voor kleurstoffen diffunderende bij 0,1 pm 2 / s).
  3. Heraansluiting van de nieuwe doelstellingen met desporen al gebouwd over de vorige frames. De reeks nieuwe targets is gekoppeld met de set voorgaande sporen. Hiertoe om elke doel toe een spoor, indien mogelijk, alle beschikbare statistische informatie van de detectie stap wordt gebruikt, niet alleen positie, maar ook intensiteit breedte knipperen en bijbehorende statistieken. Daarom worden de doelen niet alleen aan het dichtstbijgelegen trace: in het geval van de kruising van sporen, de intensiteit, snelheid, breedte en knipperen zal worden overwogen. Dit levert de statistisch optimale Reconnection score. Deze strategie vermijdt, indien mogelijk, voorspannen de heraansluiting in de richting van de dichtstbijzijnde buren.

Detected pieken a posteriori kan afgewezen als hun schatting of heraansluiting mislukt zijn. Een speciale test zorgt voor de detectie van nieuwe pieken, die zou starten nieuwe sporen. Deze test wordt een strengere PFA (10 -7), aangezien opnieuw verbinding een piek een spoor kan in feite worden geïnterpreteerd als een validatie o f de relevantie ervan (dit criterium wordt per definitie niet van toepassing voor nieuwe pieken).

Traject Analyse

Mogelijke tijdelijke opsluiting ligt naast geëvalueerd door een functie omgekeerd evenredig met de lokale diffusie 24-29. Het toepassen van een drempel laat toe beperkt of niet episodes. Door het itereren deze over alle sporen, kunnen we in kaart te brengen membraan dynamiek, in termen van tijdelijke opsluiting / vertragen evenementen. Dit kan ook worden weergegeven met behulp van de binaire of discrete waarden van de opsluiting index.

Standaard MTT voert automatisch de taken, het opslaan van 8 piek parameters in een tekstbestand: framenummer, i en j positie, intensiteit van het signaal, radius, offset en knipperen, voor elke video-frame (groep van 7 rijen) en trace (kolom) . Deze uitgang parameters kunnen worden geladen in Matlab of octaaf met de fread_data_spt script verdere analyse bijvoorbeeld sporen van signaal-intensiteiten, zoals geïllustreerd in de "Http://www.jove.com/files/ftp_upload/3599/MTT_example.txt"> MTT_example script in bijlage.

Verdere analyses leiden tot sporen in kaart te brengen over elke cel (Fig. 1C en 3) en het histogram de distributie zorgen voor relevante parameters (zoals de intensiteit van de piek, SNR of lokale diffusie waarden). Voor elk bestand, gemiddelde en standaarddeviatie van elke parameter worden opgeslagen in een tekstbestand, samen met een afbeelding van de histogrammen. Logaritmisch verdelingen, zoals vierkant verplaatsingen r 2 tot geometrisch gemiddelde. De diffusie coëfficiënt D wordt berekend op basis van een lineaire fit over de vijf eerste punten van het MSD-curve. Deze waarden geven een overzicht van een experiment met bijvoorbeeld kinetiek van cellulaire reacties of farmaceutische / enzymatische behandelingen van invloed zijn membraan organisatie. Aangezien MTT is een open-broncode kan dit aspect gemakkelijk worden aangepast aan een specifieke onderzoek.

599fig1.jpg "alt =" Figuur 1 "/>
Figuur 1. Controle membraanreceptoren dynamiek van MTT (A). Membranen, zoals EGFR worden gelabeld met quantum-dots gekoppeld met gebiotinyleerd Fab-fragmenten (schematische tekening met ongeveer de juiste schaal van elk molecuul). (B) typische fluorescerende beeld verkregen van een live COS-7 cellen, met 36 ms belichtingstijd met de beeltenis van diffractie-gelimiteerde pieken die overeenkomen met individueel gelabeld receptor. (C) Output van de MTT analyse weergeven van de gereconstitueerde trajecten van de receptoren, overlay op de helderveld beeld van de cel.

figure-protocol-1
Figuur 2. MTT input parameters. Running MTT23i opent een grafische user interface een lijst van alle input parameters, namen en standaardwaarden, zoals beschreven in onze vorige publicatie 1. In het algoritme, ruimte en tijd parameters (zoekvensters, piek straal, maximale diffusie en knippert) zijn in dimensieloze standaard units, pixels en frames. Calibrations kan worden toegepast a posteriori om de productie resultaten om te zetten. Standaardwaarden, wat overeenkomt met een Cascade 512BFT met 100x vergroting, zijn pixelgrootte: 156 nm / pxl en frame delay: 36 ms / frame.

Onderzoekers moeten optimaliseren van een aantal kritische parameters, zoals de maximaal verwachte diffusiecoëfficiënt ("Diff max") en een maximale knipperen verdwijnen ("T uit"). Deze twee ruimte en tijd beperkt zijn bijna de enigen die moeten worden heroverwogen voor een bepaalde experimentele conditie, de anderen wordt ingesteld om robuuste standaard waarden. Zo is het aantal valse alarmen direct op minder dan een fout per miljoen pixels, zodat minder dan een frame, dat is bevredigend meestal waarborgen. Alle parameters worden opgeslagen in een tekstbestand in de output map, zodat gebruikers achteraf te verifiëren welke instellingen werden gebruikt voor analyse.

s/ftp_upload/3599/3599fig3.jpg "alt =" Afbeelding 3 "/>
Figuur 3. Belangrijke stappen van de MTT analyse. Vanaf een experimentele stapel fluorescentie beelden worden pieken elkaar automatisch gedetecteerd, worden in een Gaussiaanse benadering en opnieuw gedurende frames (eerste reeks operaties bovenste gedeelte van het stroomschema). Sporen kan verder worden geanalyseerd vermeende opsluiting bijvoorbeeld, uiteindelijk leidend tot een dynamische kaart relevante descriptoren (tweede reeks operaties, onderaan).

figure-protocol-2
Figuur 4. Labeling valentie niet MTT beïnvloeden. Om de mogelijke vertekening die door artefactual multivalent etikettering te evalueren, werd MTT-analyse uitgevoerd om endogene EGFR-gelabeld met 2 verschillende regelingen, te genereren en analyseren van kaarten van trajecten te volgen. (A) receptoren werden gelabeld met gebiotinyleerd Fab en quantum-dots605-streptavidine, zoals beschreven in het protocol.In dit geval kan de meervoudige valentie van quantum-dots en streptavidins leiden koppeling verschillende receptoren tot een kleurstof. (B) receptoren werden gelabeld met Fab rechtstreeks gekoppeld met een organische kleurstof, Atto647N. In dit geval kan een Fab dus een receptor, gekoppeld aan meer dan een kleurstof. (C) Mean Square verplaatsing (MSD) curve werd berekend voor alle sporen per cel, voorzien van een quantum-punt of Atto kleurstoffen (links en rechts grafieken, respectievelijk). Diffusion coëfficiënten zijn berekend door de lineaire fit over de vijf eerste punten van het MSD (rode stippellijn). Elk schema van etikettering leidde tot soortgelijke diffusie waarden (centrale grafiek). Qdot: quantum-dots605 (n = 5 cellen), Atto: Atto647N (n = 7 cellen), ns: niet significant (Student's t-test p-waarde> 0,05).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In enkele deeltjes volgen, naast de cel en microscopie aspecten de analyse een aanzienlijk deel van het werk. Dit heeft betrekking op het algoritme gebruikt om de drie belangrijkste taken uit te voeren: het opsporen, schatten en opnieuw aansluiten van toppen boven elk frame. Maar de daaruit voortvloeiende aspect van dit werk ligt in de uitwerking van het algoritme zelf, die dienen te worden aangepast voor een nieuw speciaal onderzoek, hoofdzakelijk voor de laatste, extra stappen (zoals het ontcijferen van vormen van bew...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken de leden van ons team, met name MC Blache voor technische bijstand, maar ook M Irla en B Imhof, voor hun steun en vruchtbare discussies. De cijfers voor deflatie en opsluiting gereproduceerd met toestemming van Nature Methods. Dit project wordt ondersteund door institutionele subsidies van de CNRS, INSERM en Marseille University, en door specifieke subsidies van de regio Provence-Alpes-Côte-d'Azur, Institut National du Cancer, Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-PCVI- 0034-02, ANR 2010 Blan 1214 01) & Fondation pour la Recherche Medicale (Equipe labélisée FRM-2009). VR wordt ondersteund door een beurs van de Ligue Nationale Contre le Cancer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens Vennootschap Catalogusnummer Hoeveelheid
Cos-7 cellijn ATCC CRL-1651 5.000 cellen / well
HBSS zonder Ca2 + GIBCO 14175 1 ml
0,05% Trypsine EDTA GIBCO 25300 1 ml
8-en Lab-tek NUNC 155441 1
Qdot-605 streptavidine Invitrogen Q10101MP 20 mM
Gebiotinyleerd Fab (voor Fab synthese, zie referentie 21)
Fab van mAb 108 ATCC HB-9764 200 ug
NHS-biotine Thermo Scientific 21435 18,5 microgram
Compleet medium
DMEM GIBCO 41965 500 ml
Foetaal runderserum SIGMA F7524 50 ml
L-Glutamine GIBCO 25030 5 ml
HEPES GIBCO 15630 5 ml
Natriumpyruvaat GIBCO 11360 5 ml
Imaging medium
HBSS met Ca2 + GIBCO 14025 25 ml
HEPES GIBCO 15630 250 pi

1 "> Uitrusting Vennootschap Referentie Geïnverteerde microscoop Nikon Eclipse TE2000U TL-lamp Nikon Intensilight C-HGFIE 1.3 NA 100x objectief Nikon Plan Fluor 1,30 1,49 NA 100x objectief Nikon APO TIRF 1,49 Camera Roper Scientific Cascade 512 B Met een thermostaat op box Life Imaging Services The Box

Bijlage: voorbeeld script van MTT aanvullende analyse

functie MTT_example (bestandsnaam)
%%% Basic voorbeelden waaruit blijkt hoe de MTT-uitgang resultaten te herstellen
%%% Elk trac uitzettene en het histogram bouwen
%%% Van fluorescentie-intensiteiten

Als nargin <1% geen bestandsnaam voorzien?
files = dir ('* stk.');
Als IsEmpty (bestanden), disp ('geen gegevens in de huidige dir'), rendement, eind
. bestandsnaam = bestanden (1) naam;% Standaard: in de eerste stk bestand
disp (['met behulp van' bestandsnaam 'standaard'])
einde

file_param = [bestandsnaam '_tab_param.dat'];% output file

%% Load data
cd (output23)% of (output22) volgens versie gebruikt
% Disclaimer: versie 2.2 genereert slechts 7 parameters,
% Een extra parameter, geluid, werd toegevoegd in versie 2.3

% Om alle parameters te lezen in een keer, in een enkele tabel
% Tab_param = fread_all_param (file_param);
% Tab_i = tab_param (2:8: eind, :); tab_j = ...

% Om alle parameters (behalve frame_number) te lezen in afzonderlijke tabellen
% [Tab_i, tab_j, tab_alpha, tab_radius, tab_offset, tab_blk, tab_noise] = fread_all_data_spt (file_param);

tab_i = fread_data_spt (file_param, 3);%-index is 3 omdat trace nummer en framenummer, niet informatief, worden verwijderd!
tab_j = fread_data_spt (file_param, 4);
tab_alpha = fread_data_spt (file_param, 5);
tab_blk = fread_data_spt (file_param, 8);

%% Lus over sporen
N_traces = grootte (tab_i, 1);
% Tabellen zijn N_traces lijnen door N_frames kolommen

voor itrc = 1: N_traces
No_blk_index = tab_blk (itrc, :)> 0;% niet knipperen stappen alleen
plot (tab_i (itrc, No_blk_index), tab_j (itrc, No_blk_index))
& Nbsp; xlabel ('i (pixel)'), ylabel ('j (pixel)')
titel (['spoor #' num2str (itrc)])
disp ('Gelieve te slaan op een willekeurige toets voor de volgende trace'), pauze
einde

%% Fluo histogram
N_datapoints = som (tab_blk (:)> 0);% niet knipperen stappen alleen
gesch (tab_alpha (tab_blk> 0), 2 * sqrt (N_datapoints))% met behulp van 2sqrt (N) bakken
xlabel ('intensiteit (AU)'), ylabel ('voorkomen')
titel ('histogram van deeltjes fluorescentie-intensiteit')

Referenties

  1. Serge, A., Bertaux, N., Rigneault, H., Marguet, D. Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotemporal cartography of cell membranes. Nat. Methods. 5, 687-694 (2008).
  2. Schmidt, T., Schutz, G. J., Baumgartner, W., Gruber, H. J., Schindler, H. Imaging of single molecule diffusion. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93, 2926-2929 (1996).
  3. Lommerse, P. H. Single-molecule imaging of the H-ras membrane-anchor reveals domains in the cytoplasmic leaflet of the cell membrane. Biophys. J. 86, 609-616 (2004).
  4. Marguet, D., Lenne, P. F., Rigneault, H., He, H. T. Dynamics in the plasma membrane: how to combine fluidity and order. EMBO. J. 25, 3446-3457 (2006).
  5. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 373-399 (1997).
  6. Dahan, M. Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Science. 302, 442-445 (2003).
  7. Harms, G. S. Single-molecule imaging of l-type Ca(2+) channels in live cells. Biophys. J. 81, 2639-2646 (2001).
  8. Iino, R., Koyama, I., Kusumi, A. Single molecule imaging of green fluorescent proteins in living cells: E-cadherin forms oligomers on the free cell surface. Biophys. J. 80, 2667-2677 (2001).
  9. Sako, Y., Minoghchi, S., Yanagida, T. Single-molecule imaging of EGFR signalling on the surface of living cells. Nat. Cell Biol. 2, 168-172 (2000).
  10. Schutz, G. J., Kada, G., Pastushenko, V. P., Schindler, H. Properties of lipid microdomains in a muscle cell membrane visualized by single molecule microscopy. Embo. J. 19, 892-901 (2000).
  11. Seisenberger, G. Real-time single-molecule imaging of the infection pathway of an adeno-associated virus. Science. 294, 1929-1932 (2001).
  12. Jacobson, K., Sheets, E. D., Simson, R. Revisiting the fluid mosaic model of membranes. Science. 268, 1441-1442 (1995).
  13. Saffman, P. G., Delbruck, M. Brownian motion in biological membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 72, 3111-3113 (1975).
  14. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  15. Papoulis, A. Probability, Random Variables and Stochastic Process 277. , McGraw Hill. (2001).
  16. Van Trees, H. L. Detection, Estimation, and Modulation Theory, Wiley Inter-Science. , (1968).
  17. Moerner, W. E. Single-molecule mountains yield nanoscale cell images. Nat. Methods. 3, 781-782 (2006).
  18. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3, 793-795 (2006).
  19. Betzig, E. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  20. Manley, S. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat. Methods. 5, 155-157 (2008).
  21. Andrew, S. M. Enzymatic digestion of monoclonal antibodies. Methods Mol. Med. 40, 325-331 (2000).
  22. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt. Lett. 19, 780-782 (1994).
  23. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt. Lett. 24, 954-956 (1999).
  24. Meilhac, N., Guyader, L. L. e, Salome, L., Destainville, N. Detection of confinement and jumps in single-molecule membrane trajectories. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft. Matter Phys. 73, 011915(2006).
  25. Saxton, M. J. Single-particle tracking: effects of corrals. Biophys. J. 69, 389-398 (1995).
  26. Serge, A., Fourgeaud, L., Hemar, A., Choquet, D. Receptor activation and homer differentially control the lateral mobility of metabotropic glutamate receptor 5 in the neuronal membrane. J. Neurosci. 22, 3910-3920 (2002).
  27. Simson, R., Sheets, E. D., Jacobson, K. Detection of temporary lateral confinement of membrane proteins using single-particle tracking analysis. Biophys. J. 69, 989-993 (1995).
  28. Jacobson, K., Dietrich, C. Looking at lipid rafts. Trends Cell Biol. 9, 87-91 (1999).
  29. Kusumi, A., Sako, Y., Yamamoto, M. Confined lateral diffusion of membrane receptors as studied by single particle tracking (nanovid microscopy). Effects of calcium-induced differentiation in cultured epithelial cells. Biophys. J. 65, 2021-2040 (1993).
  30. Livneh, E. Large deletions in the cytoplasmic kinase domain of the epidermal growth factor receptor do not affect its laternal mobility. J. Cell Biol. 103, 327-331 (1986).
  31. Medintz, I. L., Uyeda, H. T., Goldman, E. R., Mattoussi, H. Quantum dot bioconjugates for imaging, labelling and. 4, 435-446 (2005).
  32. Wu, X., Bruchez, M. P. Labeling cellular targets with semiconductor quantum dot conjugates. Methods Cell Biol. 75, 171-183 (2004).
  33. Mohammadi, M. Aggregation-induced activation of the epidermal growth factor receptor protein tyrosine kinase. Biochemistry. 32, 8742-8748 (1993).
  34. Howarth, M. Monovalent, reduced-size quantum dots for imaging receptors on living cells. Nat. Methods. 5, 397-399 (2008).
  35. Bertaux, N., Marguet, D., Rigneault, H., Sergé, A. Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface. Protocol Exchange. , (1038).
  36. Groc, L. Surface trafficking of neurotransmitter receptor: comparison between single-molecule/quantum dot strategies. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 12433-12437 (2007).
  37. Cui, B. One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).
  38. He, H. T., Marguet, D. Detecting nanodomains in living cell membrane by fluorescence correlation spectroscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 417-436 (2011).
  39. Cebecauer, M., Spitaler, M., Serge, A., Magee, A. I. Signalling complexes and clusters: functional advantages and methodological hurdles. J. Cell. Sci. 123, 309-320 (2010).
  40. Kao, H. P., Verkman, A. S. Tracking of single fluorescent particles in three dimensions: use of cylindrical optics to encode particle position. Biophys. J. 67, 1291-1300 (1994).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Single-particle trackingepidermale groeifactorreceptorlabeling met quantum dotsimaging met hoge dichtheidtrajectreconstructiepiekdetectiedeflatie-algoritmeanalyse van transiënte opsluitingMonte-Carlo-simulaties
Het in kaart brengen moleculaire diffusie in het plasmamembraan door Multiple-Target Tracing (MTT)
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.