Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren en In ovo Elektroporatie van DNA / RNA-constructen in het kuiken embryonale netvlies aan de Hamburger en Hamilton stadium 22-23, dat is ongeveer embryonale dag 4 (E4). Deze techniek is zeer nuttig om genexpressie, genregulatie, en morfologische veranderingen in de ontwikkeling van Chick netvlies te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In Ovo Elektroporatie in Embryonale Chick Retina
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kip embryonale netvlies is een uitstekend hulpmiddel om retinale ontwikkeling te bestuderen in hogere gewervelde dieren. Vanwege de grote omvang en externe ontwikkeling, is het relatief zeer makkelijk te manipuleren het kuiken embryonale netvlies met behulp van recombinant-DNA / RNA-technologie. Elektroporatie van DNA / RNA-constructen in het embryonale netvlies hebben een groot voordeel voor genregulatie in het netvlies stam / voorlopercellen tijdens het netvlies ontwikkeling te bestuderen. Verschillende soorten van testen, zoals reporter-gen-test, gen over-expressie, gene knock down (shRNA) enz. kan worden uitgevoerd met behulp van de elektroporatie techniek. Deze video demonstreert gericht retinale injectie en in-ovo elektroporatie in het embryonale kuiken netvlies aan de Hamburger en Hamilton stadium 22-23, dat is ongeveer embryonale dag 4 (E4). Hier laten we een snelle en handig in ovo electroporatie techniek waarbij een plasmide DNA dat green fluorescent protein (GFP) expressie brengt als een marker wordt rechtstreeks geleverd in dechick embryonale subretinale ruimte en gevolgd door elektrische pulsen aan DNA-opname te vergemakkelijken door het netvlies stam / voorlopercellen. De nieuwe methode van retinale injectie en elektroporatie op E4 laat de visualisatie van alle retinale typen cellen, inclusief de late-geboren neuronen 1, die moeilijk is geweest met de conventionele methode van injectie en elektroporatie op E1.5 2.
Protocol
Aangezien sommige delen van het protocol worden uitgevoerd zoals eerder beschreven in andere Jupiter video's 2 en papers 3 met minor modificatie we zullen niet bespreken die in detail hier.
1. Egg Handling en Naald Voorbereiding
- Eieren kunnen worden opgeslagen in een wijnkoeler bij ongeveer 13 ° C maximaal 1 week. Als de temperatuur te hoog is, zal embryo's abnormaal begint te ontwikkelen, terwijl lagere temperatuur veroorzaakt een hoge mortaliteit. Zodra u klaar bent om te broeden haal de eieren uit de wijnkoeler en verticaal zet de eieren met de grotere eindigen. Houd de eieren in de kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur voordat ze in de 37,5 ° C incubator.
- Incubeer de eieren 96 tot 100 uur, die over de embryonale dag 4 te verkrijgen embryo's die aan de Hamburger en Hamilton het podium 22 4-5.
- Bereid micropipet naalden van getrokken glas capillaire buizen en breek de punt onder een dissectie micromogelijkheden met een pincet om een tip opening ongeveer 0,1 micrometer in doorsnede en een 20 mm conus te krijgen. Naalden met grotere tips moeite hebben met het doorprikken van de vitelline membraan terwijl de kleinere tips moeite hebben met het laden en het leveren van de DNA-oplossing.
- Bevestig de naald aan een 0,1 ml Hamilton Gasdichte spuit gemonteerd op een micromanipulator. Gebruik een klein stukje van Masterplex siliconen buis voor het bevestigen van de naald op de spuit. Omdat de aansluitingen goed vast zitten geen behoefte aan minerale olie toe te voegen aan deze bijlage af te dichten.
- Mix 2 pi reporter plasmide-DNA oplossing met een concentratie variërend 3-6 pg / pl en 0,2 ul van snelle groen (0,025%) op een stuk parafilm. Snel groene kleurstof zal helpen om de injectie te visualiseren. Langzaam, laadt u de naald met het mengsel.
- Om de vitelline membraan te bevrijden van de binnenste membraan voorzichtig draai het ei ongeveer 180 ° en wacht enkele minuten en draai het vervolgens terug in de oorspronkelijke stand en stel het voor elektroporatie.
- Veeg de Forceps en eischaal met 70% ethanol om infectie te voorkomen dat het embryo.
- Maak een klein gaatje op het ei direct boven de lucht cel met een paar AA tang. Zorg ervoor dat u de eischaal te kraken. Verwijder de stukjes een voor een om een klein venster te maken. Verwijder voorzichtig het binnenste membraan met behulp van de tang, zonder het aanraken van de vitelline membraan.
2. Injectie en Elektroporatie
- Om schade aan de hersenen of het hart, de positie van de naald contra lateraal van de belangrijkste bundel van de bloedvaten in het oog en wijst naar de snavel te voorkomen.
- Prik door de vitelline membraan, sclera, netvlies en glasvocht door een plotselinge milde druk op de naald. Als de naald doorboort via het andere uiteinde van het oog moet goed komt tenzij beschadigt elke belangrijke bloed ader.
- Langzaam trek de naald terug aan de rand van de opening en plaats het bijna raken aan de buitenranden wand van de oogbol.
- Insertiet de naald in de sub netvlies ruimte tussen de sclera en retina.
- Injecteer het DNA tot je de 'groene oplossing' het vullen van de kant van de oogbol en duwen het netvlies naar binnen door het creëren van een uitstulping te visualiseren.
- Als uw naald plaatsen is niet juist dan zie je de DNA-oplossing zich verspreidt binnen het glasachtig lichaam het opvullen van de midden van de oogbol. Ook als u schade aan het netvlies te veel dan zie je de DNA-oplossing komt uit de oogbol.
- Verwijder langzaam de naald en onmiddellijk de elektroden te plaatsen in parallel in het ei na weken in een PBS. Duw de elektroden onder te dompelen in het vruchtwater een manier zodat de geïnjecteerde oog ligt tussen de elektroden. Vermijd het aanraken van een groot bloedvat of het hart met de elektroden bij het plaatsen van hen. De negatieve elektrode moet op de injectieplaats kant, zodat DNA kan worden vervoerd van sub retinale ruimte in het netvlies naar positieve elektrode. Electroporate het netvlies met 5 pulsen van 15V voor 50 ms met 950 ms intervallen.
- Verwijder voorzichtig de elektroden en verzegelen het raam van het ei met stukjes duidelijke plakband.
- Label en de datum waarop de geïnjecteerde eicel voordat het terug naar de incubator. Normaal gesproken duurt het ongeveer 3 tot 5 minuten dat u de gehele elektroporatie proces.
- GFP expressie kan worden gezien als Reeds 8 uur na elektroporatie. U kunt echter wachten tot het embryo op de gewenste stadium voor de oogst.
3. Representatieve resultaten
In ons onderzoek maken we gebruik van diverse plasmide constructies om de regulatie van genexpressie dat de betrokken retinale cel ontwikkeling te bestuderen. In deze video pCAG-GFP (transfectie controle) werd gebruikt om een succesvolle injectie en elektroporatie volgen. Niettemin mogen plasmide construct met reportergen (GFP, RFP etc.) worden gebruikt. Hoewel GFP expressie kan worden gezien als Reeds 8 uur na electroporation, we meestal beginnen met het oogsten het ei op dag 6 (E6) en daarna. Geëlektroporeerd netvlies werden ontleed uit van het embryo en geanalyseerd onder tl-dissectie microscoop voor het inbedden en snijden. Doorgaans kunnen reporter genexpressie worden gezien ten minste in een kwart van de retina na een succesvolle elektroporatie (Fig 1). De getransfecteerde netvlies weefsels werden verder geanalyseerd door middel van snijden voor een duidelijke weergave van de cel morfologie. Immunohistochemie met celtype specifieke markers (Brn3a, PAX6 etc.) toegestaan karakterisering van cel-specifieke GFP expressie (Figuur 2).
Figuur 1. Succesvolle elektroporatie van reporterplasmide resultaten positief GFP expressie. Chicken embryonale netvlies werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd op embryonale dag 4 en geoogst op embryonale dag 6. Tenminste 25% van de retina werd succesvol getransfecteerde (A = Bovenaanzicht, B= Onderaanzicht). Schaal Bar = 1 mm.
Figuur 2. Karakterisering van GFP expressie retinale cellen met behulp van immunohistochemie. GFP uiten retinale weefsel in E7 stadium waren vaste en coupes. Deze secties werden vervolgens gekleurd met verschillende cel specifieke merkers. Brn3a werd gebruikt om ganglioncellen (A) te bepalen, terwijl PAX6 werd gebruikt om horizontale, amacrine en ganglioncellen (B) te bepalen. Schaal bar = 50 urn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gerichte retinale injectie en in-ovo elektroporatie in embryonale netvlies aan E4 stadium kan specifiek zijn gericht op het netvlies stamcellen resulteert in de mogelijkheid om alle zes grote netvlies celtypen te visualiseren op het cel-niveau. In ovo elektroporatie op HH10 (~ E1.5) gericht op de optic vesicle kan cellen die ontwikkelen om het oog vormen transfecteren. Echter deze cellen hebben een zeer hoge omzet bij deze tijd en deze methode is niet specifiek voor retinale cellen. Het kan zijn dat de...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en faciliteiten Comite aan de Rutgers University.
Dankbetuigingen
We willen graag aan de heer Maaz Enver bedanken voor het gebruik van zijn HD-camera (Cannon VIXIA HFS100). Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van NIH (EY018738), New Jersey Commissie op het ruggenmerg Onderzoek (08 tot 3074-SCR-E-0 en 10 tot 3.091-SCR-E-0), en Busch Biomedical Research Award.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Bevruchte pathogeenvrije (SPF) witte Leghorn kip eieren | Sunrise Boerderijen (Catskill, NY) | ||
| Kip ei incubator | GQF productie, Savannah, GA | Model-1550 | Ingesteld op 60% luchtvochtigheid en 37,5 ° C. |
| Glas capillairen | Wereld precisie-instrument Inc | TW150F-4 | |
| 0,1 ml spuit | Hamilton Co Reno, Nevada | Gasdicht 1710 | Alternatief 1ml injectiespuit kan worden gebruikt als ook |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Knip een klein stukje (1 cm) voor de bevestiging van de glazen naald op de spuit |
| Pincet | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | Wereld precisie-instrument Inc | M3301-M3 | |
| Plasmide DNA | pCAG-GFP werd geleend van Dr Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Verdun het tot 0,025% met PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus, MA | BTX ECM 830 | Blokgolf generator |
| Elektroden | Harvard Apparatus, MA | BTX-model 514 | Onze elektroden werden 3-5 mm afstand van elkaar |
| Monochroom Digitale Camera | Zeiss, Duitsland | Eenxiocam MRM | |
| TL-Dissection Microscoop | Leica Microsystems, Duitsland | Leica MZ16FA | |
| Upright fluorescentiemicroscoop | Zeiss, Duitsland | Zeiss Axio Imager A1 |
Referenties
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
