Methodenartikel

In vitro Vergadering van Semi-kunstmatige moleculaire machine en het gebruik ervan voor de detectie van DNA-schade

DOI:

10.3791/3628

⸱

11 januari 2012

 , 
1Neurosurgery, Baylor College of Medicine , 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center, 3Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tonen we de montage en de toepassing van een moleculaire schaal apparaat aangedreven door een topoisomerase eiwit. Het construct is een bio-moleculaire sensor die twee belangrijke soorten van DNA breuken in weefselcoupes labels door het aanbrengen van twee verschillende fluoroforen om hun doel.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natuurlijk voorkomende bio-moleculaire machines het werk in elke levende cel en tonen een verscheidenheid van ontwerpen 1-6. Toch is de ontwikkeling van kunstmatige moleculaire machines richt zich op apparaten die in staat van directionele beweging, dat wil zeggen moleculaire motoren, en op hun verkleinde mechanische onderdelen (wielen, assen, hangers, enz.) 7-9. Dit imiteert de macro-machines, hoewel de fysische eigenschappen van essentieel belang voor deze apparaten, zoals de inertie en het behoud momentum, niet kunnen worden gebruikt in de nanowereld omgevingen 10. Alternatieve ontwerpen, die zich niet aan de mechanische macromachines schema's en maken gebruik van mechanismen ontwikkeld in de evolutie van biologische moleculen, kunnen profiteren van de specifieke omstandigheden van de nanowereld. Trouwens, de aanpassing van de werkelijke biologische moleculen voor de doeleinden van nano-ontwerp vermindert de potentiële gevaren van nanotechnologie producten kan opleveren. Hier laten we zien de montage en de toepassing van een dergelijke bio-enabled te bouwen, zoalsemi-kunstmatige moleculaire apparaat dat een natuurlijk voorkomende moleculaire machine combineert met kunstmatige componenten. Vanuit het enzymologie oogpunt onze construct is een designer fluorescent enzyme-substraat complex in elkaar gezet om een ​​specifieke nuttige functie uit te voeren. Deze montage is per definitie een moleculaire machine, want het bevat een 12. Toch, de integratie met de kunstmatige gedeelte - TL dual haarspeldbochten - opnieuw leidt het naar een nieuwe taak voor de etikettering DNA-schade 12.

Onze bouwen assembleert uit een 32-mer DNA en een enzym topoisomerase I vaccinia (VACC TOPO). De machine maakt gebruik van dan zijn eigen materiaal te fabriceren twee fluorescent gelabelde detector eenheden (figuur 1). Een van de eenheden (groene fluorescentie) draagt ​​VACC TOPO covalent gebonden aan de 3 'uiteinde en een andere unit (rode fluorescentie) is een gratis haarspeld met een terminale 3'OH. De units zijn van korte duur en al snel weer opnieuw samen in de originele constructie, die vervolgens recleaves.Bij het ontbreken van DNA breuken deze twee eenheden continu scheiden en religate op een cyclische manier. In weefsel secties met DNA-schade, de topoisomerase-dragende detector unit selectief hecht aan stompe DNA breekt met 5'OH (DNase II-type breaks) 11,12, fluorescent te labelen. De tweede, enzym-vrij hairpin gevormd na oligonucleotide splitsing, zal ligeren aan een 5'PO 4 stompe break (DNase I-type breaks) 11,12, als T4 DNA-ligase is in de oplossing aanwezig 13,14. Bij de T4 DNA-ligase wordt toegevoegd aan een tissue sectie of een oplossing met DNA met 5'PO 4 stompe pauzes, de ligase reageert met 5'PO vier DNA-uiteinden, de vorming van semi-stabiele enzym DNA-complexen. De stompe eindigde haarspeldbochten zullen omgaan met deze complexen het vrijgeven van ligase en covalent koppelen van haarspelden aan DNA, waardoor de etikettering 5'PO 4 stompe DNA-breuken.

Deze ontwikkeling is een voorbeeld van een nieuwe praktische benadering van ee ontwerp van moleculaire machines en biedt een nuttig sensor voor detectie van apoptose en DNA-schade in vaste cellen en weefsels.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De secties van de moleculaire machine-gebaseerde detectie moeten eerst worden opgesteld omdat de voorbereiding meer tijd kost dan de montage van de moleculaire apparaat. Het construct werkt goed met 5-6μm dikke secties gesneden uit paraformaldehyde-gefixeerde, in paraffine ingebed weefsel blokken. Gebruik slide merken die secties te behouden en, zoals ProbeOn Plus geladen en voorgereinigde dia's (Fisher Scientific) of iets dergelijks. We raden aan om het eerste gebruik van een weefsel met een bekende patroon van DNA-schade die zowel DNase I-en II DNase-type breaks bevat, zoals dexamethason behandelde ratten apoptotische thymus 13,14.

1. Voorbereiding van de secties

  1. Plaats de secties in een dia rack en dewax in xyleen gedurende 15 minuten, over te dragen aan een nieuwe xyleen bad voor een extra 5 minuten.
  2. Hydrateren door het passeren door ethanolreeks concentraties: 96% Ethanol-2x5min, 80% Ethanol - 5min, water - 2x5 minuten.
  3. Digest sectie met Proteinase K. Gebruik 100μL van een 50μg/mL oplossing per sectie. Incubeer 15 'bij kamertemperatuur (23 ° C) in een vochtige kamer. De tijd kan nodig zijn aangepast, afhankelijk van het weefseltype. Harde weefsels zou kunnen vereisen langer spijsvertering. Tijden van 15-25 min worden meestal gebruikt. Onvoldoende spijsvertering kan leiden tot de zwakkere signaal. Overdigestion aan de andere kant resulteert in een signaal verdwijning en verstoring sectie.
  4. Spoel in gedistilleerd water voor 2x10 minuten.
  5. Breng 100 pi per sectie van 2% BSA voor preblocking. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (23 ° C). Gedurende deze tijd verzamelen de moleculaire machine.

2. Moleculaire machines montage

Alle reagentia worden geschaald voor 25 uL totale volume, wat voldoende is voor een detectie in een gemiddelde grootte weefselsectie (10x10mm). Het volume kan worden opgeschaald als dat nodig is.

  1. Combineren in een klein plastic buisje in deze volgorde:
  1. Dubbelgedestilleerd water;
  2. 15% polyethyleenglycol-8000;
  3. Oplossing van 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, (dwz reguliere T4 DNA-ligase buffer);
  4. 70 pmol van een oligonucleotide,
  5. 215 pmol (1,76 tot 7,1 ug) VACC TOPO
  6. 10 eenheden T4 DNA-ligase (500 U / ml)
  1. Meng voorzichtig door pipetteren. De moleculaire vrijwel direct zelf-assembleert bouwen in deze oplossing en kan onmiddellijk worden gebruikt bij kamertemperatuur (23 ° C). Het verhogen van de temperatuur tot 37 ° C blokkeert de T4-DNA ligase-gebaseerde component van de etikettering.

3. Met behulp van moleculaire machines in weefselcoupes om dual label 5'OH en 5'PO4 DNA-breuken

  1. Zuig het preblocking oplossing en toe te passen 25μL van de volledige reactiemengsel met 70 pmol van Oligonucleotide 1, 53 tot 215 pmol (1,76 tot 7,1 ug) VACCTOPO en 10 eenheden T4 DNA-ligase (500 U / ml) in een oplossing van 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5mM MgCl2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, en 15% polyethyleenglycol-8000. Dezelfde volgorde oligonucleotide die een enkele FITC label, Oligonucleotide 2, in plaats daarvan kan worden gebruikt voor de detectie van een enkel type van DNA breuken. In een dergelijk geval weglaten ligase uit de etikettering reactie. Ook in deze situatie een oplossing van 50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 15% PEG-8000 kan worden gebruikt in plaats van T4 DNA-ligase buffer.
  2. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (23 ° C) in een vochtige kamer met een plastic dekglaasje aan. Beschermen tegen licht. Verlaging van de temperatuur tot 16 ° C vermindert het ligase-gebaseerde signaal; de temperatuur te verhogen tot 37 ° C volledig elimineert het ligase-based signaal. Een gedeeltelijke inhibitie van ligase komt soms in de reactie mix, mogelijk als gevolg van verontreinigingen geïntroduceerd met topoisomerase voorbereidingen. Daarom kan langere incubatietijd (2-4 uur) worden vooral nodig bij significant aantallen ligase-gelabeld pauzes aanwezig zijn. Hoewel zowel ligase en Topo-signalen kunnen worden waargenomen in dit stadium, in veel gevallen de ligase signaal kan verder verbeterd door opnieuw de toepassing van de reactie mix zonder VACC TOPO en dual-gelabelde oligonucleotide, maar met een haarspeld vorm van oligonucleotide (Oligonucleotide 3) (35 mg / ml) en T4 DNA-ligase (250 U / ml). Ter versterking van het signaal verder met stap 3, om de reactie te zien zonder verhoging naar stap 5 te gaan.
  3. Verwijder de dekglaasjes door voorzichtig het onderdompelen van de dia's verticaal in een Coplin pot met water op kamertemperatuur. Aspiratie overtollig water.
  4. Verbeter ligase signaal door het aanbrengen van 25 pi van het reactiemengsel zonder VACC TOPO en Oligonucleotide 1, maar met Oligonucleotide 3: 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM dithioerythritol, 1 mM ATP, en 15% polyethyleenglycol- 8000, 5 eenheden T4 DNA-ligase, 35 mg / ml Oligonucleotide 3 (stomp eindigde haarspeld). Het totale volume van de etikettering oplossing can worden opgeschaald naar de grotere secties tegemoet te komen. Incubeer 18 uur ('s nachts) bij kamertemperatuur (23 ° C) in een vochtige kamer met een plastic dekglaasje aan.
  5. Verwijder de dekglaasjes door voorzichtig het onderdompelen van de dia's verticaal in Coplin pot met water op kamertemperatuur. Was daarna sectie 3x10 min in gedestilleerd water.
  6. Spoelen met natriumbicarbonaat buffer. Alkalische oplossing spoel verbetert FITC fluorescentie, dat is pH gevoelig en is aanzienlijk minder dan pH 7.
  7. Afdekprofiel met een antifading oplossing (Vectashield met DAPI), dekglaasje en analyseren van het signaal met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Dubbel-strengs DNA breekt met 5'OH zal fluoresceren groen, 5'PO 4 breaks - zal fluoresceren rood (figuur 2).

4. Representatieve resultaten

figure-protocol-1
Figuur 1. Semi-kunstmatige moleculaire machine detecteert twee soortenDNA-schade in situ. De fluorescerende machine zelf-assemblage bij VACC TOPO bindt aan de dubbel-haarspeld 32-mer. De machine begint te werken door het splitsen zich in twee detector-eenheden via topoisomerase-en-klare afsnijden aan het eind van de drie 'van de herkenningssequentie. Dit resulteert in een cyclisch proces waarbij de FITC-gelabelde unit continu scheidt en religates terug naar de rhodamine-gelabelde eenheid. Deze blijft bestaan ​​tot een detecteerbaar DNA-breuk wordt aangetroffen. Wanneer een dergelijke alternatieve acceptor (5'OH stompe uiteinde DNA pauze) aanwezig is in het weefsel sectie, zal de FITC deel ligeren aan. Het resterende deel zal rhodamine hechten aan 5 'PO 4 DNA stompe uiteinde breekt met de hulp van T4 DNA-ligase. Daarom worden beide soorten van DNA breuken tegelijk gedetecteerd.

figure-protocol-2

Figuur 2. Moleculaire machine dubbele etiketten twee soorten van DNA breukenin een weefsel sectie van dexamethason behandelde thymus. Stompe DNA-breuken van DNase I-en II-DNase type worden gedetecteerd in de thymus corticale gebieden ondergaan apoptose. Groene cytoplasmatische fluorescentie (5'OH DNA-breuken) markeert corticale macrofagen verteren van nucleair materiaal van apoptotische thymocyten. Dit signaal wordt geproduceerd door VACC TOPO, en lokaliseert te phagolysosomes met DNA dat 5'OH dubbel-breuken 11,12. Rode fluorescentie (5'PO 4 pauzes) labels kernen van apoptotische thymocyten niet overspoeld door macrofagen. Massaal van thymocyten tegelijk ondergaan apoptose begeleid door generatie van 5'PO 4 dubbel-breuken, gevisualiseerd door ligase op basis van labeling. Deze pauzes zijn gelegen aan de nucleaire periferie, het vormen van ring-vormige patronen. Alle mobiele kernen zijn gevisualiseerd door tegenkleuring met DAPI (blauwe fluorescentie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze video laten we zien hoe in elkaar te zetten en gebruik maken van een dual-etikettering van DNA-schade sensor. De sensor is een moleculaire machine aangedreven door bio-moleculaire motor, een virus-gecodeerde eiwit VACC TOPO verbonden met kunstmatige componenten. De gepresenteerde ontwikkeling een voorbeeld van een bio-enabled aanpak die biologische structuren, architecturen en de werkelijke onderdelen en componenten van cellen advocaten aan te passen aan het ontwerp van niet-toxische moleculaire schaal apparaten...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidie ​​R01NS062842 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health (VVD) en door subsidies R21 NS064403 van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke, National Institutes of Health door middel van ARRA (VVD) en R21 EB006301 Nationaal Instituut voor Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health (VVD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

  1. Xyleen
  2. 80 en 96% ethanol.
  3. 2% oplossing van bovine serum albumine (BSA) in gedestilleerd water.
  4. Oligonucleotide 1: een dubbel-haarspeld, dubbele gelabeld met fluoresceïne en tetramethylrodamine:

5'-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT R AT GCG TT-3 '; F - FITC-dT, R - tetramethylrodamine-dT. Andere rode verschoven fluoroforen zoals BODIPY TR, rhodamine of Tamra kan in plaats van tetramethylrodamine worden gebruikt als R.

Als alternatief kunt u gebruik maken Oligonucleotide 2 -. Een dubbele haarspeld single gelabeld met fluoresceïne (voor detectie van een enkel type van DNA breuken (DNase II-type) De single-fluorofoor-probe die is aanzienlijk minder duur en is handig wanneer een enkele soort DNA-break is geëtiketteerd te worden: 5'-GGA AAG CCT GC F GCA GGT CCC TTA ACG CAT ATG CGT T-3 '; F - FITC-dT

  1. Oligonucleotide 3. Stompe rhodamine-gelabeld haarspeld voor de verbetering van de in situ ligatie signaal met T4 DNA-ligase: 5'-GCG CTA GAC C R G GTC TAG CGC-3 ', R - tetramethylrodamine-dT
  2. Vaccinia DNA-topoisomerase l (VACC TOPO) - 3000 U / ul (Levendig Technologies). In de eerste experimenten gebruikten we 215 pmol (7,1 pg) van de VACC TOPO per elke 25 pi van de reactie mix. Echter, de topoisomerase concentratie aanzienlijk worden verminderd zonder verlies van gevoeligheid. We later gebruik gemaakt van een vier keer kleinere hoeveelheid VACC TOPO per sectie (1,76 microgram in 25 pi van het reactiemengsel per sectie) met vergelijkbare resultaten. Het verminderen van hoeveelheid van het enzym tot 880 ng (in 25 pi van het reactiemengsel) resulteerde in een zwakker signaal en 8,8 ng van VACC TOPO leverde geen detecteerbaar signaal.
  3. T4 DNA-ligase 5 U / pl (Roche). Deze zeer geconcentreerde ligase voorbereiding geeft het beste signaal in onze experimentele omstandigheden.
  4. 10 x reactiebuffer voor T4 DNA ligase: 660 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2, 10 mM dithioerythritol, 10 mM ATP, pH 7,5 (20 ° C) (Roche). ATP in reactie buffer wordt gemakkelijk vernietigd in zich herhalende cycli van ontdooien-invriezen. Aliquot de buffer in kleine porties 15-20 il en op te slaan bij - 20 ° C. een keer gebruiken.
  5. 30% (w / v) oplossing van de PEG-8000 (Sigma) in dubbelgedestilleerd water. 15% PEG-8000 in het reactiemengsel stimuleert sterk de detectie, het verhogen van de effectieve concentratie van de bestanddelen in volume uitsluiting.
  6. Proteinase K (Roche) 20 mg / ml stockoplossing in gedestilleerd water. Bewaren bij - 20 ° C. In de reactie te gebruiken 50mg/mL oplossing in PBS, bereid uit de voorraad. Geen hergebruik.
  7. Vectashield met DAPI (Vector Laboratories).
  8. Natriumbicarbonaat buffer: 50 M NaHCO 3, 15m M NaCl, pH 8,2.
  9. 22x22mm of 22x40mm glas of plastic dekglaasjes. Plastic coverslips zijn te verkiezen tijdens de reactie, omdat ze eenre makkelijker te verwijderen uit de sectie.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meacham, G. C., Patterson, C., Zhang, W., Younger, J. M., Cyr, D. M. Nature. Cell. Biol. 3, 100-105 (2001).
  2. Schuldt, A. Dynamic Pol expeditions. Nature. Cell. Biol. 4, E279-E279 (2002).
  3. Urry, D. W. Molecular machines: how motion and other functions of living organisms can result from reversible chemical changes. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32, 819-841 (1993).
  4. Schneider, T. D. Theory of molecular machines I. Channel capacity of molecular machines. J. Theor. Biol. 148, 83-123 (1991).
  5. McClare, C. W. Chemical machines, Maxwell's demon and living organisms. J. Theor. Biol. 30, 1-34 (1971).
  6. Spirin, A. S. Ribosome as a molecular machine. FEBS Lett. 514, 2-10 (2002).
  7. Fabbrizzi, L., Foti, F., Licchelli, M., Maccarini, P. M., Sacchi, D., Zema, M. Light-emitting molecular machines: pH-induced intramolecular motions in a fluorescent nickel(II) scorpionate complex. Chemistry. 8, 4965-4972 (2002).
  8. Drexler, K. E. Nanosystems: Molecular Machinery, Manufacturing and Computation. , Wiley. New York. (1992).
  9. Freitas, R. A. Nanomedicine: basic capabilities. , Landes Bioscience. Austin. (1999).
  10. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31, 1106-1121 (2001).
  11. Minchew, C. L., Didenko, V. V. Fluorescent probes detecting the phagocytic phase of apoptosis: enzyme-substrate complexes of topoisomerase and DNA. Molecules. 16, 4599-4614 (2011).
  12. Didenko, V. V., Minchew, C. L., Shuman, S., Baskin, D. S. Semi-artificial fluorescent molecular machine for DNA damage detection. Nano. Letters. 4, 2461-2466 (2004).
  13. Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Presence of double-strand breaks with single-base 3' overhangs in cells undergoing apoptosis but not necrosis. J. Cell Biol. 135, 1369-1376 (1996).
  14. Didenko, V. V., Tunstead, J. R., Hornsby, P. J. Biotin-labeled hairpin oligonucleotides. Probes to detect double-strand breaks in DNA in apoptotic cells. Am. J. Pathol. 152, 897-902 (1998).
  15. Jones, R. A. L. Soft Machines: Nanotechnology and life. , Oxford University Press. USA. (2007).
  16. Samejima, K., Earnshaw, W. C. Trashing the genome: Role of nucleases during apoptosis. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 677-688 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Assemblage van moleculaire machinesdetectie van DNA schadeVaccinia topoisomerasefluorescerende hairpin eenhedenpreparatie van weefselcoupesProteinase K digestieT4 DNA ligasestompuiteindige breukendetectie van apoptosenanotechnologischesensor

Gerelateerde artikelen