Kwantificering van schimmelkolonisatie, Sporogenesis, en de productie van mycotoxinen Met behulp van Kernel Bioassays

Samenvatting

De verwoesting van de graangewassen door zaad-infecterende schimmels heeft ertoe geleid dat tal van onderzoeksinspanningen om beter te begrijpen plant-pathogeen interacties. Om zaad-schimmel interacties in een laboratorium te bestuderen, ontwikkelden we een robuuste methode voor de kwantificering van de schimmel reproductie, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen met behulp van kernel bioassays.

Samenvatting

Het rotten van granen door zaad-infecteren schimmels vormt een van de grootste economische uitdagingen voor graanproductie de hele wereld, niet aan ernstige risico's te vermelden mens en dier. Onder de productie van graan, maïs is waarschijnlijk de meest getroffen gewas, als gevolg van pathogenen geïnduceerde verliezen in graan integriteit en de mycotoxine zaad besmetting. De twee meest voorkomende en problematisch mycotoxinen voor maïs telers en levensmiddelen en diervoeders processors zijn aflatoxine en fumonisine, geproduceerd door Aspergillus flavus en Fusarium verticillioides, respectievelijk.

Recente studies in de moleculaire plant-pathogeen interacties hebben aangetoond belofte in het begrijpen van specifieke mechanismen in verband gebracht met plantaardige reacties op schimmelinfecties en verontreiniging met mycotoxinen ^1,2,3,4,5,6. Omdat veel labs gebruikt kernel assays van planten-pathogeen interacties te bestuderen, is er behoefte aan een gestandaardiseerde methode voor het kwantificeren verschillende biologische parameters, zodatde resultaten van verschillende laboratoria kan worden cross-geïnterpreteerd. Voor een robuuste en reproduceerbare middelen voor kwantitatieve analyses op zaden, hebben we in-lab kernel testen en de daarop volgende methoden om schimmelgroei, biomassa en verontreiniging met mycotoxinen te kwantificeren. Vier gesteriliseerd maïskorrels worden geïnoculeerd in glazen flacons met een schimmel suspensie (10 ⁶⁾ en gedurende een vooraf bepaalde periode. Monsterflesjes worden vervolgens geselecteerd voor de telling van conidia van hemocytometer, ergosterol biomassa op analyse van hoge prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), aflatoxine kwantificering met een AflaTest fluorometer methode en fumonisine kwantificering van HPLC.

Protocol

1. Maïs Kernel Bioassay

1. Twee weken vóór, kweken de schimmels op Potato Dextrose Agar (PDA) bij 28 ° C.
2. Selecteer kernels met een vergelijkbare grootte en vorm, bij voorkeur plat leggen zodat ze gelijk met de onderkant van bioassay flacons, en plaats in 50 ml Falcon buizen. Geselecteerd Kernels moet tegelijkertijd zijn geproduceerd in dezelfde omgeving vergelijkbare zaad leeftijd en metaboliet samenstelling te verzekeren.
3. Oppervlakte sterilisatie korrels door schudden buizen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met 70% ethanol, 1 minuut met steriel water en 10 minuten met 6% natriumhypochloriet. Spoel, drie keer, gedurende 5 minuten per keer, met steriel water en tegelijkertijd schudden. Pat kernels droog op geautoclaveerd handdoeken.
4. Om infectie van Aspergillus flavus vergemakkelijken, een kleine wond op het embryo-zijde met een 18 G naald om de diepte van 0,5 cm. Echter, in onze ervaring een grotere wond is nodig voor Fusarium verticillioides infectie. Therefore gebruik een scheermes om in de embryo-snijdt op een diepte van 0,5 mm.
5. Bereid inoculum suspensie door schrapen gekweekte platen in ongeveer 5 ml autoclaaf 0,01% Tween-20 oplossing sporen bevrijden en verwijderen mycelium door filtratie door zwaartekracht tenminste 4 lagen autoclaaf kaasdoek. Bereken spore concentratie met hemocytometer en aan te passen tot 10 ⁶ sporen / ml voor A. flavus of F. verticillioides. Bij gebruik van andere soorten pathogeen of gastheer, is het belangrijk om concentraties van inoculum evalueren passende infectie.
6. Maak een vochtige kamer in een plastic container (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) bekleed met vijf vellen papier handdoeken en 100 ml steriel water. Kamer is niet water-of luchtdichte en extra water moet worden toegevoegd het hele experiment te houden papieren handdoeken vochtig.
7. Plaats vier pitten in een autoclaaf 20 ml glazen scintillatieflesje en registreren hun massa. Inoculeren met 200 ul sporensuspensie,cap, en vortex gelijkmatig laag kernels met vering. Draai caps vrij zodat de lucht-uitwisseling en plaats ze in vochtige kamer.

Opmerking: zaden of schimmels andere dan de in deze methoden de hoeveelheid entmateriaal vereiste verschillend kunnen zijn en moet experimenteel bepaald worden.

8. Incubeer pitten onder een 12-h-light/12-h-dark fotoperiode bij 28 ° C gedurende 7 dagen of totdat de gewenste.

2. Conidia Enumeratie

1. Na de infectie periode, voeg 5 ml van geautoclaveerd 0,01% Tween-20 tot scintillatieflesjes met besmette kernels en vortex goed voor 1 minuut.
2. Een breed boring pipet onmiddellijk verdunnen overdracht twee 200 ul fracties van sporensuspensie in 2,0 ml Eppendorf buizen die 1,8 ml 0,01% Tween-20 (of verdun nodig afhankelijk infectie).
3. Telling tweemaal per 200 ul aliquot een hemocytometer ⁴Vergelijk niveaus van conidia tussen de behandelingen.

3. Aflatoxine Kwantificering

1. Voeg korrels uit een monster 50 ml blender cup met 20 ml 80% methanol en 0,05 g NaCl, deksel mengsel op hoge snelheid 1 min.
2. Plaats een vouwfilter over een schone collectie vat en giet-extract in de filter.
3. Breng 10 ml van filtraat over in een schone kuip, voeg 20 ml gedestilleerd H ₂ O, en meng goed.
4. Filter monster door een 1,5 um glas microvezel filter in een schone beker.
5. Breng 1 ml van de gefiltreerde extract tot afla Test kolom en, met behulp van perslucht, dwingen het gefiltreerde extract door de kolom met een snelheid van 1-2 druppels / seconde tot geleegd.
6. Was twee keer per kolom met 1 ml gedestilleerd H ₂ O en passeren kolom bij 1-2 druppel / seconde tot lucht komt door.
7. Elueer kolom met 1 ml van 100% HPLC-kwaliteit methanol bij een 1-2 druppel / seconde snelheid verzameld in een glazen cuvet.
8. Toevoegen1 ml afla Test Developer eluaat en meng goed. Plaats cuvet in gekalibreerd fluorometer en lees op 60 sec.

Let op: Bij gebruik van de Aflatest FGIS protocol, de meting van de fluorometer wordt berekend op basis van een eerste 50 gram van het monster geëxtraheerd in 100 ml. Als je kijkt naar de verdunning van het monster met water, de 1 ml toegepast op een kolom is 0,166 gram van het monster. Dus, bij het wijzigen van het protocol, moet u rekening houden met de verschillen in de steekproefgrootte en de eerste extractie-oplossing. Bijvoorbeeld, 2 gram korrels geëxtraheerd in 20 ml 80% methanol. Dit is 0,1 g / ml. Wanneer 1 ml van dit monster wordt gemengd met 2 ml water, het percentage van het monster in de vloeistof is nu 0,033 g / ml. Indien dit monster wordt een fluorometer lezing van 100 ppb, wordt de werkelijke concentratie van het gedeelte van het monster in 0.166, dat is ppb = (0,166 gram X 100 ppb) / 0,1 gram), of 166 ppb. Voor alternatieve aflatoxine kwantificeerbaarcatie methodes, zie referentie 7.

4. Fumonisine B1 (FB1) Analyse

1. Wanneer schimmel groeit op maïskorrels, extraheren monsters overnacht bij 10 ml acetonitril / water (50/50, v / v) bij kamertemperatuur zonder schudden. Vervolgens mengen extract (2 ml) met gedeïoniseerd water (6 ml) en dit mengsel toe te passen (8 ml) rechtstreeks op het C-18 vaste fase extractie.
2. Voordat monster voorwaarde het C-18 vaste fase extractie kolom te spoelen met 2 ml acetonitril gevolgd door 2 ml water.
3. Na het laden van het monster wordt de kolom gewassen met 2 ml water, gevolgd door 2 ml acetonitril / water (15/85, v / v). Voorbeeld voor HPLC-analyse (met FB1) geëlueerd met 2 ml acetonitril / water (70/30, v / v).
4. Derivatiseren FB1 met o-phthaldehyde (OPA) ofwel 0,1 ml kolomeluaat een flacon 0,1 ml boraatbuffer (0,05 M boorzuur acid/0.05 M natriumboraat [50/50, v / v], pH 8,5) en 0,1 ml OPA (0,1 mg / ml in acetonitrile met 0,5% - mercaptoethanol).
5. Stop de reactie na 10 minuten door toevoegen van 0,5 ml acetonitrile/0.01 M boorzuur (40/60, v / v).
6. Analyseer FB1 op een Shimadzu HPLC LC-20AT systeem uitgerust met een analytische Zorbax ODS kolom (4.6 150 mm) en een variabele golflengte Shimatzu RF-10Axl fluorescentie (excitatie 335 nm / emissie 440 nm).
7. Een lineaire gradiënt gebruikt (solvent A: acetonitrile/0.1 M natriumfosfaat (40/60), pH 3,3; oplosmiddel B: acetonitril / 0,1 M natriumfosfaat (60/40), pH 3.3) en het verloop programma is als volgt: 100% A tot 100% B in 10 min 100% B gedurende 5 minuten.
8. Analyseer FB1 normen door middel van HPLC en de maximale oppervlakte metingen worden gebruikt om standaard curve te genereren. Vervolgens kwantificeren FB1 niveau in een monster door vergelijking piekoppervlakken met FB1 standaardcurve.

5. Ergosterol Analyse

1. De cultuur van de schimmel op maïskorrels gedurende 7-14 dagen.
2. Na de incubatieperiode, voeg 10 ml chloroform: methanol (2:1, v / v) in elke flacon. Eenmaal toegevoegd, goed schudden monsters en flacons in het donker incuberen bij kamertemperatuur gedurende 24 uur.
3. Na 24 uur, centrifugeren van de monsters en het verzamelen van de bovenstaande vloeistof en filtreer deze over 0,45 um nylon membraan.
4. Breng het monster direct in een Shimadzu HPLC LC-20AT-systeem uitgerust met een 4,6 U ODS-C18 kolom (200 A, 250 ± 4,6 mm) en een Shimadzu SPD-20A UV / VIS-detector ingesteld om toezicht te houden op 282 nm.
5. Gebruik methanol (100%) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml / min als mobiele fase. Bepaal kwantificering van ergosterol in monsters door vergelijking piekoppervlakken van monsters met een standaard curve gegenereerd van HPLC-kwaliteit ergosterol.

6. Representatieve resultaten

Na inoculatie en incubatie in een vochtige kamer voor twee tot drie dagen, moet de groei van schimmels beginnen te verschijnen op de kernels. Zeven dagen na de behandeling, de vegetatieve groei op behandelde planten moet duidelijk zichtbaar zijn, while mock controles moeten niet-geïnfecteerde (Figuur 1B, bovenaan). Perioden van langere incubatietijd bevorderlijk zijn voor meer overvloedige vegetatieve groei (Figuur 1B, onder). Onder de omstandigheden beschreven (figuur 2G), A. flavus wild-type NRRL 3357 weergegeven maximale waarde van de kolonisatie aflatoxine accumulatie en conidia productie 8, 6 en 8 dagen respectievelijk (figuur 2 AC). Wanneer echter mycotoxinen en conidiation vergeleken per eenheid ergosterol, werden de grootste waarden gemeten bij 4 en 6 dagen respectievelijk (figuur 2, DE). Figuur 2F vat deze schimmelbiomassa-afhankelijke maximale waarde waarnemingen. Interessant is dat tussen de 4-6 dagen na de inenting, de pitten ondergaan nucleïnezuur degradatie, door de ogen van totaal RNA van monsters op het tijdsverloop (figuur 2H, onder).

Verschillende studies, ook de onze, hebben examined F. verticilliodies infectie op maïskorrels ^{2,8,9,10,11,12} en met succes gebruikt 7-13 dagen de tijd-punten voor waarnemingen. Met behulp van de hierin beschreven werkwijzen, fumonisine niveaus variëren van 3,500-8,000 ng / g kernel ^4,13 en ergosterol niveaus variëren van 5.000-10.000 ng / g kernel ^14,13. Figuur 3 laat zien vertegenwoordiger pieken voor fumonisine (boven) en ergosterol (onder ) van HPLC chromatogrammen. Meting van ergosterol kan ook worden uitgevoerd via absorbantiespectra ^15.

Figuur 1. Stroomdiagram voor de kwantificering van schimmel biomassa, sporogenesis en mycotoxineproductie en representatieve resultaten voor de vegetatieve groei van de kernel bioassays. A) Stroomschema waarin de beschreven methode voor kwantificering van fundamentele biologische parameters die worden gebruikt om schimmelinfecties te pathogenese beoordelen maïskorrels. B) Representatieveresultaten voor kernel bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetatieve groei op de maïskorrels in de B73 genetische achtergrond. Zaden werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 ⁶ sporen / ml en foto werden 7 dagen na enting. Bottom, F. verticillioides ingeënt pitten in B73 achtergrond 13 dagen na infectie. Korrels werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 ⁶ sporen / ml.

Figuur 2. Aspergillus flavus kernel bioassay tijdsverloop. B73 korrels werden geïnoculeerd met 200 ul van 10 ⁶ sporen / ml Aspergillus flavus conidiale suspensie en gedurende 2-8 dagen (G). Alle waarden werden bepaald uit het droge gewicht gemiddeld 4 korrels (n = 3-4; gemiddelde ± SE). A) kolonisatie (gebaseerd op ergosterol), (B) aflatoxine, en (C) conidiation gekwantificeerd met behulp van methoden beschreven. E) aflatoxine en (F) conidiation weergegevenals functie van schimmelbiomassa gemeten in h ergosterol. F) Maximale waarden voor ergosterol, aflatoxine accumulatie, en conidiation als functie van schimmel biomassa - maximale waarden voor elke hoeveelheid waargenomen werd ingesteld op 100%. (H) 1 pg per laan van totaal RNA van tijdsverloop.

Figuur 3. Vertegenwoordiger High Performance Liquid Chromatography (HPLC) chromatogrammen voor fumonisine B1 (boven) en ergosterol (onder) geïsoleerd van kernels die besmet zijn met Fusarium verticillioides (M3125).

Discussie

De hier beschreven methoden zijn uitvoerig getest en bewezen robuust te zijn bij het genereren van meetbare resultaten voor schimmelkolonisatie, sporogenesis, en de productie van mycotoxinen. Bovendien moeten deze technieken voor zaden van andere planten die gevoelig zijn voor besmetting met schimmels mycotoxigenic (bijvoorbeeld pinda's, tarwe, katoen, pistachenoten, enz.). Voor de bevoegde plant-pathogeen interactie analyses, is het noodzakelijk dat de zaden worden in leven gehouden. Een kleine wond op het embry...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalog #
Potato Dextrose Agar	Fisher Scientifc	S71659A
Tween-20	Fisher Scientifc	BP337-100
Plastic incubatie container	Sterilite	1713LAB06
Blender	Vicam	20200
24 cm vouwfilter Papers	Vicam	31240
1,5 urn glas microvezel	Vicam	31955
Afla testzuil	Vicam	G1024
Afrla Test Ontwikkelaar	Vicam	32010
Methanol	Vicam	35016
Acetonitril	Fisher Scientifc	AC14952-0025
Ethanol	Fisher Wetenschappentifc	AC39769-0025
C-18 vaste fase extractie kolom (Prep september SPE C18 kolom)	Fisher Scientifc	60108-304
O-ftalaldehyde (OPA)	Sigma Chemical Co	79760-5g
Boorzuur	Fisher Scientifc	BP168-500
Natriumboraat	Fisher Scientifc	RDCS0330500
Mercaptoethanol	Fisher Scientifc	45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (pomp)	Shimadzu Scientific Instruments, Inc	LC-20AT
Zorbax ODS kolom (4.6x150mm)	Agilent Technologies	443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescentiedetector	Shimadzu Scientific Instruments, Inc	RF-10AXL
Natriumfosfaat	Fisher Scientifc	AC38987-0010
FB1 normen	Sigma Chemical Co	F1147-1 mg
Chloroform	VWR	MK444410
13 mm spuitfilter met 0,45 um nylon membraan (HPLC)	Pall Life Science	4426
Ergosterol	Sigma-Aldrich	45480-50G-F
Scintillatieflesjes	VWR	66021-602
Natriumchloride	Vicam	G1124