Methodenartikel
Onlangs high-throughput sequencing technologie is sterk toegenomen gevoeligheid van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) experiment en gevraagd de toepassing ervan met behulp van gezuiverde cellen of weefsel ontleed. Hier hebben we een methode om af te bakenen ChIP techniek te gebruiken met Drosophila Weefsel waarin de endogene chromatine toestand in een goed gekarakteriseerd biologisch systeem te pakken.
Epigenetica blijft een zich snel ontwikkelende veld dat bestudeert hoe de chromatine staat bijdraagt aan de differentiële genexpressie in verschillende celtypen in verschillende ontwikkelingsstadia. Epigenetische regelgeving draagt bij aan een breed spectrum van biologische processen, met inbegrip van cellulaire differentiatie tijdens de embryonale ontwikkeling en homeostase in de volwassenheid. Een kritische strategie in epigenetische studies is om te onderzoeken hoe verschillende histon modificaties en chromatine factoren genexpressie reguleren. Om dit aan te pakken, wordt chromatine immunoprecipitatie (ChIP) veel gebruikt om een momentopname van de vereniging van specifieke factoren met DNA in de cellen van belang te verkrijgen.
ChIP techniek maakt gebruik gewoonlijk gekweekte cellen als uitgangsmateriaal, dat kan worden verkregen in overvloed en homogeniteit reproduceerbaar te genereren. Er zijn echter verschillende nadelen: eerst het milieu cellen groeien in petrischaal verschilt van die in vivo, kan dusgeen afspiegeling van de endogene chromatine toestand van de cellen in een levend organisme. Ten tweede kunnen niet alle soorten van cellen gekweekt ex vivo. Er is slechts een beperkt aantal cellijnen, waarvan mensen genoeg materiaal ChIP assay verkrijgen.
Hier beschrijven we een methode om ChIP experiment met behulp van Drosophila weefsels te doen. Het uitgangsmateriaal wordt ontleed weefsel van een levend dier kan dus nauwkeurig de endogene chromatine weerspiegelen. Het aanpassingsvermogen van deze methode met veel verschillende soorten weefsels kunnen de onderzoekers om veel meer biologisch relevante vragen met betrekking tot epigenetische regulatie in vivo 1, 2 aan te pakken. De combinatie van deze methode met high-throughput sequencing (ChIP-volgende) zal verder kunnen de onderzoekers om een epigenomisch landschap te verkrijgen.
(De hele chip procedure duurt ongeveer twee dagen. Voorbereiding van ChIP bibliotheken voor high-throughput sequencing duurt nog eens 2-3 dagen.)
1. Ontleden en Bereid weefsel voor ChIP Experiment (~ 1 miljoen cellen)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vrage.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Wij hebben niets te onthullen.
De auteurs willen graag Dr Keji Zhao's lab (NIH / NHLBI) bedanken voor hun hulp bij het verstrekken van sequencing resultaten. Wij zouden ook graag de UCSC genome project bedanken voor het gebruik van Genome Browser om in kaart gebracht sequencing leest te visualiseren.
Dit werk werd ondersteund door de R00HD055052 NIH Pathway to Independence Award en R01HD065816 van NICHD, de Lucile Parkard Foundation en de Johns Hopkins University start-up financiering voor XC
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Compleet Mini proteaseremmer cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Formaldehyde (37%) | Supelco | 47083-U | |
| PMSF | Sigma | 78830 | |
| Kontes pellet stamper | Fischer Scientific | K749521-1590 | |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Lineaire polyacrylamide | Sigma | 56575-1 ml | |
| Glycogeen | Qiagen | 158930 | |
| SYBR groen / ROX qPCR Master Mix | Fermentas | K0223 | |
| Mini plaat spinner | LABNET | Z723533 | |
| Real-time PCR-systeem | Applied Biosystem | 4351101 | |
| Kleine Volume Ultrasone Processor | Misonix | HS-Excel 2000 | Model gestaakt |
| Dynabeads, Proteïne A | Invitrogen | 100-01D | |
| Dynamag magneet | Invitrogen | 123-21D | |
| Fenol: Chlorofrom: IAA | Invitrogen | 15593-049 | |
| Epicentre DNA END-Repair Kit | Epicentre Biotechnologie | ER0720 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| Klenow fragment (3 '→ 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| T4 DNA ligase | Promega Corporation | M1794 | |
| Adapter oligonucleotiden | Illumina | PE-400-1001 | |
| Gekoppelde-End Primer 1.0 en 2.0 | Illumina | 1001783 1001 784 | |
| E-Gel Electorphoresis systeem | Invitrogen | G6512ST | |
| 2X Phusion HF Mastermix | Finnzymes | F-531 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen