Single-cell analyse van Bacillus subtilis Biofilms met fluorescentie microscopie en Flow cytometrie

Summary

Microbiële biofilms zijn over het algemeen gevormd door verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Eencellige analyse van deze subpopulaties vereist het gebruik van fluorescerende reporters. Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren en controleren meerdere subpopulationswithin B. subtilis Biofilms met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie.

Abstract

Vorming van biofilm is een algemene eigenschap van bijna alle bacteriën ^1-6. Wanneer bacteriën biofilms vormen, cellen zijn ingekapseld in extracellulaire matrix die meestal wordt gevormd door eiwitten en exopolysacchariden, naast andere factoren ^7-10. De microbiële gemeenschap ingekapseld in de biofilm vaak toont de differentiatie van verschillende subpopulatie van gespecialiseerde cellen ^11-17. Deze subpopulaties bestaan ​​naast elkaar en vertonen vaak ruimtelijke en temporele organisatie binnen de biofilm ^18-21.

Biofilmvorming in het model organisme Bacillus subtilis vereist dat de differentiatie van de verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen. Onder hen, de subpopulatie van matrix producenten, verantwoordelijk voor het produceren en afscheiden van de extracellulaire matrix van de biofilm is essentieel voor biofilmvorming ^11,19. Vandaar dat differentiatie van de matrix producenten is een kenmerk van biofilmvorming in B. subtilis.

We hebben fluorescerende verslaggevers voor het visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten in biofilms van B. subtilis ^15,19,22-24. Concreet, hebben wij waargenomen dat de subpopulatie van matrix producenten maakt in reactie op de aanwezigheid van zelf geproduceerde extracellulaire signaal surfactin ^25. Interessant is surfactin door een subpopulatie van gespecialiseerde cellen verschillend van de subpopulatie van matrix producenten ^15.

We hebben beschreven in dit rapport de technische benadering nodig is om te visualiseren en kwantificeren van de subpopulatie van matrix producenten en surfactin producenten binnen de biofilms van B. subtilis. Om dit te doen, zijn TL-verslaggevers van genen die nodig zijn voor matrix productie en surfactin productie ingebracht in het chromosoom van B. subtilis. Reporters worden uitgedrukt slechts in een subpopulatie van gespecialiseerde cellen. Vervolgens kan de subpopulaties zijngecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie en flowcytometrie (zie afb. 1).

Het feit dat verschillende subpopulaties van gespecialiseerde cellen naast elkaar bestaan ​​binnen meercellige gemeenschappen van bacteriën geeft ons een ander perspectief over de regulatie van genexpressie bij prokaryoten. Dit protocol heeft betrekking op dit fenomeen experimenteel en kan eenvoudig worden aangepast aan elke andere bewerkingen model, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan fenotypische heterogeniteit binnen een microbiële gemeenschap toe te lichten.

Protocol

1. Labeling B. subtilis en biofilmvorming Assay

1. Versterken door PCR van de promoter van het gen van belang. We tonen als voorbeeld het klonen van P _TAPA, de promotor van de genen voor de productie van TASA matrix eiwit ^26. Clone P _tapa in pkm008 vector (gemaakt door de Rudner lab, Harvard Medical School. Boston, USA) (fig. 2).
2. Lineariseren de plasmiden door enzymatische digestie (Enzyme aanbevolen, Xhol).
3. Laten natuurlijke competentie in B. subtilis stam 168 door het volgen van de een-stap-protocol eerder beschreven door Harwood en snijden ^27.
4. Voeg de gelineariseerde plasmiden in de cultuur van competente cellen en kies voor spectinomycine weerstand na twee uur incubatie.
5. Verkregen stammen hebben geplaatst het construct in de neutrale amyE locus van B. subtilis door dubbele recombinatie (Fig 4). Voor het maken vaneen dubbel-gelabeld stam, de integratie van de tweede verslaggever in de neutrale locus laca met behulp van het plasmide pDR183 presenteren we in de figuur 3. Plaats deze reporter met behulp van dezelfde techniek die we hierboven beschreven voor het inbrengen van verslaggevers gekloneerd in pKM008.
6. Breng de verslaggever van de stam 168 tot NCIB3610 dat in staat is om biofilms te vormen. Gebruik de SPP1 faag transductie protocol ^28,29. Grow donorstam in TY medium (LB +10 mm MgSO ₄ +10 uM MnSO _4). Meng 200 pi van de cultuur met 100 pi faag voorraad verdunning. 3 ml zachte agar na 30 minuten incubatie en laat faag halo ontstaan ​​bij 37 ° C.
7. Verzamel de zachte agar. Centrifugeer het en laat de supernatant dacht een spuit 0,22 pm filter. Gebruik deze supernatant naar een cultuur van de ontvangende stam gekweekt in TY medium te infecteren. Voeg 30 pi tot 10 ml van de cultuur 1:10 verdund. Incubeer gedurende 30 minuten en kies voor resistentie tegen antibiotica na 24 uur incubatie.
8. Seteer kolonie en overnacht Op LB groeien bij 37 ° C.
9. Spot 3 pl van de overnacht cultuur op een stevige biofilm-inducerend medium MSgg 1,5% agar ^30. Laat cellen gedurende 72 uur groeien bij 30 ° C (Figuur 3). Na drie dagen groei biofilm gevormd op het oppervlak van de MSgg agar ontwikkeld complex morfologische architectuur in het oppervlak van de agar.

2. Biofilm Dispersie en Cell Fixation

1. Verwijder de biofilm vormen het oppervlak van de MSgg afstrijken met een tandenstoker of een pincet. De consistentie van de biofilm helpen u bij het loslaten van het oppervlak van de agar-agar in een stuk.
2. Plaats de biofilm in 3 ml van PBS-buffer en verspreiden van de biofilm door herhaalde doorgang door een pipet of een naald. Als alternatief kan biofilm dispersie worden gedaan met behulp van een mild ultrasoonapparaat. Lichte sonicatie heeft 12 pulsen met een vermogen van 3 en amplitude van 0,7 seconde.
3. Bevestig de monsters voorafgaande cel-single analyse. Resuspend 300 pi van de celsuspensie in 1 ml 4% paraformaldehyde oplossing en incuberen bij kamertemperatuur precies zeven minuten.
   Samenstelling van 4% paraformaldehyde oplossing
   2 g paraformaldehyde
   50 ml PBS-buffer
   4 pi 10 N NaOH
   Filtreer de oplossing door een 0,22 um filter en aliquot
4. Was cellen na fixatie in PBS buffer driemaal opnieuw in suspensie te in 300 pi PBS-buffer.

3. Fluorescentie microscopie

1. Giet 200 pi van 0,8% agarose over een microscoopglaasje en zorgvuldig te bedekken met een andere dia. Zacht De bovenste slede na 2 minuten een laag agarose aan de slede van de bodem te verkrijgen.
2. Spot 2 pl gefixeerde cellen op het oppervlak van de laag en agarose bedekken met een microscoop dekglas.
3. Het monster wordt in de fluorescentie microscoop. We maken gebruik van een fluorescentie microscoop Leica DMI6000B uitgerust met een Leica CRT6000 iIlumination systeem. De filters voor YFP zijn Ex: BP500/20, Em: BP535/30 en voor het GVB zijn Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Expose uw monster een excitatie fluorescentie tussen 50-200 ms. Stel de excitatie periode volgens een negatieve controle die geen fluorescentie in de omstandigheden gekozen voor het experiment weergegeven.
5. Raadpleeg de fluorescentie afbeelding om hetzelfde beeld verkregen met helder veld. Samenvoegen van de twee beelden in een beeld. De resultaten van stroom fluorescentiemicroscopie met een gelabelde stam herbergt de reporter P _TAPA-YFP zijn weergegeven in figuur 6.

4. Kwantificering van enkele cellen met behulp van flowcytometrie

1. Dispergeer het monster gefixeerde cellen met een mild sonicatie. Ultrasone trillingen het monster uitvoeren 2 series van 12 pulsen met een vermogen van 5 en amplitude van 0,7 seconden om klonten te dispergeren in enkele cellen zonder dat cellyse. Bevestig de efficiëntie van de cel dispersie door licht microscopie.
2. Verdunnen monster 1:100 in PBS-buffer voor flowcytometrie-analyse. We maken gebruik van een flowcytometer BD FACS Canto II. Voor YFP fluorescentie, gebruik van een laser excitatie bij 488 nm in combinatie met een 530/30 filter. Voor GVB fluorescentie, gebruik maken van de laser excitatie bij 405 nm in combinatie met een 408/40 filter.
3. Kalibreer de flowcytometer machine met twee negatieve controles. Een monster van PBS buffer zonder cellen in suspensie als negatieve controle voor de grootte van de deeltjes waargenomen door de flow cytometer. Een monster voorzien geen fluorescentie reporter moet dienen te worden als negatieve controle voor de fluorescentie gevoeligheid van de flow cytometer.
4. Het monster wordt gelabeld met de tl-verslaggever in de flowcytometer. Voor elk monster te analyseren ten minste 50.000 evenementen met een debiet tussen 300 en 3000 gebeurtenissen per seconde.
5. Leg gegevens met behulp van FACS Diva software (BD Biosciences) en analyseren met behulp van FlowJo 8.5.2 software. Zie fluorescentie signalen naar de controle die laten zienis geen fluorescentie.
6. Presenteer gegevens controle op de fluorescentiesignaal van een gemerkte stam in twee assen afbeelding. Zet de fluorescentie gedetekteerd in de X-as en het aantal cellen die de verschillende niveaus van fluorescentie in de Y-as. De resultaten van stromingscytometrie analyse met een gelabelde stam herbergt de reporter P _TAPA-YFP zijn weergegeven in figuur 8.
7. Presenteer de gegevens die het toezicht op de fluorescentie-signaal van een dubbel-gelabeld stam in een drie-assen afbeelding. Zet de fluorescentiesignaal van elk van de kanalen gecontroleerd X en Y-assen (bijvoorbeeld GFP wordt gemeten in de X-as en CFP in de Y-as). Plot in de Z-as het aantal cellen die elke reporter en presenteren als contour isolijnen die loodrecht zou het vlak van het papier (Fig. 9 en 10).

4. Representatieve resultaten

Toen B. subtilis groeit op een plaat van biofilm-inducerende medium MSgg, biofilmvorming wordt waargenomen na drie dagen incubatie bij 30 ° C ^30. De biofilm vertoont sterke samenhang en kan worden afgepeld van het oppervlak van de agar uit een stuk. Bovendien is de biofilm toont een complex morfologische architectuur die indicatief is voor de verschillende deel cel subpopulaties (Fig. 5). Bijvoorbeeld, de productie van de extracellulaire matrix in biofilms resulteert in de vorming van plooien op het oppervlak van de kolonie. Deze functie kan worden gecorreleerd met de differentiatie van de subpopulatie van matrix producenten ^19. Ook het verhogen van antenne structuren op het oppervlak van de biofilm is indicatief voor de aanwezigheid van een subpopulatie van cellen sporulerende, aangezien sporen gelokaliseerd in het apicale gebied van deze structuren ^30.

Voorbeelden van visualisatie van celdifferentiatie in een single-label en een dubbele-gelabeld stam met behulp van fluorescentie microscopie zijn represented in figuur 6 respectievelijk 7. De een-gelabelde stam herbergt de fluorescerende reporter P _TAPA-GVB wordt uitgedrukt in de subpopulatie van cellen matrix. Deze subpopulatie verantwoordelijk te produceren en afscheiden van de extracellulaire matrix die de biofilm (Fig. 6) vormt. De dubbel-gelabeld stam herbergt de verslaggever P ^_tapa-GVB-26 en de extra reporter P _srfAA-YFP ^31. Deze tweede verslaggever maakt het mogelijk om toezicht op de subpopulatie van cellen die verantwoordelijk zijn voor het signaalmolecuul surfactin, die de signaalcascade triggers om de differentiatie van de matrix producenten (Fig. 7) afscheiden. Subpopulatie van matrix producenten zijn vals gekleurd in het blauw, terwijl de subpopulatie van surfactin producenten is vals gekleurd in het geel.

Flow cytometrie analyse met een gelabelde stam herbergt de reporter P _TAPA-YFP is afgebeeld in figuur 8. Onbehandelde controlestam niet herbergeneen fluorescerend eiwit genen lieten een enkele populatie lage relatieve fluorescentie. Cellen die drager zijn P _tapa-YFP in niet biofilm-inducerende omstandigheden geen onderscheid de subpopulatie van matrix producenten en de hele bevolking toonde een lage relatieve fluorescentie. In biofilm-inducerende toestand een subpopulatie van cellen met hoge relatieve fluorescentie opgetreden waargenomen een schouder rechts van de lage relatieve fluorescentiepiek ^23.

De resultaten van stromingscytometrie analyse met een dubbel-gelabelde stam zijn weergegeven in figuur 9 en 10. Figuur 9 toezicht gehouden op de subpopulaties van matrix producenten en surfactin producenten die de dubbel-gelabeld stam P _tapa-GVB, P _srfAA-YFP. Als controle van de achtergrond fluorescentie gebruikten we een stam die niet herbergen een fluorescent eiwit genen. Vervolgens hebben we ontdekt elke subpopulatie van matrix producenten en surfactin producenten in elke fluorescentie kanaal, met behulp van single-label stam s als controle. De dubbel-gelabeld stam P _tapa-GVB, P _srfAA-YFP toonde twee subpopulaties van cellen die een hoog niveau van de tl-verslaggevers. Elke populatie wordt omlijst, waaruit blijkt dat er geen overlap in de expressie van de verslaggevers tussen de twee subpopulaties van gespecialiseerde cellen ^15. Ook flowcytometrie analyse met dubbel-gelabelde stam P _{SKF-YFP, TAPA-P} YFP is afgebeeld in figuur 10. De verslaggever van het gen SKF houdt toezicht op de differentiatie van de subpopulatie van kannibalen ^32, die is beschreven coördinerend onderscheiden met de subpopulatie van matrix producenten ^24. In dit geval dubbele gemerkte stam vertoonde een subpopulatie van cellen die zowel fluorescerende YFP en CFP. Dit wijst erop dat zowel de cel differentiatie signaalwegen coördinerend worden geactiveerd in dezelfde subpopulatie.

1.jpg "/>
Figuur 1. Algemene regeling van het experiment. Het protocol is verdeeld in drie stappen. De eerste stap vereist labelen van de stam B. subtilis met de verslaggever fusie dat de subpopulatie van belang de gaten houdt. Tweede groeien gelabeld stammen in biofilm-inducerende omstandigheden. Ten derde, de verspreiding van de biofilm en het uitvoeren van single-cell analyse van de bevolking met behulp van fluorescentie microscoop en flowcytometrie.

Figuur 2. Schematische weergave van de integratie vector pKM008. Deze vector integreert de verslaggever fusie van belang in de neutrale locus amyE door dubbele recombinatie. De promotor van belang (P _TAPA) wordt gekloneerd in vector met de knipplaatsen EcoRI en HindIII. Vervolgens wordt de expressie van het GVB gen onder de controle van de promotor P _tapa. De orientation van de genen in het plasmide wordt als een pijl.

Figuur 3. Schematische weergave van de integratie vector pDR183. Deze vector integreert de verslaggever fusie van belang in de neutrale locus laca door dubbele recombinatie. De fusie van belang (P _tapa - GVB) is gekloneerd in vector met behulp van de restrictieplaatsen EcoRI en BamHI. De oriëntatie van de genen in de plasmide wordt als een pijl.

Figuur 4. Schema van de integratie van de verslaggevers in het chromosoom van B. subtilis door dubbele recombinatie. (A) B. subtilis chromosoom twee neutrale loei amyE en laca te reporter fusie integreren zonder dat de ontwikkeling van de biofilm. (B) Proces van dubbele recombinatie van pKM008. Gelineariseerd plasmide geïntegreerd in het genoom van B. subtilis door dubbele recombinatie. De reporter fusie integreert in de neutrale locus op een stabiele wijze.

Figuur 5. Biofilmvorming van B. subtilis NCIB3610. Proces van bioflm de vorming van de stam B. subtilis NCIB 3610 bij het ​​kweken op de biofilm-inducerend medium MSgg gedurende drie dagen bij 30 ° C. Opeenvolgende foto's van de ontwikkeling van biofilm werden genomen om 12u.

Figuur 6. Visualisatie van de subpopulatie van matrix producenten onder de fluorescentie microscoop. Een monster van een biofilm van B. subtilis P _tapa - GVB, werd vastgesteld en onderzocht onder de fluorescentie microscoop. 200 ms van fluorescentieexcitatie blijkt een subpopulatie van cellen uitstoten hogere fluorescentie dan de rest van de cellen. Wij beschouwen deze subpopulatie als de subpopulatie van matrix-producerende cellen. Schaal bar is 3 um.

Figuur 7. Visualisatie van de subpopulatie van matrix producenten en surfactin producenten onder de fluorescentie microscoop. Monster van een biofilm van de B. subtilis P _tapa-GVB, P _srfAA-YFP dubbel-gelabeld stam werd vastgelegd en onderzocht onder de fluorescentie microscoop. Belichtingstijd van 250 ms blijkt twee subpopulaties van cellen uitstoten hogere fluorescentie dan de rest van de cellen. Een subpopulatie uitgedrukt YFP en het werd ontdekt uitsluitend met behulp van de YFP kanaal (valse gekleurd in geel). Dit is de subpopulatie van surfactin producenten. Een andere subpopulatie uitgedrukt GVB en het werd alleen gedetecteerd met behulp van het GVB-zenders el. Dit is de subpopulatie van matrix producenten. Schaal bar is 3 um.

Figuur 8. Kwantificering van de subpopulatie van matrix producenten die 2-D flowcytometrie. Verspreid cellen van een biofilm van B. subtilis P _tapa-YFP werden gecontroleerd met behulp van flowcytometrie. De flowcytometer geteld 50.000 gebeurtenissen en de fluorescentie-signaal voor elk evenement werd gevolgd. Aantal getelde cellen uitgezet in Y-as, terwijl de intensiteit van YFP signaal uitgezet in de X-as. Cellen werden gekweekt in LB medium niet-biofilm inducerende omstandigheden te verkrijgen. Cellen werden gekweekt in medium MSgg biofilm-inducerende omstandigheden te verkrijgen. De subpopulatie matrix producenten onderscheidt alleen biofilm-inducerende omstandigheden. Dit cijfer is aangepast van López et al., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
Figuur 9. Kwantificering van de subpopulatie van matrix producenten surfactin producenten die 3-D flow cytometrie. Fluorescentiesignaal van gecontroleerd de kanalen die in de X-as (voor YFP) en Y-as (voor CFP). De Z-as meet het aantal cellen die elke reporter en wordt gekwantificeerd als contour isolijnen loodrecht op het vlak van het papier. Het aantal gebeurtenissen gecontroleerd dit experiment was 50.000 gebeurtenissen. Links bovenste paneel geeft een controle van de achtergrond fluorescentie herbergen geen fluorescerende proteïne genen. Rechts bovenste paneel detecteert de subpopulatie van surfactin producenten in de YFP fluorescentie kanaal (ingelijst in geel) met een enkele-gelabeld stam P _srfAA-YFP. Linker onderste paneel detecteert de subpopulatie van matrix producenten in de GVB-fluorescentie kanaal (ingelijst in blauw) met een enkele-gelabeld stam P _tapa-GVB. De dubbel-gelabeld stam P _tapa </ Em>-GVB, P _srfAA-YFP wordt bewaakt in het rechter onderste paneel. Het toonde aan twee subpopulaties die zijn ingelijst in geel en blauw. Dit cijfer is aangepast van López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Figuur 10. Kwantificering van de subpopulatie van matrix producenten kannibalen met 3-D flow cytometrie. Fluorescentiesignaal van gecontroleerd de kanalen die in de X-as (voor YFP) en Y-as (voor CFP). Het aantal gebeurtenissen gecontroleerd dit experiment was 50.000. Rechts bovenste paneel detecteert de subpopulatie van kannibalen in de YFP fluorescentie kanaal (ingelijst in het geel) in een single-label stam P _SKF-YFP. Linker onderste paneel detecteert de subpopulatie van matrix producenten in de GVB-fluorescentie kanaal (ingelijst in blauw) in een single-label stam P _tapa-GVB. De double gelabeld stam P _TAPA-CFP P _SKF-YFP heeft slechts een subpopulatie van cellen in dwars op de X-en Y-assen (een groen). Deze subpopulatie wordt waargenomen in het YFP en CFP-kanaal, omdat het uitdrukking aan de twee verslaggevers tegelijk. López et al.., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Discussion

Dat bacteriële subpopulaties van cellen die specifieke set van genen bewijzen de complexiteit van microbiële ^33,34 weergegeven. Dit protocol zou te bepalen of de expressie van een gen van belang wordt beperkt tot een bepaald subpopulatie van gespecialiseerde cellen in de microbiële. Visualisatie van deze subpopulaties vereist de ontwikkeling van nieuwe technieken, omdat de traditionele methoden om de gen-expressie of microarray analyse beoordeling van de niveaus van genexpressie om de hele microbiële gemeensc...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Techniek	Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer
MSgg samenstelling	5 mM kaliumfosfaat	Roth	6878
	MOPS 100 mM	Sigma-Aldrich	M1254
	Magnesiumchloride 2 mM	Roth	2189.1
	Calciumchloride 700μM	Roth	A119.1
	Ijzerchloride 50 pm	Sigma-Aldrich	157740
	Zinkchloride 1 pm	Applichem	A2076
	Thiamine 2 pm	Sigma-Aldrich	74625
	Glycerol 0,5%	Roth	7533
	Glutamate 0,5%	Sigma-Aldrich	49621
	Tryptofaan 50μg/ml	Sigma-Aldrich	T0254
	Fenylalanine 50μg/ml	Sigma-Aldrich	P2126
Cell fixatie	Paraformaldehyde	Roth	0335
	Benaming van het apparaat	Vennootschap	Catalogusnummer
Sonicatie	Cell ultrasoonapparaat	Bandelin	D-1000
Fluorescentie microscopie	Fluorescentiemicroscoop	Leica	DMI6000B
	Naam van de software	Vennootschap	Catalogusnummer
Fluorescentie microscopie	Asaf	Leica
Flowcytometrie	FCASDiva	BD
Flowcytometrie	FlowJo	Treestar