Methoden voor Studie van Neuronale Morphogenesis: Ex vivo RNAi Elektroporatie in Embryonale Murine Cerebral Cortex

Samenvatting

Om een ​​snelle evaluatie van de functie van genen in de ontwikkeling van cerebrale cortex voeren beschrijven we werkwijzen waarbij Ex vivo Elektroporatie van plasmiden co-expressie remmende RNA (RNAi) en GFP in muizen embryonale cortex. Dit protocol is vatbaar voor de studie van verschillende aspecten van de neurologische ontwikkeling, zoals neurogenese, neuronale migratie en neuronale morfogenese waaronder dendriet en axon uitgroei.

Samenvatting

De cerebrale cortex leidt hogere cognitieve functies. Deze zes gelaagde structuur wordt gegenereerd in een in-first buiten-last wijze, waarbij de eerste geboren neuronen dichter blijven de hartkamer en de laatste geboren neuronen migreren voorbij de eerste geboren neuronen naar het oppervlak van de hersenen ^1. Naast de neuronale migratie ^2, een belangrijke proces voor normale corticale functie is de regulering van de neuronale morfogenese ^3. Terwijl neuronale morfogenese bestudeerd kan worden in vitro in primaire culturen, is er veel te leren van de manier waarop deze processen worden geregeld in weefsel omgevingen.

We beschrijven technieken om neuronale migratie en / of morfogenese in organotypische plakken van de cerebrale cortex ^4,6 analyseren. Een pSilencer gewijzigd vector wordt gebruikt die zowel een U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld rijdt en een aparte expressiecassette dat GFP-eiwit codeert gedreven bya CMV promoter ^7-9. Onze aanpak maakt het mogelijk voor de snelle beoordeling van de gebreken in neurietuitgroei op specifieke knockdown van kandidaat-genen en is met succes gebruikt in een scherm voor regulatoren van neurietuitgroei ^8. Omdat er slechts een subset van cellen drukken de RNAi constructen, de organotypische plakjes zorgen voor een mozaïek analyse van de mogelijke fenotypes. Bovendien, omdat deze analyse wordt uitgevoerd in een bij aanpassing van de in vivo milieu, het een goedkope en snelle alternatief voor het genereren van transgene of knockout dieren genen bekend corticale functie. Tot slot, in vergelijking met de in vivo elektroporatie technologie, het succes van ex vivo elektroporatie experimenten is niet afhankelijk van bekwaam een operatie ontwikkeling van vaardigheden en kunnen worden uitgevoerd met een kortere trainingstijd en vaardigheid.

Protocol

1. Voorbereiden van Cultuur en Media Solutions (niet in video)

1. Bereid 1 liter gebalanceerde zoutoplossing volledige Hank's (HBSS) met 1 x HBSS, 2,5 mM Hepes (pH 7,4), 30 mM D-glucose, 1 mM _CaCl2, 1 mM MgSO ₄ en ₄ mM NaHCO _3. Voeg dubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O). Filter sterilisatie met een 0,2 pm filter en bewaren bij 4 ° C.
2. Bereid slice kweekmedium met 35 ml van basismedium Eagle medium, 12,9 ml compleet HBSS, 20 mM D-glucose (1,35 ml 1 M oplossing), 1 mM Glutamax (0,25 ml van een 200 mM oplossing), 0,5 ml penicilline -streptomycine 100x voorraad. Filter sterilisatie met een 0,2 pm filter, voeg vervolgens hitte-geïnactiveerd paardenserum tot een eindconcentratie van 5%.
3. Bereid Laminine werkoplossing door een 1 mg / ml voorraadoplossing Laminine met steriel gedestilleerd gedeïoniseerd water. Bereid 100 ul fracties in 0,5 ml Eppendorf buizen en bevriezen bij -80 ° C.
4. Dus bereid Poly-L-lysine werkenlutie door toevoeging van 5 ml steriel _H2O op 5 mg van poly-L-lysine een 1 mg / ml voorraadoplossing maken. Bereid 1 ml porties en invriezen bij -20 ° C.
5. Bereid coating oplossing 1 ml poly-L-lysine en 100 ul van laminine tot een eindvolume van 12 ml met steriel water. Maak deze oplossing vers per keer.

2. Voorbereiden organotypische Slice Inserts (niet in video)

1. Bereid twee zes-well platen met een cultuur insert per putje met behulp van een steriel pincet. Voeg 2 ml steriele DDH ₂ O onder de cultuur van inserts.
2. Voeg 1 ml van de bekledingsoplossing boven het membraan te vermijden dat te doorboren het membraan. Incubeer overnacht in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en _5% CO2.
3. Verwijder de coating media en was membraan met steriele H ₂ 0 drie keer. Laat inserts drogen voor gebruik. Voeg 1,8 ml van het kweekmedium slice en doe dit in 37 ° C incubator. Wikkel de ongebruikte platen met Parafilmen bewaren bij 4 ° C gedurende 4 weken.

3. Voorbereidingen voor Elektroporatie (niet in video)

1. Bereid RNAi constructen voor elektroporatie. Dubbele streng RNA haarspeld inserts werden gekloneerd in een pSilencer vector. Het plasmide bevat: 1) een promotor die U6 de dubbelstrengs RNA productie aandrijft en 2) een GFP expressie cassette aangedreven door de CMV promoter ^8,9. Dit plasmide werd eerder beschreven door Konishi en collega ⁹ en anderen ^7,8. Plasmiden worden gezuiverd met behulp van een Qiagen maxi-prep kit en gebruikt bij een concentratie van 1 mg / mL.
2. Om DNA visualiseren tijdens het injecteren te bereiden met 0,5% snelle groene kleurstof oplossing en het op 1:20 met het DNA te injecteren (meestal 20 pi DNA met 1 pl snel groen). Overblijft DNA snelle groene kleurstof mengsel worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende een week.
3. Schoon dissectie gebied, dissecting gereedschappen en vibratome schip met 70% ethanol. Koel volledige HBSS zodat het ijskoud. Chill vibratome schip door inpakken ijs rond het binnen de vibratome met wat water voor een snelle koeling. Bereid 3% laag smeltpunt agarose met complete HBSS. Magnetron voor 1 min. Vermijd koken. Bewaar ze in een 42 ° C waterbad tot gebruik.
4. Elektroporatie parameters worden ingesteld als volgt. Voor een E15 embryo gebruik 35 V, 5 pulsen, 100 ms lang, 900 ms interval tussen de pulsen. Voor oudere dieren, elektroporatie zorgen gebruik hogere spanning tot 50 V het aantal pulsen tot 8 pulsen. Om te voorkomen dat het weefsel in jonge dieren, gebruikt men minder pulsen of tot 2 pulsen en lagere spanning tot 25 V. Deze parameters kunnen worden gevarieerd en bepaald empirisch afhankelijk van de leeftijd van het dier.

4. Dissection en elektroporatie (in video)

1. Na de euthanasie een zwangere vrouw, ontleden embryo's in ijs koud volledige HBSS. KeEp elk embryo in hun individuele placenta zakken.
2. Ontleden embryo uit en sneed de kop na de eerste wervel. Houd in ijskoud volledige HBSS.
3. Voor injectie, plaats het hoofd op een stuk Parafilm op een petrischaal. Met maat Hamilton spuit (zie Tabel I) ongeveer 6 tot 8 pi DNA injecteren: snelle groene kleurstof mix door de derde ventrikel om vullen laterale ventrikels in de corticale vesicles. Als alternatief kan injectie rechtstreeks worden in elke laterale ventrikel.
4. Voor de ex vivo elektroporatie, gebruik maken van BTX-pincet platina elektroden. Plaats de positieve elektrode naar de zijkant van de cortex dat u wilt ie top van het hoofd electroporate voor de dorsale cortex.
5. Na elektroporatie incuberen de kop op ijs gedurende ten minste 5 minuten voor ontleding.
6. Ontleden hersenen in ijskoud HBSSby het maken van een kleine incisie aan de zijkant van het hoofd en peeling van de huid van de zijkanten van het hoofd. Vervolgens metfijne pincet voorzichtig afpellen van de pia van de hersenen. Verwijder de intacte hersenen uit de schedel, zorg ervoor dat u de cortex beschadigd.

5. Inbedding en Opdeling van geëlektroporeerd cortex (in video)

1. Overdracht 3% laag smeltpunt agarose in een grote mal op ijs. De onderkant van de mal sneller gaan die hersenen verhinderen zinken naar de bodem van de vorm stollen. Voorzichtig, over te dragen hersenen met een fijne pincet een voor een na het verwijderen van overtollige buffer met een Kimwipe of filtreerpapier. Gebruik een 10 pi pipet tip om werveling van de hersenen in de mal om een ​​maximale interface tussen de agarose en hersenweefsel te garanderen.
2. Plaats de hersenen alle hersenen waarborgen in dezelfde richting en ongeveer hetzelfde niveau in de agarose. Laat de agarose stolt gedurende ongeveer 5 minuten. Gebruik lijm (gek lijm) aan de agarose blokken, zodat de olfactorische bollen staan ​​op te bevestigen. Wanneer de blokken verbonden zijn, direct toevoegen ice koude HBSS en trim de agarose om te zorgen dat afzonderlijke segmenten te worden verkregen voor elke hersenen.
3. Om de blokken snijden, stelt u de vibratome de snelheid op een lage snelheid (ongeveer de helft van het maximum) en zet het mes trillingsfrequentie op de hoogste stand. Genereer voor 250 micrometer dikke coronale plakken. Haal plakken met behulp van een gebogen fijne spatel en overbrengen naar weefsel putten met een fijne borstel of een tang.
4. In weefselkweek kap, over te dragen sneetjes in met coating. Voeg 500 ul van slice voedingsbodems voor elke insert om de overdracht eenvoudig. Tot 5 plakjes kunnen worden geplaatst per insert. Overtollig materiaal uit de top van de segmenten en incuberen bij 37 ° C in bevochtigde incubator.

6. Cultuur en Analyse van organotypische Slices (in video)

1. Om gezonde schijven houden, moet vers medium worden toegevoegd in ten minste om de andere dag onder het membraan door het vervangen helft van de media telkens.
2. Om plakken analyse na desired dagen in cultuur, vast plakken in het membraan. Wassen met 1x fosfaat fysiologische zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C driemaal 10 minuten per keer. Vervolgens nacht vast met 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C of gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
3. Slices kunnen worden geanalyseerd met verschillende cellulaire merkers of gekleurd met Hoechst alleen om geëlektroporeerde en niet-geëlektroporeerde cellen te visualiseren. Permeabilize en blokkeren plakjes 2 uur bij kamertemperatuur met 10% serum geit, 0,1% Triton in PBS met 1 x zachtjes schudden.
4. Vlek met Hoechst gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, was 3 maal met PBS 1x 10 min telkens zachtjes schudden.
5. Voor de montage plakjes snijden het membraan met een scalpel, en met een fijne tang om het membraan met plakjes op een mat glas te dragen dia's in een waterreservoir. Tot 5 plakjes kunnen worden geplaatst per glasplaatje. Verwijder overtollig water, en voeg een druppel Flourmount oplossing voor elke hersenen slice. Plaats voorzichtig een dekglaasje op de top van de hersenen plakjes en verwijder eeny luchtbellen. Analyseren segmenten met een confocale microscoop.

7. Alternatieve paraffine inbedding van organotypische Slices (niet in video)

1. Organotypische plakjes kunnen worden ingesloten voor paraffine een fijnere morfologische analyse daartoe het membraan dat het organotypische plakjes kunnen worden gefixeerd in 4% PFA zoals hierboven beschreven.
2. De vaste schijven zijn ingebed in 1% agarose (voorverwarmd tot 37 ° C) en verhard in ijs gedurende 30 minuten. De agarose blokken kunnen vervolgens na gefixeerd in 4% PFA bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
3. De agarose blok met de organotypische segment wordt dan ingebed in paraffine en verwerkt voor immunofluorescentie zoals reeds beschreven ^10.

8. Representatieve resultaten

Een schematische weergave van de elektroporatie van muizen cortex en cultuur organotypische segmenten is in figuur 1. Deze methode is een nuttige strategie voor rapid beoordeling van de functie van genen die betrokken zijn bij neuronale ontwikkeling ^11. Afhankelijk van de hoeveelheid DNA geëlektroporeerde en embryonale stadium elektroporatie de transfectie-efficiëntie variëren. Slices start uiten GFP ten minste 8 uur na de elektroporatie en cellen zal het normale verloop van neurogene evenementen (proliferatie, migratie, en het begin van neuronale differentiatie) in de cultuur te ondergaan. Figuur 2 toont een geëlektroporeerde hersenen slice dat is het uiten van een controle pSilencer-GFP vector en men kan waarnemen neuronale voorlopercellen, de migratie van neuronen en gedifferentieerde neuronen in de slice. Organotypische segmenten behouden hun morfologie zolang zij in een goede media lucht interface op de membranen en kan worden tot ten minste 5 dagen kweek.

Figuur 1. Illustratie van ex vivo elektroporatie en organotypische slicecultuur assay. E14.5 embryo ontleed uit, en individueel geïnjecteerd met DNA gemengd met snelle groene kleurstof om de injectie visualiseren. DNA kan worden geïnjecteerd in zowel de laterale ventrikels zoals weergegeven in de tekening of derde ventrikel om de laterale ventrikels vullen. Na injectie worden de hersenen geëlektroporeerd met een blokgolf electroporator, het plaatsen van de positieve elektrode aan de gewenste zijde van de hersenen. Hersenen zijn ingebed in 3% laagsmeltend agarosegel en coupes met een vibratome. 250 pm hersenplakjes worden gebracht 0,4 pm inserts en gekweekt tot een week. GFP kan worden waargenomen na 8 uur na transfectie.

Figuur 2. Analyse van geëlektroporeerde hersenplakjes. Geëlektroporeerd hersenen plakjes werden gekleurd voor Hoescht. Dorsale cortex toont geëlektroporeerd neuronale voorlopercellen in de ventriculaire zone (vz). Neuronen in de Cortical plaat (cp) worden begrensd door de marginale zone (MZ). Witte pijlen geven migreren neuronen. In dit geval werden hersenen geïnjecteerd E15.5 en geëlektroporeerd met pSilencer GFP controle vector. De secties vertegenwoordigen corticale explantaten 4 dagen na elektroporatie. Schaal bar 100 urn.

Problemen oplossen:

1. Laag transfectie efficiëntie: Stel de concentratie van DNA werd gebruikt om tenminste 1 ug / pl. Gebruik altijd zeer schoon DNA van een maxi prep gebruik zo nodig een endo-vrij Quiagen kit om het DNA te zuiveren.
2. Cellen getransfecteerd in een ander gedeelte van de hersenen dan de gewenste: zorgen dat de elektroden kunnen worden geplaatst met de positieve elektrode positie naar de kant van de hersenen te geëlektroporeerd.
3. Organotypische plakjes verliezen morfologie: Change media elke dag en zorgen voor de schijfjes zijn niet zweven in de media
4. Slices komen uit de agarose als ze worden gesneden in de vibratome: Zorg ervoor dat een goede interface is gemaakt wanneer het inbedden van de hersenen in de lage smeltpunt agarose.

Discussie

Deze methoden met betrekking tot de ex vivo elektroporatie van plasmiden die coderen voor dubbelstrengs RNA haarspelden ⁸ en cultuur van organotypische plakjes ⁴ geven een aantal duidelijke voordelen. Ten eerste, deze methoden zorgen voor een snelle beoordeling van de RNAi-afgeleide fenotypes. Het opnemen van een expressiecassette codering GFP in dezelfde vector pSilencer de U6 promotor die de dubbelstrengs RNA haarspeld aandrijft bevat zorgt voor een snelle identificatie en karakteriserin...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Hamilton spuit	HAMILTON	80008	31 gauge, 0,5 cm lang, PT-4 (niveau van punt afschuining), 10μl volume
Platinum tweezertrodes	BTX	45-0489	5mm grootte
ECM830 electroporator	BTX	45-0002
BTX voetschakelaar	BTX	45-0208	Voor gebruik met ECM830 electroporator
Vibrerende mes microtoom	LEICA	VT1000 S
6 - goed gerecht om te gebruiken met inserts	FALCON	353502	Bevat inkepingen te passen inserts
Weefselkweek inserts	FALCON	353090	0,4 micrometer
Fast Green	SIGMA	F7252
Low Melting Agarose	FISHER	BP165-25	DNA-klasse
Laminine	Sigma-Aldrich	L2020
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P5899
Basismedium Eagle	Sigma Aldrich	B-1522
HBSS 10x zonder Ca-en Mg	GIBCO	14180-046
HEPES-zuur	Sigma-Aldrich	H4034