Analyse van de neurale lijst migratie en differentiatie door Cross-soorten transplantatie

Samenvatting

Een benadering voor het analyseren van migratie en de uiteindelijke lot van aviaire neurale lijst cellen in kwartel-chick chimere embryo's wordt beschreven. Deze methode is een eenvoudige en directe techniek voor het opsporen van neurale lijst cellen tijdens migratie en differentiatie die anders moeilijk te onderscheiden binnen een ongemanipuleerde kippenembryo.

Samenvatting

Aviaire embryo's bieden een uniek platform voor het bestuderen van vele gewervelde ontwikkelingsprocessen, als gevolg van de gemakkelijke toegang van de embryo's in het ei. Chimère aviaire embryo's, waarbij kwartel donor weefsel wordt in een kippenembryo getransplanteerd in ovo, combineren de kracht van onuitwisbare genetische kenmerken van celpopulaties met het gemak van manipulatie door het aviaire embryo.

Quail-chick hersenspinsels zijn een klassiek instrument voor het opsporen van trekkende neurale lijst cellen (NCC's) ^1-3. NCC's zijn een tijdelijke trekkende populatie van cellen in het embryo, die van oorsprong in het dorsale gebied van de ontwikkeling van neurale buis ^4. Ze ondergaan een epitheliale naar mesenchymale transitie en vervolgens migreren naar andere regio's van het embryo, waar ze differentiëren in verschillende soorten cellen, waaronder kraakbeen ^5-13, melanocyten ^11,14-20, neuronen en glia ^21-32. NCC's zijn multipotente, en hun uiteindelijke lot is invloedbeïnvloed door 1) het gebied van de neurale buis waaruit zij van oorsprong langs de Rostro-caudale as van het embryo ^11,33-37, 2) signalen van naburige cellen als ze ^38-44 migreren, en 3) de micro-omgeving van hun uiteindelijke bestemming binnen het embryo ^45,46. Tracing deze cellen vanuit hun oorsprong in de neurale buis, op hun definitieve standpunt en het lot in het embryo, levert belangrijke inzicht in de ontwikkelingsprocessen die patronen en organogenese te reguleren.

Transplantatie van complementaire regio's van donor neurale buis (homotopic enten) of verschillende regio's van donor neurale buis (heterotope enten) kan onthullen verschillen in de pre-specificatie van NCC's langs de Rostro-caudale as ^2,47. Deze techniek kan verder worden aangepast aan een eenzijdige compartiment van de neurale buis, zodat een zijde uit donorweefsel transplanteren en contralaterale zijde blijft onverstoord in de gastheer embryo, yielding een interne controle binnen hetzelfde monster ^2,47. Het kan ook worden aangepast voor transplantatie van hersenen segmenten later embryo na HH10 wanneer de voorste neurale buis gesloten ^47.

Hier melden wij technieken voor het genereren van kwartel-chick hersenschimmen via neurale buis transplantatie, die het mogelijk maken voor het traceren van de trekkende NCC's afgeleid van een discrete segment van de neurale buis. Soortspecifieke kenmerken van de donor-afgeleide cellen met de kwartel-specifieke antilichaam QCPN ^48-56 kan de onderzoeker om donor en gastheercellen te onderscheiden in een experimentele eindpunt. Deze techniek is eenvoudig, goedkoop, en heeft vele toepassingen, waaronder het lot-mapping, cellijn opsporen en identificeren van pre-patronen evenementen langs de Rostro-caudale as ^45. Vanwege het gemak van toegang tot de aviaire embryo, kan de kwartel-chick graft techniek worden gecombineerd met andere bewerkingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot lens ablatie ⁴0, injectie van remmende moleculen ^57,58, of genetische manipulatie via elektroporatie van meningsuiting plasmiden ^59-61, om de reactie van bepaalde trekkende stromen van NCC's tot verstoringen in ontwikkeling van het embryo-programma te identificeren. Bovendien kan deze enten techniek ook gebruikt worden om andere interspecifieke chimere embryo's, zoals kwartel-eend hersenschimmen genereren NCC bijdrage aan craniofaciale morfogenese, of muis-chick hersenschimmen om de kracht van de muis genetica te combineren met het gemak van manipulatie van de aviaire embryo te bestuderen ^62.

Protocol

1. Incubate kuiken en kwarteleitjes op de gewenste fase

Voor HH9 embryo's, typische incubatietijd varieert 29 tot 33 uur bij 38 ° C ⁶³

1. Was de puin van de eieren met lauw water.
2. Horizontaal Leg eieren op de tray. Markeer de zijde naar boven met potlood, dit komt overeen met de regio waar het embryo zal worden gelokaliseerd. Incubeer kwarteleitjes stomp eindigen.
3. Plaats in 38 ° C bevochtigde incubator. Zet schommelen functie.

2. Bereid eieren voor windowing en dissectie

1. Verwijder eieren van incubator, en steriliseer de toppen met 70% ethanol. Het beste is om spuiten in de richting van de ethanol en veeg snel met een papieren handdoek of Kimwipe aan een opname van ethanol te vermijden door de eierschaal.
2. Leg de kip ei op een individueel ei houder (wij gebruik van een petrischaal bekleed met gevouwen papieren handdoeken, bijv. "Kimwipes"). Met behulp van AA tang, tikt u op een klein hole in het bovenvlak van de eierschaal aan het puntige uiteinde van het ei.
3. Verwijder de 1,5-3 ml van het licht albumine van de kip ei met een 18 ½ G injectienaald en 5 ml spuit. Het beste is om de naald verticaal in te voegen in het gat, met de schuine rand met uitzicht op de puntige kant van het ei (figuur 2A). Deze manier, als albumine wordt ingetrokken, is er weinig kans op per ongeluk beschadiging van de dooier via de afzuiging. Gooi de albumine. Deze stap zal verlagen de dooier en embryo in het ei, zodat een venster worden geopend in de eierschaal.
4. Veeg het gat met 70% ethanol zoals hierboven beschreven en sluit deze af met Scotch tape. Het is belangrijk dat de eierschaal rondom het gat volledig vrij van albumine en droge of de lijm afdichting.
5. Met de AA-tang, tikt u op een ander gat in de gemarkeerde bovenkant van de horizontale ei, niet helemaal aan de top. Zorg ervoor dat u laat de tang te ver gaan door de eierschaal heen om te voorkomen dat schade aan het eigeel of embryo.
6. Induw een zijde van de gekromde iris pincet in het gat evenwijdig aan de eieren schaal. Knijpen naar beneden op de schelp, het werken in een draaiende beweging een ~ 2 cm in diameter venster in het kippenei schaal te breken. Gooi de verwijderde eierschaal. Als alternatief, bedek de bovenkant van het ei met verpakkingstape en gebruik een schaar te snijden uit het raam. Dit minimaliseert de kans op eierschaal puin vallen in het ei. De embryo moet verschijnen als een opaak schijf boven de dooier. Gooi onbevruchte eitjes (te herkennen aan kleine witte vlek op het oppervlak van de dooier, of afwezigheid van blastoderm).
7. Spuit een kleine hoeveelheid van de Oost-Indische inkt (1:10 verdund in oplossing steriele Ringer's met "Pen / Strep" antibioticum: uiteindelijke concentratie 100 ug / ml penicilline en 100 pg / ml streptomycine) onder de blastoderm om te helpen met het organiseren van het embryo. Gebruik van 1 ml spuit en 26 ½ G injectienaald, gebogen in een hoek van 45 ° aan de basis van de naald met de schuine naar boven, als alternatief, een may gebruik maken van een getrokken glas Pasteur pipet en mond pipetteren apparaten (oogbescherming bij het buigen injectienaald of het breken van glas naald). Doorprik de dooiervlies buiten de omtrek van de blastoderm en de punt van de naald onder de embryo schuiven, dichtbij het oppervlak van de dooier maar niet in de embryonale lagen (Figuur 2B). Injecteer net genoeg inkt om het embryo te schetsen, dan voorzichtig de naald (figuur 2C). Het injecteren van te veel inkt kan leiden tot embryonale sterfte. Het is belangrijk om geen luchtbellen te injecteren onder het embryo, want dit kan een bron voor verontreiniging zijn. NB: Alle Ringer's oplossing in deze procedure wordt gesteriliseerd en bevat pen / strep zoals hierboven gedefinieerd. Steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) is ook een aanvaardbaar alternatief voor Ringer's in alle stappen van dit protocol.
8. Fase het embryo volgens Hamburger en Hamilton ⁶³ en noteer de etappe op de eierschaal in permanente inkt of potlood. Stages kunnen het best worden beoordeeld in het kader m³omicroscopy, met glasvezel "zwanenhals" lichtbronnen met een beperkte warmtelast hebben.
9. Breng 2-3 druppels warm steriele Ringer's oplossing aan het oppervlak van de embryo uitdroging en te voorkomen. Tijdelijk afdichten het venster met parafilm gespannen over het oppervlak van het ei.
10. Herhaal de stappen 2.2-2.9 met alle chick eieren voor het begin van de transplantatie-experimenten.
11. Aangezien kwartel embryo's alleen gebruikt voor donor weefsels, in ovo stappen 2.2-2.9 worden weggelaten. Voor ex ovo voorbereiding van de donor embryo's, zijn kwarteleitjes geïncubeerd botte kant op en deed in deze regio met gebogen tang om het embryo te onthullen. Met behulp van het ontleden van een schaar, maken vier sneden in de vorm van een vierkant door het vitelline membraan en blastoderm buiten het embryo (zorg ervoor dat alle zaagsneden elkaar ontmoeten). Met behulp van een gebogen iris pincet voorzichtig Pak een snijrand en til het embryo uit het ei en overbrengen naar Ringers oplossing in een petrischaal. Alternatief kan men de curved iris tang het uitgesneden embryo optillen onder of een embryo lepel of plastic transferpipet doorgesneden het brede deel van de cilinder kan worden gebruikt om de embryo-transfer van het ei. Verwijder voorzichtig de vitelline membraan met # 5 tang. Verzamel de overgebleven embryo's kwartel als hierboven, en ensceneren ze onder een stereomicroscoop.

3. Bereid de gastheer embryo aan het transplantaat te ontvangen

1. Verwijder Parafilm van de host (kuiken) embryo's en het gebruik van een geslepen wolfraam naald of pincet # 5, scheur een klein gaatje in de vitelline membraan op de gewenste regio van de neurale buis (figuur 3A).
2. Voeg een druppel Ringer het embryo. Zorg ervoor dat het embryo volledig ondergedompeld in Ringer's tijdens de gehele procedure om uitdroging van het weefsel te voorkomen houden. Blijven toevoegen druppels Ringer aan het oppervlak van de embryo via transferpipet indien nodig.
3. Met behulp van een getrokken glazen naald, met zorg te maken rostrale en caUdal dwarse incisies overeenkomt met de lengte en de regio van belang in de dorsale neurale buis. (Getrokken glas naalden worden gegenereerd silicium capillaire glazen buisjes die zijn onder hitte getrokken met een naald trekken inrichting.) Voor eenzijdige enten de insnijdingen alleen uit tot de lumen van de dorsale neurale buis, en bilaterale transplantaten, de insnijdingen te maken tussen de gehele dorsale neurale buis. Dan bilateraal knip tussen de dorsale neurale buis en de paraxiale mesoderm.
4. Voorzichtig de weggesneden explant te scheiden van de neurale buis en verwijder het uit het embryo door opzuigen in een glas micropipet (Figuur 3B).

4. Bereid de donor weefsel

1. Kies een podium voor elkaar onderdoen kwartel embryo. Houd het embryo naar beneden met AA tang, verwijder de vitelline membraan, en accijnzen een vergelijkbare grootte gebied van de neurale buis zoals hierboven beschreven (+3,3 tot 3,4) (figuur 3A'-B '). Afhankelijk van de behoeften van uw experiment, kan dit gebied eencomplementaire regio van de host (kuiken) neurale buis of uit een andere regio langs de Rostro-caudale as. (NB: voor grotere regionale enten, met inbegrip van volledige neurale buis enten, kunnen onderzoekers willen een protease spijsvertering toe te voegen aan deze stap om alle aanhangend mesenchymale weefsel van de donor weefsel voor transplantatie te verwijderen Echter, voor kleine dorsale neurale buis enten in een vroeg stadium. , zoals hier beschreven, protease spijsvertering is niet nodig omdat de neurale buis is gemakkelijk gescheiden van aangrenzende mesenchym door een strikte chirurgische technieken.)

5. Graft het weefsel

1. Zuig de donor in een glazen explantaat micropipet met Ringer's oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen te introduceren in de pipet.
2. Breng het explantaat naast het uitgesneden deel van het kuiken gastheer. Met behulp van getrokken glas naald, de explant oosten en voorzichtig de weg wijzen naar het te verdampen regio (Figuur 3C).
3. Voeg voorzichtig een paar druppels van de oplossing Ringer'sde embryo uitdroging. Zorg ervoor dat het niet laat vallen vloeistof rechtstreeks op het transplantaat site als dit kan de graft te verwijderen.
4. Sluit het venster met verpakkingstape. Zorg ervoor dat de band sluit de hele regio van de windowed ei. Dit voorkomt uitdroging en contaminatie van het embryo tijdens verdere incubatie.
5. Breng het ei naar de couveuse tot het gewenste podium. Zorg ervoor dat de "rockende"-functie wordt uitgeschakeld terwijl het incuberen van de hersenschimmen. Eieren kan ze voorzichtig met de hand gedraaid twee keer per dag, dit kan de houdbaarheid ervan toenemen als de latere stadia van ontwikkeling zijn gericht.

6. Bereid chimere embryo's voor het snijden

1. Bij de experimentele eindpunt, snijdt u het tape op het raam met behulp van fijne schaar.
2. Pak de rand van de blastoderm met gebogen iris pincet (makkelijkst te maken met gekartelde tips), dan weggesneden het embryo uit de dooier met 4 grote stukken buiten de grenzen van de blastoderm.
3. Breng het embryo een Petri schaal die Ringer's oplossing. Zorg ervoor dat blootstelling van het embryo naar de lucht te minimaliseren, om uitdroging van het weefsel te voorkomen.
4. Onder stereomicroscopie voorzichtig scheiden de vitelline membraan van de blastoderm met behulp van # 5 tang.
5. Voorzichtig te regelen het embryo in de schaal, zodat het embryo zich in dezelfde richting als het was in het ei, met omliggende membranen aangelegd vlak.
6. Gebruik ontleden naalden uit wolfraam draad ⁶⁴ van de omgeving blastoderm zuiver uit het embryo aanbrengen van de naald op de grens van het embryo en extra-embryonale weefsels met de lengte van de wolfraamdraad evenwijdig aan de bodem van de schaal. Gebruik een zachte zagende beweging om door de weefsels.
7. Verwijder voorzichtig het amnion met # 5 tang. Op dit punt kan, wil of verder te ontleden de regio van uw interesse, of laat de embryo geheel.
8. Breng de embryo tot ijskoude 4% paraformaldehyde en rock overnacht bij 4 ° C.
9. Bereid monsters en insluiten voor cryo-of paraffine snijden.

Trace de geënte weefsel in de gastheer embryo. Er zijn verschillende technieken voor het identificeren van kwartel weefsel in een kuiken embryo, met inbegrip van detectiemethoden van kwartels nucleoli door hematoxyline kleuring (kwartel kernen hebben een zeer grote, donkere vlekken insluitsels dan chick kernen), de Feulgen-Rossenbeck reactie, acridine-oranje of biz-benzamide vlek in combinatie met elektronenmicroscopie, of immunokleuring voor kwartels-specifieke antigenen ^3,47,65,66. Hier gebruiken we QCPN antigeen en standaard hele-mount of sectie immunofluorescentie technieken om kwartel neurale lijst cellen te identificeren in de kwartel-chick hersenschimmen (figuur 4). Deze techniek biedt de flexibiliteit experimentele ontwerp als QCPN immunofluorescentie kan ook worden gecombineerd met andere antilichamen gedifferentieerde cellen van de donor (kwartel) weefsel vast. Gebruik Standard hele-mount of sectie immunofluorescentie technieken om kwartel-afgeleide cellen te labelen in hersenschimmen.

7. Representatieve resultaten

Een representatief beeld van de geënte gebied van neurale buis na 6 uur incubatie van re-(tot HH11) toont verwacht opnemen van de geënte donor (kwartel) weefsel in de gastheer (kuiken) neurale buis (Figuur 4A). Embryo's met onvolledige integratie van het transplantaat, of asymmetrische ontwikkeling van de schedel of somieten na reincubation moet worden weggegooid.

Doorsnede de geënte regio in HH11 tonen NCC voorzien HNK-1 migreren zijdelings van de neurale buis. Quail cellen die bijdragen aan de NCC migratiestroom en de neurale buis, duidelijk voorzien QCPN (Figuur 4B).

In een later stadium kan kwartel NCC-afgeleide cellen worden herleid tot hun uiteindelijke doel weefsel. QCPN gelabelde cellen worden afgewisseld binnen het kippenembryo mesenchymvan de bovenkaak proces E5 (Figuur 4C).

De QCPN antilichaam kan eenvoudig worden gecombineerd met andere antilichamen tegen de differentiatie van de kwartel-afgeleide NCC's in de ontvangende omgeving te onderzoeken. Quail NCC-afgeleide trigeminus sensorische neuronen worden gelabeld door QCPN en Tuj1 antilichamen (Figuur 4D).

Figuur 1. Overzicht van de experimentele procedure en de nodige instrumenten. A) Host (kuiken) en donor (kwartel)'s moeten het podium op elkaar afgestemd. Om het etiket van de NCC stroom die bijdraagt ​​aan de trigeminus ganglion en maxillo-mandibulaire regio, HH9 is ideaal. Op HH9, is de neurale buis begint te sluiten in de rostrale regio, maar is nog niet volledig afgesloten. De grijze lijn in het schema staat voor de middellijn van het sluiten neurale buis. De gestippelde witte lijnen geven de cut lijnen voor uitsnijden van een middenhersenen gebied van de rechterkant van de neurale buis van de gastheer en donor embryos. Het gezuiverde gebied van de gastheer embryo wordt verwijderd en het donorweefsel getransplanteerd in de chimeer embryo te genereren. B) Noodzakelijke instrumenten zijn onder meer: ​​a) 5 ml spuit met 18 ½ G injectienaald, b) 1 ml spuit met 26 ½ G injectienaald gebogen op 45 °, c) Oost-Indische inkt, d) duidelijke verpakkingstape, e) glazen pipet met de mond pipetteren apparatuur, f) 60 mm-petrischaal, g) AA-tang, h) gebogen iris pincet met gekartelde tips, i) # 5 tang, j) fijne schaar, k) verscherpt wolfraam draad, l) getrokken glazen naald, m) parafilm pleinen.

Figuur 2. Voorbereiding van de eieren en embryo's. A) Cross-doorsnede van het ei, ook ideaal invoegpunt van 18 ½ G injectienaald voor de intrekking van het licht albumine. B) Na het intrekken van ~ 3 ml van het licht albumine, de dooier en embryo verlaagt in het ei, waardoor de onderzoekers om een ​​"venster" (pijlen) snijden in thij eierschaal om het embryo te openen. India inkt 1:10 verdund in oplossing steriele Ringer's kan vervolgens geïnjecteerd worden onder de blastoderm om contrast gemakkelijk opvoeren van de embryo's. C) Chick embryo na inkten.

Figuur 3. Schematische en voorbeelden van HH stadium 9 donor-en gastheer embryo's bij elke stap van het enten procedure. A) Chick gastheer embryo. Onderbroken lijnen in het diagram geeft aan waar de vitelline membraan moet worden verscheurd tot de schedel voor het enten te openen. Zodra gescheurd de driehoekige flap van vitelline membraan moet caudaal worden geschild. Box in beeld geeft aan inzet in (BC). A ') Kwartel donor embryo. Afbeelding is van donor embryo uitgesneden uit ei en geplaatst in Petri-schaal voor dissectie van het transplantaat weefsel. Box in beeld geeft aan inzet in (B '). Stippellijnen in schema (A ') geven aan waar de vitelline en de dooier membranen moeten worden gesneden om t te verwijderenhij embryo uit het ei. B) Host embryo met een unilaterale middenhersenen regio weggesneden neurale buis (witte pijlen) in afwachting van graft. Stippellijn in schema geeft aan waar sneden moeten worden aangebracht accijnzen de neurale buis in de middenhersenen regio. B ') Donor embryo met dorsale neurale buis graft weefsel weggesneden (graft weefsel aangegeven met zwarte pijlen). Gestippelde lijn in de grafiek geeft aan waar sneden dient te geschieden in de kwartel embryo aan accijns de donor weefsel voor eenzijdige enten van de middenhersenen gebied van de neurale buis. C) chimeer embryo na de transplantatie van kwartels dorsale neurale buis explant in het kuiken middenhersenen regio.

Figuur 4. Immunofluorescentie het detecteren van kwartel-specifieke nucleaire antigeen QCPN in donor-afgeleide cellen in de chimeer embryo. A) Hele-mount beeld van HH11 Chimera (geënt op HH9), waaruit blijkt QCPN kleuring in rood, en HNK-1 kleuring (een marker van migrerende NCC's) ingroen. 10X-, rug-uitzicht. B) Dwarsdoorsnede door middel van embryo's in (A), waaruit blijkt QCPN-positieve kwartel afgeleide cellen in de neurale buis en trekkende NCC co-gekleurd met HNK-1 (groen). 40X vergroting. C) Dwarsdoorsnede door maxillaire proces van E5 Chimera (gedurende 3 dagen na de graft), waaruit blijkt QCPN-positieve NCC-afgeleide cellen (rood) die zijn gemigreerd van de geënte gebied van de neurale buis op hun definitieve plaats in het embryo. 10X vergroting. D) punt door middel van E5 hersenschim met bijdrage van kwartel afgeleid NCC aan de trigeminus ganglion (rood) en differentiatie in TuJ1-positieve neuronen (groen). 40X vergroting. *, NCC's, MP, maxillaire proces; NT, neurale buis, TG, trigeminus ganglion.

Discussie

Het enten van kwartel neurale buis in gastheercellen kippenembryo's die hier beschreven is een eenvoudige en goedkope techniek voor het opsporen van specifieke subpopulaties van het migreren van NCC's afkomstig uit verschillende regio's langs de Rostro-caudale as ^21,67-69. Deze techniek maakt gebruik van de bereikbaarheid van aviaire embryo's (ten opzichte van zoogdieren embryo) en kan worden gecombineerd met andere technieken, zoals weefsel ablatie injectie remmende moleculen of genetische ma...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens	Vennootschap	Catalogusnummer
Chick eieren	Various - we gebruiken Texas A & M University's Poultry Science Department, TX.
Kwarteleitjes	Various - we gebruiken Ozarks Egg Company, MO.
Egg incubator (digitale uitlezing 1502 Sportsman Incubator w / Vochtigheid 110-120 Volt AC)	www.poultrysupply.com	1502
Dumont AA tang, Inox epoxy-coating	Fine Science Tools	11210-10
Plakband	Elke kantoorboekhandel
Gebogen Iris tang	Fine Science Tools	11065-07
Ikndia inkt	Elke kunst aanbod op te slaan
Pen / Strep (penicilline, streptomycine) Oplossing	VWR International	101447-068
Duidelijke verpakkingstape	Elke kantoorboekhandel
Naald trekken apparatuur	Narashige, Japan	PE-21
Getrokken glas naald, gemaakt +1,5 tot +1,8 x 100mm borosilicaatglas capillair	Kimble achtervolging	34500 99
Getrokken glazen pipet, gemaakt van 5 ¾ "Pasteur pipet	Fisher Scientific	13-678-6A
Mond pipet apparatuur (aspirator buis assemblage voor gekalibreerd microcapillaire pipet)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont # 5 tang	Fine Science Tools	11251-30
Vatgsten draad, 0,1 mm diameter	VWR International	AA10404-H2
Naaldhouders (Vernikkelde penhouder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank, de Universiteit van Iowa	QCPN
Alexa Fluor secundair antilichaam (bijv. Alexa Fluor 594 geit anti-muis IgG 1)	Invitrogen	A21125
Ringer-oplossing (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na 2 HPO 4 0,04 g KH 2 PO 4 DDH 2 O tot 2L Filter en autoclaaf	Alle reagentia van Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0