Hier beschrijven we de eerste Good Manufacturing Practice (GMP)-compatibele werkwijze voor het produceren van virus-specifieke cytotoxische T lymfocyten (CTL) uit navelstrengbloed een bron voornamelijk naïeve T-cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Uitbreiden cytotoxische T-lymphocyten uit navelstrengbloed dat Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, en Adenovirus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Virus infecties na stamceltransplantatie behoren tot de meest voorkomende oorzaken van sterfte, vooral na navelstrengbloed (CB) transplantatie (CBT), waar de CB bevat geen aanzienlijke aantallen van virus-ervaren T-cellen die de ontvanger kan beschermen tegen infectie 1. - 4 Wij en anderen hebben aangetoond dat virus-specifieke CTL gegenereerd uit seropositieve donoren en toegediend aan de ontvanger veilig en beschermend. 5-8 Tot voor kort, virus-specifieke T-cellen niet kunnen worden gegenereerd uit navelstrengbloed, waarschijnlijk door de Aangezien virus-specifieke geheugen T-cellen.
In een poging om beter na te bootsen in vivo priming omstandigheden van naïeve T-cellen hebben we een methode die gebruikt CB-afgeleide dendritische cellen (DC) getransduceerd met een adenovirale vector (Ad5f35pp65) met de immunodominante CMV pp65 antigen dus een T celspecificiteit in de richting van CMV en adenovirus. 9 Bij initiatie, gebruiken we deze mareerde DCs als CB-afgeleide T-cellen in aanwezigheid van de cytokinen IL-7, IL-12 en IL-15. 10 Op de tweede stimulatie we EBV-getransformeerde B-cellen of EBV-LCL, die zowel uitdrukken latente en lytische EBV-antigenen. Ad5f35pp65-getransduceerde EBV-LCL worden gebruikt om de T cellen te stimuleren in aanwezigheid van IL-15 bij de tweede stimulatie. Volgende stimulaties gebruik Ad5f35pp65 getransduceerde EBV-LCL en IL-2.
Van 50x10 6 CB mononucleaire cellen kunnen wij ruim 150 x 10 6 virus-specifieke T-cellen die antigen-gepulseerde doelen en afgifte cytokines lyseren in reactie op antigene stimulatie genereren. 11 Deze cellen werden in een GMP-compatibele wijze met alleen de 20% fractie van een gefractioneerde navelstrengbloed en zijn vertaald voor klinisch gebruik.
Protocol
1. Mononucleaire cellen Isolatie (dag 0)
- Plaats spike van vrouwelijke luer adapter in uitlaatpoort van de 20% fractie van de navelstrengbloed, sluit spuit en verwijder bloed. Overdracht ontdooid bloed 20 ml verwarmd RPMI in 50 ml centrifugebuis. Spoel navelstrengbloed zakje met 5 ml RPMI en transfer naar dezelfde centrifugebuis.
- Centrifugeer cellen gedurende 10 minuten bij 400 x g. Aspireren supernatant.
- Resuspendeer cellen in 20 ml warm RPMI. Laag cellen op 15 ml Lymphoprep in 50 ml centrifugebuis. Centrifugeer 40 minuten bij 400 x g.
- Oogst de interface met de mononucleaire cellen en was in 20 ml RPMI. Centrifugeer gedurende ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Huidige strategieën gericht op de beheersing virale infecties na CBT kan effectief zijn, maar ze geassocieerd met significante toxiciteit, zijn duur en niet verlenen langdurende bescherming tegen infectie later. In feite kan het gebruik van een aantal antivirale middelen beperkt de groei van virus-specifieke T-cellen die anders beschermende 14. Een andere mogelijkheid is de infusie van donor afgeleide virus-specifieke T cellen. Wij en anderen hebben aangetoond dat T cellen Hier veilige, effectieve en re.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een Dan L. Duncan collaboratief onderzoek subsidie (CMB en EJS), het National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), een leukemie en lymfoom Society Clinical Research Scholar Award (CMB), en het National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 21870-076 | |
| DC media | CellGenix | 20801-0500 | |
| EHAA (Instructies's Medium) | Irvine Scientific | 9195 | |
| Human Serum | Tweeling Bio Products | 100 tot 110 | |
| Zuurstofdoorlatende Cultureware 18 | Wilson-Wolf | 80040S | |
| IL-2 | Chiron (TCH Apotheek) | ||
| IL-12 | NCI / CTEP | ||
| IL-15 | CellGenix | 1013-050 | |
| IL-7 | R & D- | AFL207 | |
| IL-1beta | R & D- | AFL201 | |
| IL-6 | CelGenix | 1004-050 | |
| GM-CSF | TCH Apotheek | ||
| IL-4 | R & D- | AFL204 | |
| TNF-alpha | R & D- | AFL210 | |
| Ad5f35pp65 | BCM CAGT Vector Production Facility | ||
| Plasma overdracht set met vrouwelijke luer adapter | Charter Medical | 89-550-66j | |
| Lymphoprep | Nycomed | 1114550 |
Referenties
- Kennedy-Nasser, A. A. Comparable outcome of alternative donor and matched sibling donor hematopoietic stem cell transplant for children with acute lymphoblastic leukemia in first or second remission using alemtuzumab in a myeloablative conditioning regimen. Biol. Blood Marrow Transplant. 14, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
