Gekweekte spiercellen een inadequate model om geïnnerveerde spier recapituleren In vivo. Een functionele aandrijving kan worden gereproduceerd In vitro Door innervatie van gedifferentieerde menselijke primaire spiercellen met behulp van ratten embryo ruggenmerg explantaten. Dit artikel beschrijft hoe co-culturen van het ruggenmerg explantaten en spiercellen zijn gevestigd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een Functionele Motor-eenheid in de cultuur Dish: Co-cultuur van het ruggenmerg Explantaten-en spiercellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Menselijke primaire spiercellen aneurally gekweekt in monolaag zelden contract spontaan, omdat, bij het ontbreken van een zenuw component, celdifferentiatie is beperkt en motor neuron stimulatie ontbreekt 1. Deze beperkingen belemmeren in vitro onderzoek van vele neuromusculaire aandoeningen gekweekte spiercellen. Belangrijk is dat de experimentele beperkingen van monolayered, gekweekte spiercellen worden ondervangen door functionele innervatie van myofibers met ruggenmerg explantaten in co-culturen.
Hier wordt tonen verschillende stappen nodig zijn om een efficiënte goede innervatie van humane primaire spiercellen bereiken, waardoor differentiatie en vezels contractie af volgens de methode van Askanas 2. Om dit te doen, zijn spiercellen samen gekweekt met het ruggenmerg explantaten van de rat embryo's bij ED 13.5, met de achterwortelganglia nog aan het ruggenmerg plakjes. Na een paar dagen, de spier fileden beginnen te contracteren en uiteindelijk cross-dwarsgestreepte worden door innervatie door functionele neurieten dat uitsteekt uit het ruggenmerg explantaten dat de verbinding met de spiercellen. Deze structuur kan worden gehandhaafd gedurende maanden eenvoudig door geregelde uitwisseling van het kweekmedium.
De toepassingen van deze instrument van onschatbare waarde zijn talrijk, omdat dit een functioneel model voor multidisciplinaire analyses van de menselijke spierontwikkeling en innervatie. In feite een volledige de novo neuromusculaire installatie optreedt in een kweekschaal, waardoor een gemakkelijke meting van vele parameters bij elke stap in een fundamentele en fysiologische omgeving.
Gewoon om een paar voorbeelden, genomische en / of proteomische onderzoeken citeren kan direct worden uitgevoerd op de co-culturen. Bovendien kunnen pre-en post-synaptische effecten specifiek en afzonderlijk worden beoordeeld op de neuromusculaire verbinding, omdat beide componenten afkomstig zijn van verschillende soorten,rat en mens, respectievelijk. De zenuw-spier co-cultuur kan ook worden uitgevoerd met menselijke spiercellen geïsoleerd van patiënten die lijden aan spier-of neuromusculaire ziekten 3, en kan dus worden gebruikt als screening instrument voor kandidaat-medicijnen. Tenslotte is geen speciale apparatuur, maar regelmatige BSL2 inrichting nodig om functionele motorunit een kweekschaal reproduceren. Deze methode is dus waardevol voor de spier en de neuromusculaire onderzoekgemeenschappen fysiologische en mechanistische studies neuromusculaire functie, in normale en ziekte context.
Protocol
1. Voorbereiding van de primaire menselijke spiercel Cultuur
- Bepaal de menselijke spiercel culturen volgens de explantatie-re-explantatie techniek 4. Verwijder eerst niet-spierweefsel van de biopten. Vervolgens 1 mm 3 spier explantaten insluiten in een coagulum van plasma, waardoor fibroblasten om uit de explantaten.
- De geïntegreerde explantaten overgebracht naar een plasma-gelatine beklede schaal en laten groeien in normale groei medium (MEM aangevuld met 25% Medium 199, 10% foetaal bovine serum [FBS] 1% penicilline / streptomycine, 10 ug / ml insuline 10 ng / ml menselijke epidermale groeifactor [EGF] 12.5 ng / ml humaan fibroblast groeifactor [FGF]) in een monolaag. De cellen die uit de explantaten ontstaan onder die voorwaarden zijn spiercellen. Deze cellen blijven in een monolaag groeien na verwijdering van de explantaten.
- Culture de cellen aneurally op 0,1% gelatine beklede platen in normale groeimedium. De cellen kunnenaneurally gekweekt en versterkt nodig. Beter is spiercellen gebruiken doorgang tussen 3 en 8 de co-culturen voeren. Het is cruciaal om jonge myotubes innerveren; na dit punt, de co-culturen hebben een grote kans op falen. Bovendien moet myotubes niet te groot en te dik.
- Twee dagen voor de innervatie gepland, plaat de spiercellen op 35 mm weefselkweekschalen (of 6 wells platen) met een dichtheid van 500.000 cellen per schaaltje in normale groeimedium. Op dat dichtheid, de cellen op de juiste confluentie om de fusie te starten op de volgende dag, en de daaropvolgende innervatie de dag daarna. Met behulp van deze voorwaarden, de myotubes zijn op het juiste moment voor een optimale innervatie en dus de daaropvolgende vezels contractie.
- Op de volgende dag vervangen normale groeimedium met fusiemedium uit MEM aangevuld met 25% Medium 199, 5% FBS, 10 ug / ml insuline en 1% penicilline / streptomycine.
2. Isolati op een van de Rat Embryonale Spinal Cord Explantaten
De procedure voor het ruggenmerg explantaten isoleren wordt uitgevoerd onder een binoculaire microscoop, in Balanced Salt Solution Hank's (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) met 10% foetaal runderserum (FBS).
- Het is van cruciaal belang dat de rat embryo's zijn tussen de ED 13 en 14 als een andere ontwikkelingsfase in gevaar zou brengen de hele procedure. Offer een zwangere vrouw met CO 2 en het verzamelen van de hele keten embryo in HBSS medium. Isoleer elk embryo en onthoofden ze voor euthanasie.
- Ontleden het embryo ruggenmerg van de rest van het lichaam in een stuk en verwijder omliggende spier-en bindweefsel. Wees zeer voorzichtig aan de dorsale wortel klieren (DRG's) die aan het ruggenmerg om functionele innervatie zorgen te houden.
- Dwars snijden elkaar ruggenmerg dat ieder explantaat ten minste twee DRG verbonden (explantaten van 1 mm 3).
- Verwijder de fusiemedium op de spieren celkweek, waarbij een dunne laag medium op de monolaag.
- Plaats de explantaten op de spieren cellaag, vijf gelijkmatig verdeelde explantaten per 35 mm schaal.
- Voeg heel langzaam, druppelsgewijs, fusion medium op elke explant. Het is noodzakelijk medium toe te voegen voor de spiercellen te overleven, maar niet te veel te laten explantaten eerst hechten en contact maken met de cellen. Als het medium niet goed is (te sterk of te veel medium) toegevoegd, zal de explantaten drijven en zullen voldoen aan de spiercellen innerveren.
- Zodra de explantaten beginnen zich te houden, boven de fusie op middellange tot 2 ml per 35 mm schotel, en zet de gerechten heel voorzichtig terug in de incubator.
4. Onderhoud van het heterologe zenuw-spier Co-culturen
- Wijzig de fusie medium twee keer per week.
Zodra twee dagen na de innervatie is het mogelijk om het neurieten die uit elk explantaat en om contacten met de spiercellen, vertegenwoordigd door de knop structuren (Figuur 1).
Al in 4-6 dagen na de innervatie, zal een aantal individuele vezels beginnen te contracteren.
De weeën blijven voor vele maanden, onderhouden gewoon door het veranderen van het kweekmedium twee keer per week.
Na ongeveer 2 weken, het ruggenmerg explant zelf ontaardt, maar de innervatie wordt geconserveerd. Dit is normaal. Een dunne laag van zenuw component blijft op het oppervlak van de spiercel laag. Dit zenuwstelsel netwerk is voldoende om de functionaliteit van de aandrijving te handhaven.
Als de explantaten drijven in het medium de dag na innervatie, zullen ze nooit houden. Dit gebeurt wanneer de spiercel laag isonvoldoende confluent, of wanneer het medium te ruw toegevoegd. Soms zal de explant voldoet, maar geen neurieten ontstaan. Dit komt waarschijnlijk door het ontbreken van DRG is bevestigd. In dat geval ook, zal de bezenuwing niet worden vastgesteld. Manipuleer de gerechten heel voorzichtig de eerste week, omdat de explantaten nog gemakkelijk los te maken. Om de fusie media uit te wisselen, voeg de vloeistof druppelsgewijs met een minimale snelheid om cellen loslaten is uitgesloten.
Figuur 1. Ruggenmerg explantaten-spiercel co-kweken van dag 1 tot dag 15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een fysiologische in vitro middel om spier-cel functie te bestuderen in normale en pathologische context is van de hoogste belang is voor de myologists, omdat spiercel culturen meestal niet herhalen het belang van meerdere cellen en cel-achtige verbindingen. De toevoeging van gezuiverde motorneuronen spier cellen niet genoeg om een functionele motorunit bereiken, aangezien de aanwezigheid van Schwann cellen vereist voor de innervatie om efficiënt 5 en het is niet topologisch (3D + speciale verdeling)...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Ons werk wordt ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNF), het Zwitsers initiatief in Systems Biology (SystemsX.ch), de Vereniging voor Musculaire Dystrofie USA (MDA), de Association Française contre les Myopathie (AFM), de Verenigde mitochondriale ziekte Foundation (UMDF), de Gebert-Rüf Stichting Zeldzame Ziekten Programme (GRF), de Zwitserse Vereniging voor Onderzoek van de spierziekten (SSEM / FSRMM), de Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Volksgesundheit und Medizinische Forschung", de Roche Research Foundation en de Universiteit van Basel.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| HBSS | Gibco / Invitrogen | 14170 | |
| MEM | Gibco / Invitrogen | 31095 | |
| Medium 199 | Gibco / Invitrogen | 31153 | |
| Foetaal runderserum | Foetale Clone Perbio | SH30066.03 | |
| Insuline | Sigma | I9278 | |
| Human EFG | Sigma | E9644 | |
| Human FGF | SiGMA | F0291 | |
| Penicilline / streptomycine oplossing | Gibco | 15140 |
Referenties
- Delaporte, C., Dautreaux, B., Fardeau, M. Human myotube differentiation in vitro in different culture conditions. Biol. Cell. 57, 17-22 (1986).
- Kobayashi, T., Askanas, V., Engel, W. K. Human muscle cultured in monolayer and cocultured with fetal rat spinal cord: importance of dorsal root ganglia for achieving successful functional innervation. J. Neurosci. 7, 3131-3141 (1987).
- Braun, S., Croizat, B., Lagrange, M. C., Warter, J. M., Poindron, P. Constitutive muscular abnormalities in culture in spinal muscular atrophy. Lancet. 345, 694-695 (1995).
- Askanas, V., Engel, W. K. A new program for investigating adult human skeletal muscle grown aneurally in tissue culture. Neurology. 25, 58-67 (1975).
- Guettier-Sigrist, S., Coupin, G., Warter, J. M., Poindron, P. Cell types required to efficiently innervate human muscle cells in vitro. Exp. Cell Res. 259, 204-212 (2000).
- Lefebvre, S. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 80, 155-165 (1995).
- Schrank, B. Inactivation of the survival motor neuron gene, a candidate gene for human spinal muscular atrophy, leads to massive cell death in early mouse embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 9920-9925 (1997).
- Hsieh-Li, H. M. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24, 66-70 (2000).
- Monani, U. R. The human centromeric survival motor neuron gene (SMN2) rescues embryonic lethality in Smn(-/-) mice and results in a mouse with spinal muscular atrophy. Hum. Mol. Genet. 9, 333-339 (2000).
- Sleigh, J. N., Gillingwater, T. H., Talbot, K. The contribution of mouse models to understanding the pathogenesis of spinal muscular atrophy. Dis. Model. Mech. 4, 457-467 (2011).
- Durbeej, M., Campbell, K. P. Muscular dystrophies involving the dystrophin-glycoprotein complex: an overview of current mouse models. 12, 349-361 (2002).
- Schnabel, J. Neuroscience: Standard model. Nature. 454, 682-685 (2008).
- Benatar, M. Lost in translation: treatment trials in the SOD1 mouse and in human ALS. Neurobiol. Dis. 26, 1-13 (2007).
- Dorchies, O. M. Normal innervation and differentiation of X-linked myotubular myopathy muscle cells in a nerve-muscle coculture system. Neuromuscul. Disord. 11, 736-746 (2001).
- McFerrin, J., Engel, W. K., Askanas, V. Impaired innervation of cultured human muscle overexpressing betaAPP experimentally and genetically: relevance to inclusion-body myopathies. Neuroreport. 9, 3201-3205 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
