Hier laten we zien ons protocol voor isolatie van basale en submucosale klier kanaal cellen van de muis luchtpijpen. We tonen ook aan de methode van het injecteren van stamcellen in het dorsale muis vetkussentje om een te creëren In vivo Model van submucosale klier regeneratie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie van basale cellen en Submucosale Gland Duct Cellen van Mouse Luchtpijp
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De grote luchtwegen rechtstreeks in contact met de omgeving en dus gevoelig voor schade van toxines en infectieuze agentia die we inademen in 1. De grote luchtwegen vereisen daarom een efficiënt herstelmechanisme ons lichaam beschermen. Dit proces vindt reparatie van stamcellen in de luchtwegen en het isoleren van stamcellen die uit de luchtwegen belangrijk voor het begrijpen van de mechanismen van herstel en regeneratie. Het is ook belangrijk voor het begrijpen van abnormale reparatie die kan leiden tot aandoeningen van de luchtwegen 2. Het doel van deze methode is om een nieuwe stamcelpopulatie isoleren van de muis trachea submucosale klier kanalen en deze cellen plaats in in vitro en in vivo modelsystemen de mechanismen van herstel en regeneratie van de submucosale klieren 3 identificeren. Deze productie toont methoden die kunnen worden gebruikt voor het isoleren en assay het kanaal en basale stamcellen uit de grote luchtwegen 3. Hierdoor kunnen weom ziekten van de luchtwegen, zoals cystische fibrose, astma en chronische obstructieve pulmonaire ziekte te bestuderen. Momenteel zijn er geen methoden voor het isoleren van submucosale klier duct cellen en er zijn geen in vivo modellen voor de regeneratie van submucosale klieren bestuderen.
Protocol
Overzicht van stappen
1. Dissectie van trachea
2. Reiniging luchtpijp en snijden
3. Enzymdigestie en verwerking tot enkele celsuspensie
4. Kleuring voor FACS sortering en
5. Verwerking gesorteerde cellen in vivo en in vitro modellen
1. Dissectie van Luchtpijp
- Euthanaseren de muis met een intraperitoneale injectie van 0,1 cc mg/0.2 van pentobarbital.
- Snij de buikwand, en verplaats de darmen naar de zijkant om de abdominale aorta vervolgens bloot te leggen en te ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze techniek kanaal en basale cellen van de luchtwegen isolaat belangrijk voor een beter begrip van de luchtwegen en herstel en regeneratie van de luchtwegen. De hier beschreven technieken zijn een paar kritische stappen. De eerste is de geoptimaliseerde enzymatische vertering periode. De tweede is het creëren van een enkele celsuspensie door middel van seriële passage met steeds hogere gage naalden naar cel knippen te voorkomen, maar te breken celklonten. De derde is de FACS analyse en gating van cellen met geschikte .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
We willen de globale Stem Cell Research Center FACS erkennen en vooral Jessica Scholes en Felicia Codrea bedanken voor hun hulp bij celsortering. Het werk werd gefinancierd door CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society / COPD Stichting ATS-06-065, The Concern Foundation, De UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program / Longkanker SPORE, de Universiteit van Californië kanker Onderzoek Coordinating Committee en de Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | |
| Compleet medium 10: DMEM-F-12, 50/50, 1X) | Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Natriumbicarbonaat (3,6 mm of 0,03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicilline (100 U / ml) | Mediatech | 30-001 CI- | |
| Streptomycine (100 ug / m) | Mediatech | 30-001 CI- | |
| Amfotericine B (0,25 ug / ml) | Lonza | 17-836R | |
| InSulin (10 ug / ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrine (5 ug / ml) | Sigma | T1147 | |
| Choleratoxine (0,1 ug / ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermale groeifactor (25 ng / ml) | BD | 354001 | |
| Runder-hypofyse extract (30 ug / ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Foetaal runderserum (5%) | Visser | SH3008803HI | |
| Retinoïnezuur (0,05 uM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Verminderde Matrigel | BD | 354230 |
Tabel 1. Vul media componenten.
| Naam van het reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
|---|---|---|---|
| Pronase | Roche | 10165921001 | Gebruikt op 0,15%: -O / n bij 4 ° C digestie om de totale tracheale cellen (ALI cultuur) isoleren -4 Uur digestie 4 ° C te isoleren SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Gebruikt bij 16 eenheden: 30 min bij RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Gebruikt bij 0,5 mg / ml: 20-30 min bij RT |
Tabel 2. Enzymen die voor enzymatische afbraak van de trachea.
Referenties
- Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. Innate immune functions of the airway epithelium. Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).
- Finkbeiner, W. E. Physiology and pathology of tracheobronchial glands. Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).
- Hegab, A. E.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
