Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen voor In vitro Studie-en downstream-toepassingen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Microglia met ongeveer 12% van het totale cellulaire populatie in de hersenen van zoogdieren. Hoewel neuronen en astrocyten worden beschouwd als de belangrijkste celtypes van het zenuwstelsel, microglia een belangrijke rol spelen in de normale hersenfysiologie door het bewaken van weefsel voor vuil en ziekteverwekkers en onderhouden van homeostase in het parenchym via fagocytaire activiteit 1,2. Microglia worden geactiveerd tijdens een aantal van letsel en aandoeningen, waaronder neurodegeneratieve ziekte, traumatisch hersenletsel, en het zenuwstelsel infectie 3. Onder deze activerende voorwaarden, microglia verhogen hun fagocytische activiteit, ondergaan morpohological en proliferatieve veranderingen, en het actief scheiden reactieve zuurstof en stikstof soorten, pro-inflammatoire cytokines en chemokines, vaak het activeren van een paracriene of autocriene lus 4-6. Aangezien deze microglia responsen bijdragen aan de ziekte pathogenese in neurologische aandoeningen, onderzoek gericht op microglia is gerechtvaardigd.
Door de cellulaire heterogeniteit van de hersenen, is technisch moeilijk om voldoende microgliale monstermateriaal verkrijgen met hoge zuiverheid in in vivo experimenten. De huidige onderzoek naar de neuroprotectieve en neurotoxische functies van microglia vereisen een routine technische methode om consistent te genereren zuivere en gezonde microglia met voldoende rendement voor de studie. We presenteren, in tekst en video, een protocol om zuiver primaire microglia isoleren van gemengde glia culturen voor een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen. Kortom, deze techniek maakt gebruik van gescheiden hersenweefsel van neonatale rat pups te produceren gemengde gliale celculturen. Na de gemengde gliale culturen te bereiken confluentie, worden primaire microglia mechanisch geïsoleerd van de cultuur door een korte duur van schudden. De microglia worden geplaat bij hoge zuiverheid voor experimenteel onderzoek.
Het principe en het protocol van deze methodiek zijnbeschreven in de literatuur 7,8. Daarnaast zijn alternatieve methoden voor het primaire microglia isoleren goed 9-12 beschreven. Gehomogeniseerde hersenweefsel kan worden gescheiden door dichtheid gradiënt centrifugatie de primaire microglia 12 opleveren. De centrifugeren is gemiddelde lengte (45 min) en kan cellulaire schade en activering, alsmede, veroorzaken verrijkte microglia en andere cellulaire populaties. Een ander protocol is gebruikt om primaire microglia isoleren verschillende organismen bij langdurige (16 uur) schudden terwijl in cultuur 9-11. Na schudden, wordt de media supernatant gecentrifugeerd om microglia te isoleren. Deze langere twee-staps isolatie methode kan ook verstoren microgliale functie en activering. We voornamelijk gebruik maken van de volgende microglia isolatie-protocol in ons laboratorium voor een aantal redenen: (1) primaire microglia te simuleren in vivo biologie meer trouw dan vereeuwigd knaagdieren microglia cellijnen, (2) Nominale mechanische verstoring zo min mogelijk cellulaire disfunctie of activatie en (3) een voldoende opbrengst kan worden verkregen zonder passage van de gemengde gliale celculturen.
Het is belangrijk op te merken dat dit protocol hersenweefsel maakt gebruik van de neonatale rat pups te isoleren microglia en dat het gebruik van oudere ratten te isoleren microglia kan aanzienlijk het rendement, activering status, en functionele eigenschappen van geïsoleerde microglia beïnvloeden. Er is bewijs dat ouder is verbonden met microglia disfunctie, verhoogde neuroinflammatie en neurodegeneratieve aandoeningen, hebben tot nu eerdere studies gebruikt ex vivo volwassen microglia beter inzicht in de rol van microglia in neurodegeneratieve ziekten is waar veroudering belangrijke parameter. Echter, ex vivo microglia niet in cultuur gehouden worden voor langere tijd. Hierdoor wordt in dit protocol wordt de levensduur van primaire microglia in cultuur moet worden opgemerkt dat de microglia d gedragenifferently van volwassen microglia en in vitro studies dient zorgvuldig te worden overwogen wanneer vertaald naar een in vivo setting.
Protocol
1. Dissectie van neonatale rat hersenweefsel
- Chill Leibovitz L-15 geconditioneerde media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% pen / strep) tot 4 ° C. Warm kweekmedia (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline / streptomycine) tot 37 ° C. Bereid 4 60x15 mm petrischaaltjes met 4-5 ml van de geconditioneerde L-15 media op ijs. Steriliseer alle chirurgische instrumenten met 100% ethanol.
- Spoel de P2 neonatale rap pups met 70% ethanol. (Neonatale jonge ratten tussen de P1-P5 kan gebruikt worden in dit protocol.)
- Snel onthoofden een rat pup met steriele scherpe schaar en onmiddellijk vallen de kop in 70% ethanol. Herhaal dit voor een totaal van 5 jonge ratt....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel dit protocol wordt routinematig gebruikt om zuivere en gezonde microglia voor onderzoek experimenten te produceren, zal een zorgvuldige afweging van technische aspecten tijdens de kritieke delen van de procedure de variabiliteit te minimaliseren in de geïsoleerde microglia. In de eerste plaats tijdens de dissectie van het hersenweefsel van de neonatale rat, pups, het werken in een tijdig is nodig om hypoxische en ischemische schade aan het weefsel te minimaliseren. Het is echter ook belangrijk de meningitis bekle.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Gefinancierd door de intramurale programma aan de geüniformeerde diensten Universiteit.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| 60 mm x 15 mm Petrischalen | Fisher merk | 0875713A | |
| Sharp ontleden schaar | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont # 7b tang-standaard tips, gebogen, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont # 5 tang-standaard tips, recht, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conische centrifugebuizen | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serologische pipetten | Grenier Bio Een | 606180 | |
| 10 ml serologische pipetten | Grenier Bio Een | 607180 | |
| 100 micrometer steriele nylon cel zeef | Valk | 35-2360 | |
| 75 cm2 weefselkweekflessen | Corning | 430641 | |
| Minimaal essentieel Dulbecco's medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15-medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Foetaal runderserum | Gibco (Invitrogen) | 16000-036 | |
| Foetale paarden serum | Visser | SH3007402 | |
| Penicilline-streptomycine | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% ethanol | De Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing, 10X, pH 7,4 | Kwaliteit Biologische, inc. | 119-069-131 | 1X in steriel, gedestilleerd water |
| Biohazard zakken | VWR | 14220-028 | |
| Hemocytometer | Hausser Wetenschappelijk | 1492 | |
| 6-well celkweek platen met cellBIND oppervlak | Corning | 3335 |
Referenties
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
