Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen

Samenvatting

Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde weergave In vivo-Achtige eigenschappen niet die in conventionele cultuur modellen en dienen als een meer nauwkeurige organotypische modelsysteem voor een veelheid aan wetenschappelijke onderzoeken.

Samenvatting

Cellen en weefsels in het lichaam ervaring milieu-omstandigheden die hun architectuur beïnvloeden, intercellulaire communicatie, en de algemene functies. Voor in vitro celcultuur modellen om nauwkeurig na te bootsen het weefsel van belang, de groei omgeving van de cultuur is een cruciaal aspect om te overwegen. Veel gebruikte conventionele celkweek systemen verspreiden epitheliale cellen op een vlakke twee-dimensionale (2-D) ondoordringbare oppervlakken. Hoewel er veel is geleerd van de conventionele celkweek systemen, veel bevindingen zijn niet reproduceerbaar in de menselijke klinische proeven of weefselexplantaten, mogelijk als gevolg van het ontbreken van een fysiologisch relevante micro-omgeving.

Hier wordt beschreven een teeltsysteem dat vele van de cultuur toestand grenzen van 2-D celculturen overwint met de innovatieve roterende wand vat (RWV) bioreactor technologie. Wij en anderen hebben aangetoond dat organotypische RWV-afgeleide modellen kunnen structureel samen te vattene, functie, en authentieke menselijke reacties op externe stimuli op dezelfde wijze als de mens explant weefsels ^1-6. De RWV bioreactor is een suspensiekweek systeem dat zorgt voor de groei van epitheelcellen onder lage fysiologische vloeistof schuifkracht. De bioreactoren in twee verschillende formaten, een hoge aspect roterend vat (HARV) of een langzaam draaiende laterale vat (STLV), waarin zij verschillen van de beluchting bron. Epitheelcellen worden toegevoegd aan de bioreactor keuze in combinatie met poreus collageen beklede parels microdrager (figuur 1A). De cellen gebruiken de korrels als groei steiger tijdens de constante vrije val in de bioreactor (figuur 1b). De micro-omgeving die door de bioreactor kan de cellen aan drie-dimensionale (3-D) aggregaten het weergeven van in vivo-achtige kenmerken vormen vaak niet waargenomen onder standaard 2-D kweekomstandigheden (figuur 1D). Deze kenmerken zijn onder andere tight junctions, mucons productie, apicale / basale oriëntatie, in vivo eiwit lokalisatie, en extra epitheliale cel-type specifieke eigenschappen.

De overgang van een monolaag van epitheelcellen een volledig gedifferentieerde 3-D totale varieert afhankelijk celtype ^{1 7-13.} Periodieke bemonstering van de bioreactor zorgt voor monitoring van epitheliale totale formatie, cellulaire differentiatie markers en levensvatbaarheid (figuur 1D). Zodra celdifferentiatie en gaatvorming wordt vastgesteld, worden de cellen geoogst uit de bioreactor en soortgelijke assays uitgevoerd op 2-D cellen kunnen worden op de 3-D aggregaten met een paar overwegingen (figuur 1E-G). In dit werk beschrijven we gedetailleerde stappen van hoe cultuur 3-D-epitheliale cel aggregaten in de RWV bioreactor en een verscheidenheid van potentiële testen en analyses die kunnen worden uitgevoerd met de 3-D aggregaten. Deze analyses omvatten, maar zijn niet beperkt tot, structurele / morphological analyse (confocale, scanning en transmissie elektronenmicroscopie), cytokine / chemokine secretie en cell signaling (cytometrische bead array en Western blot analyse), de analyse van genexpressie (real-time PCR), toxicologische / Analyse van Geneesmiddelen en gastheer-pathogeen interacties. Het gebruik van deze testen het fundament gelegd voor meer diepgaande en uitgebreide studies zoals metabolomics, transcriptomics, proteomics en andere array-gebaseerde applicaties. Ons doel is om een niet-conventionele middelen van het kweken van menselijke epitheelcellen aan organotypische 3-D modellen die de mens in vivo weefsels herhalen, op een gemakkelijke en robuust systeem om te worden gebruikt door onderzoekers met uiteenlopende wetenschappelijke belangen te produceren.

Protocol

Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 omstandigheden in een laminaire stroming kap.

1. Voorbereiden van de STLV Bioreactor

1. Monteer de STLV bioreactor volgens protocol van de fabrikant en het uitvoeren van ontgifting protocol om de steriliteit van de bioreactor te garanderen. Bedek open poorten met luer caps en vul de STLV met 95% ethanol gedurende 24 uur.
2. Verwijder ethanol en vullen STLV met gesteriliseerd gedestilleerd water gedurende 24 uur.
3. Herhaal stap 1.2 met gesteriliseerd alleen gedistilleerd water.
4. Met het gereedschap door leverancier los alle schroeven, capsules en midden van de plug STLV, en autoclaaf bij 110 ° C gedurende 20 min in een sterilisatie zakje.
5. Zodra de STLV wordt gekoeld, draai de schroeven en herhaal de stappen 1.1-1.4 om de steriliteit en volledige ontgifting te garanderen.
6. Draai de schroeven van de afgekoeld STLV en schroef op de pre-gesteriliseerde one-way kranen aan elke poort.
7. Open kraan door het positioneren van de knoppen verticaal.
8. Verwijder de plunjers van een 10 ml en 5 ml luer-lock spuit en re-sleeve zuigers terug in de wikkels om de steriliteit te behouden. Schroef spuiten op kranen (luer-lock tip spuiten nodig zijn voor deze stap).
9. Voeg Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) naar de 10 mL spuit tot STLV vol en begint te vullen 5 ml.
10. Vervang de steriele plunjers in elke spuit en verwijder resterende bellen die zich in bioreactor door wisselingen tussen het rijden zuigers van de spuiten.
11. Laat de spuiten aan bioreactor nadat alle bellen. Sluiten kranen en bevestig de STLV aan de roterende verticale platform en draaien voor een minimum van 24 uur te controleren op lekken.

2. Voorbereiden microdrager Beads

1. Voeg 15 ml DPBS tot ~ 250 mg cytodex microdrager kralen in een 50 ml conische buis en de autoclaaf onder dezelfde voorwaarden als de STLV (1,4).
2. Na het afkoelen, verwijder DPBS, voeg media gebruikt om epitheli groeienAl cel van belang, en draai buis kralen mengen.
3. Herhaal wassen stappen met de media nog twee keer. Na de laatste wasbeurt toe te voegen 15 ml groei van media kralen.

3. Zaaien epitheelcellen en kralen in de STLV Bioreactor

1. Grow epitheliale cellen van belang als monolagen in weefselkweekflessen tot u ≥ 1x10 ⁷ cellen. Verwijder cellen van de fles (bijvoorbeeld trypinsization, EDTA), tel cellen cellulaire concentratie vastgesteld en bepalen cellulaire levensvatbaarheid van trypan blauw uitsluiting kleuring ^1.
2. Om de conische buis met geprepareerde kralen (zie 2.3), voeg de gewenste concentratie van cellen (2x10 ^{5-1x10 7} epitheelcellen) ^{2, 8,} afhankelijk van uw epitheliale celtype van opzet (figuur 1a). Waarborgen alle cellen overgedragen door spoelen conische buis.
3. Verwijder DPBS en spuiten van het STLV.
4. Verwijder de stekker van het centrum van de haven en voeg de epitheliale cell / kraal suspensie in de STLV met 10 ml serologische pipet. Spoel conische buis om ervoor te zorgen alle cellen / kralen worden overgedragen aan de STLV en centrum plug vervangen.
5. Verwijder de zuigers van een 5 en 10 ml spuiten en re-sleeve zuigers terug in de wikkels om de steriliteit te behouden. Schroef spuiten in havens met open kranen. Vul de STLV met media, vervangen zuigers, en dicht kranen.
6. Plaats de nieuwe geënt STLV in een 37 ° C incubator gedurende 30 minuten zonder rotatie.
7. Open kranen, verwijdert u bellen met behulp van plunjers en sluit kranen.
8. Plaats STLV in een 37 ° C, _5% CO2 bevochtigde incubator bij 20 rpm ronddraaiende (figuur 1b). Culturen moeten continu worden gedraaid 24 ha dag met uitzondering van de bij de bemonstering, het veranderen van media, of oogst aggregaten (zie volgende paragraaf).

4. Het kweken, sampling en Foto Documentatie van culturen

1. Na een eerste 96-120 h kweken van cellen in het bioreactor, verandering media door het kantelen van de STLV en waardoor cellen / kralen om zich te vestigen. Verwijder spuiten, opent u beide kranen, en giet ~ 75% van de media van links-poort (figuur 1C). Op basis van cellulaire stofwisseling van media, media veranderen elke dag of om de dag na de eerste zaaien en 96-120 h cultuur periode.
2. Schroef op 5 en 10 ml spuiten leegte van plunjers en volg opnieuw toevoeren protocol zoals hierboven beschreven (1.7-1.11), en schroef daarna sloot de STLV terug op zijn plaats op draaiend platform.
3. Monitoren groei en levensvatbaarheid van aggregaten elke 5-7 dagen na zaaien in de STLV door voorzichtig verwijderen van een kleine hoeveelheid toeslagstoffen (~ 200 pi) van het centrum poort in twee 1,5 ml buizen. Om de totale scheren te vermijden, voor alle totale transfers gebruik maken van een 1000 ui pipetpunt dat is ~ 2 cm gesneden van de punt en gesteriliseerd.
4. Vervang centrum stekker, uitwisseling met nieuwe spuiten, voeg verse media om de STLV zoals hierboven beschreven (1,7 tot 1,11), en plaats de STLV terug in deincubator met rotatie (zie 3.8).
5. Voor het bewaken cellulaire levensvatbaarheid, een van de twee 1,5 mL buis aggregaten gealiquoteerd in stap 4.3 en verwijderen cellen uit korrels dezelfde wijze de epitheliale cellen worden verwijderd weefselkweekflessen (bijvoorbeeld trypsine). Monitor leefbaarheid door trypanblauw uitsluiting vlekken ^1.
6. Voor de beeldvorming mobiele aggregaten, voeg 0,5-1 ml van media om de tweede 1,5 ml totale hoeveelheid en de overdracht aan een kleine petrischaal met een cut-off 1000 il pipetpunt. Afbeelding aggregaten met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop (figuur 1D).

5. De overdracht en het oogsten van Aggregaten

1. Voor sommige epitheelcellen modellen moet de aggregaten naar een wegwerp HARV de cultuur beluchting ² verhogen. Ongeveer een week vóór de oogst aggregaten voor analyse, te verwijderen spuiten en kranen van de STLV en giet ~ 50% van de media van de kant van de haven.
2. Remove het STLV centrum van plug en zorgvuldig alle inhoud giet het in een 50 ml conische buis van het centrum van de haven (figuur 1E). Spoel de STLV twee keer met 5 ml media en combineren spoelen met de rest van aggregaten.
3. Ga verder met het overbrengen van de aggregaten, zoals beschreven in 5.2, maar de overdracht aggregaten uit de 50 ml conische buis naar de HARV.
4. Voorzichtig oogst aggregaten van HARV na ~ 1 week of de STLV (op basis van celtype) zoals hierboven uitgevoerd (5.2). Zie hieronder voor mogelijke test formaten, testen en analyse na de totale oogst.

6. Potentieel Analyse, toepassingen en testen uitgevoerd met Aggregaten

1. Zaaien aggregaten voor verschillende experimentele formats. Overdracht gewenste hoeveelheid van aggregaten uit de 50 ml conische buis met een 1,5 ml tube, 24 wells-plaat, of 96-wells-plaat met behulp van een gesteriliseerd cut-off 1000 ul pipetpunt (Figuur 1F).
2. Wassen en preparIng aggregaten voor analyse. Verwijder de media na aggregaten hebben gevestigd. Breng direct DPBS tot het centrum van de buis of goed zodat alle aggregaten worden aangewakkerd. Zodra aggregaten hebben zich naar beneden, te verwijderen DPBS en herhaal zo vaak als nodig is.
3. Verzenden aggregaten voor off-site experimenten en analyses. Toevoegen gewenste hoeveelheid van aggregaten in een 50 ml buis en was aggregaten als in 6.2. Helemaal vol 50 ml buis met media, dop en parafilm rond dop om lekkage te voorkomen. Veilig aggregaten 's nachts verzonden worden naar de gewenste locatie bij omgevingstemperatuur.
4. Bevestiging van aggregaten voor elektronenmicroscopie (figuur 2). Scanning, transmissie of immuno-elektronenmicroscopie kan worden uitgevoerd door overdracht 150-300 ul aggregaten aan een 1,5 mL buis wassen aggregaten 3 keer met DPBS (6.2). Voeg 200 ul van applicatie-specifieke (SEM, TEM, immuno-EM, etc.) elektronenmicroscopie fixatief voor de gewenste incubatietijd. Verwijder vast te stellen, was aggregates 2 keer met DPBS, en ga verder zoals beschreven in Hjelm et al.. 2010 voor scanning en transmissie elektronenmicroscopie ^2.
5. Immunofluorescentie microscopie beeldvorming (figuur 3). Transfer ~ 100 ul aggregaten aan een 1,5 ml buis en was aggregaten (6.2). Fix en label aggregaten met antilichaam onder dezelfde voorwaarden als bij monolagen, behalve in een 1,5 ml buis. Te monteren, plaatst u 1 druppel van de montage van media op microscoopglaasje, dragen het label aggregaten op de top van de montage media met een cut-off 1000 uL pipetpunt, plaats dekglaasje op aggregaten, afdichting dekglaasje met nagellak, en droge glijbaan 's nachts ^2.
6. Meet cellulaire levensvatbaarheid / proliferatie met MTT assay (figuur 4). Transfer aggregaten een 24 wei-plaat en vervangen media met 625 pi fenolrood vrije media. Voeg 62,5 pi van 5 mg / mL thiazolyl Blue tetrazolium bromide (MTT) in elk putje en gedurende 4 uur geïncubeerd bij 37 ° C. Voeg 625 pi van 100 mg / ml SDS-0,01M HCl in elk putje en 's nachts broeden. Lees de absorptie bij 570 nm en het verkrijgen van% levensvatbaarheid van de cellen met behulp van vergelijking:

7. Toxicologisch onderzoek. Overdracht aggregaten tot en met 24 wells-plaat en het uitvoeren van trypanblauw uitsluiting op ≥ 2 putten voor de eerste levensvatbaarheid van de cellen / concentratie. Voeg testverbinding op variërend concentraties putten te dupliceren. Voor levensvatbaarheid van de cellen (Figuur 5A), was aggregaten en uitvoeren van trypan blauw uitsluiting na de behandeling. Voor TC ₅₀ (figuur 5B) neemt cellulaire levensvatbaarheid van duplo voor elke concentratie tijd en gebruik Reed Muench methode toxische concentratie te bepalen 50% ^{2 ​​15.}
8. Cytometrische bead array (CBA) of ELISA. Cellulaire supernatanten kan worden na het zaaien cellen in een diagram experimentele formaat. Stimuleren geplaatste aggregaten met cellen gegroeidmonolagen verzamelen supernatanten (≥ 120 pi) en bewaren bij -80 ° C voor analyse door ELISA of CBA (figuur 6).
9. RNA-analyse. Breng ≥ 500 pL van aggregaten tot 1,5 ml buis en was aggregaten met DPBS. Ga door extractie met behulp van Qiagen RNAeasy kit en protocol voor dierlijke cellen met een homogenisering van lysaat met behulp van 20-gauge naald. Zorg laten korrels op de bodem van de buis, vóór de overdracht supernatant en te legen korrels dragen aan de rotatie kolom (beads kolom membraan resulteert in een lage opbrengst RNA verstoppen) (figuur 7).
10. Protein analyse. Oogst aggregaten onder dezelfde methoden als monolagen met behulp van een 1,5 mL buis of groter experimentele formaat. Na lysis van de aggregaten kunnen de korrels te lossen en lysaat in een afzonderlijke buis voor het uitvoeren van een eiwitgel of andere vorm van eiwitanalyse (figuur 8).
11. Infectiestudies. Seed aggregaten in gewenste experimentele formaat. Gebruik ten minste twee putjes / monsters voor trypsinizing cellen van kralen om het aantal cellen opsommen en de levensvatbaarheid van de cellen te kwantificeren. Infect aggregaten met een ziekteverwekker van belang zijn op geselecteerde multipliciteit van infectie zoals uitgevoerd met cellen gekweekt als monolagen (Figuur 9). Wasstappen moet worden uitgevoerd in 6.2.
12. Flow cytometrie: Seed aggregaten in 50 ml buis was aggregaten (6.2), 2 mM EDTA en voeg gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Voeg 5-10 ml media om cellen en gaan cellen door middel van een cel zeef. Aliquot 1x10 ⁶ cellen in een polypropyleenbuis en was cellen in koud blokkeeroplossing (1% FBS in PBS). Resuspenderen cellen met antilichaam en incubeer volgens fabrikant. Was cellen door centrifugeren, suspendeer in PBS, en overdracht cellen buis filteren analyse (figuur 10).

7. Representatieve resultaten

Een voorbeeld vangedifferentieerde menselijke epitheliale totale gekweekt in STLV bioreactor systeem kan worden gezien in figuur 2. De SEM en TEM beelden verzameld van humane vaginale cellen gekweekt in de STLV voor 39 dagen, waarbij microridges, invaginations, intracellulaire secretoire vesicles, en microvilli het apicale oppervlak kan worden waargenomen. Verdere demonstratie van in vivo-achtige eigenschappen van epitheliale cellen gekweekt in de bioreactor kan worden waargenomen confocale microscopie immunofluorescentie beelden (figuur 3) 3-D vaginale cellen die mucine (MUC1) en markers specifiek voor epitheliale cellen (ESA) en terminale differentiatie (involucrine; INV).

Zoals afgebeeld, 3-D aggregaten weer te geven ultrastructurele soortgelijke kenmerken weefsels, maar hun meer fysiologisch relevante fenotypes ook dienen als een uitstekend platform voor het evalueren van de toxiciteit van stoffen. De MTT-test, een veelgebruikte test om levensvatbaarheid van de cellen, het metabolisme of proliferatie te metenDaarnaast kan worden om de toxiciteit van verschillende chemicaliën en verbindingen (figuur 4) te meten. Triton X-100, een wasmiddel de celmembranen vernietigt, werd gebruikt als positieve controle voor de validatie van MTT assay. Een verdere werkwijze toxiciteit meten na behandeling met proefverbindingen is trypan blauw uitsluiting (figuur 5). Na behandeling met de nonoxynol-9 (N-9), vaginale aggregaten lieten een toxiciteit reactie gelijk aan die van cervicale explantaat modellen, maar een ander profiel dan monolagen ^{2, 16.}

Aanvullend die het vermogen van epitheliale cellen gekweekt in de bioreactor te functioneren en signaal op dezelfde wijze weefsels in vivo laten zien kan worden waargenomen in figuur 6. Na stimulatie met moleculen afkomstig van micro-organismen die worden erkend door de Toll-like receptoren (TLR), de aggregaten te reageren en scheiden pro-inflammatoire cytokines, waaronder IL-6 ^1.Expressie van de progesteronreceptor (PR), een receptor die reageert op hormoonstimulatie kan worden waargenomen in de vaginale cellen zowel het RNA en eiwitgehalte (figuur 7 en figuur 8, respectievelijk). De 3-D aggregaten niet alleen de mogelijkheid om te reageren op pathogeen en hormoon-moleculen, maar zijn ook in staat om functioneel te ondersteunen een herpes-simplex-virus type 2 (HSV-2) infectie. Een confocale microscopie beeld van HSV-2 geïnfecteerde 3-D vaginale aggregaten (figuur 9) toont infectie. Parallel 2-D vaginale epitheliale celkweken niet weergegeven als gevolg van de grote celdestructie door HSV-2 infectie. RWV afgeleide 3-D aggregaten zijn tevens toegepast om bacteriële en virale replicatie te kwantificeren door intracellulaire groeicurven en plaque assays, respectievelijk ^{8, 9.} Ten slotte kan de fysieke en functionele eigenschappen van afzonderlijke cellen in de aggregaten ook worden gekwantificeerd met behulp van flowcytometrie. Voor bijv. stopsectie van seinle, we gebruik van een flowcytometrie test om MUC1 oppervlakte-expressie van individuele vaginale cellen (figuur 10) te meten. Vaginale 3-D aggregaten een lager percentage van MUC1 (27,7%) in vergelijking met monolagen (67,2%). Het onderste deel van MUC1 op de 3-D aggregaten oppervlak tegenover monolagen kan een gevolg van de meeste MUC1 wordt uitgescheiden uit de cellen zoals waargenomen in de vaginale kanaal ^{17, 18} zijn.

Figuur 1. Schematische voor het kweken van menselijke epitheelcellen in RWV en potentiële toepassingen met behulp van RWV-afgeleide aggregaten. A) epitheelcellen worden in eerste instantie gekweekt als monolagen in een weefselkweek kolf. Na confluent zijn cellen uit kolf en gecombineerd met microdrager kralen in STLV bioreactor. Schaal bar:. 80 pm B) De STLV draait op een platform om een constante vrije val klimaat van lage f te creërenluid afschuiving, waardoor de cellen te hechten en te groeien op de kralen waardoor het vormen van zichtbare mobiele aggregaten. C) Na 96 uur, de media in de STLV moet worden gewijzigd om tegemoet voor cellulaire stofwisseling. De media gegoten uit een zijpoort, vers medium vervangen door een aangrenzende 10 mL spuit (zuiger verwijderd), en spuit plunjers worden vervangen en die te extruderen luchtbellen. D) Na ~ 5 dagen (d) de aggregaten beginnen te vormen . De aggregaten worden bemonsterd om de 7 dagen en afgebeeld door lichtmicroscopie om hun ontwikkeling progressie (20x vergroting van 3-D menselijke epitheelcellen vaginale cellen). E) te volgen Na volledige verzamelmonster vorming en cellulaire differentiatie heeft plaatsgevonden, worden de aggregaten geoogst van de bioreactor en overgebracht in een 50 ml conische buis. F) Aggregaten kan worden gezaaid in een 1,5 ml buis of een multi-well plaat-formaat uit te voeren experimentele analyse en testen. G) Overzicht van pote ntial testen en analyses die kunnen worden uitgevoerd op de aggregaten. Dit representatieve lijst van analyses is niet bedoeld om een ​​volledig overzicht van alle mogelijke downstream-toepassingen.

Figuur 2. Het onderzoeken van morfologische en structurele kenmerken van de 3-D epitheelcellen aggregaten met behulp van elektronenmicroscopie. (A) Scanning electronen microscopie (SEM) afbeelding van een 3-D menselijke epitheelcellen vaginale cellen aggregaat. Schaalbalken: 200 pm (100x), 100 pm (200x), 50 pm (500x). Transmissie elektronenmicroscopie (TEM) beeld van een 3-D menselijke epitheelcellen vaginale cellen aggregaat met pijlen wijzend naar (B) intracellulaire secretorische vesikels en microvilli of (C) "cytoplasmatische processen". Schaal bars: 2 micrometer (gemodificeerd van Hjelm et al. 2010.) ^2.

g3.jpg "/>
Figuur 3. Confocale immunofluorescentie microscopie vroeger juncties differentiatie en eiwit markers in 3-D epitheelcellen aggregaten. Human 3-D vaginale cellen geoogst bioreactor na 32 dagen gefixeerd en gekleurd met (A) mucine antilichaam MUC1, (B) antilichaam specifiek voor epitheelcellen, ESA, of (C) anti-involucrine (INV) antilichaam dat terminaal gedifferentieerde epitheliale cellen herkent. Er werden aggregaten indirect gemerkt met Alexa 488 secundair antilichaam (groen). Schaal bar: 60 micrometer (gemodificeerd van Hjelm et al. 2010.) ^2.

Figuur 4. MTT assay gebruikt om cellulaire levensvatbaarheid meten. Human 3-D vaginale aggregaten werden geënt in een 24 wei-plaat en behandeld met media alleen (onbehandeld) en 0,01%, 0,1% of 1,0% Triton X-100 wasmiddel gedurende 1 uur bij 37 ° C. Followin g behandeling medium werd verwijderd en de MTT assay werd uitgevoerd om cellulaire levensvatbaarheid meten. ** Staat p <0,001; een eenzijdige Student's t-test waarbij Triton X-100 behandelde cellen onbehandelde controle.

Figuur 5. Gebruik te maken van 3-D epitheelcellen aggregaten om het scherm samengestelde toxiciteit. (A) Nonoxynol-9 (N-9) dosis-afhankelijke levensvatbaarheid curve 24 uur na de behandeling van de 3-D menselijke vaginale epitheelcellen model (rode lijn / bars) in vergelijking met hetzelfde celtype gegroeid confluente monolagen (zwarte lijn / staven). (B) N-9 TC ₅₀ niveaus van vaginale epitheelcellen culturen (A) 1,5 uur, 4 uur, 8 uur en 24 uur na de behandeling. * Staat voor p <0,05; een eenzijdige Student's t-test vergelijking monolagen naar 3-D-cellen bij elke belichtingstijd. (Modified van Hjelm et al. 2010) ^2.

/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
Figuur 6. Analyse van de cytokine productie in 3-D epitheliale cellen in reactie op toll-like receptor (TLR) agonist stimulatie. Drie-D menselijke vaginale cellen werden gestimuleerd met FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), FLAG (TLR5) , en de CL097 (TLR7 / 8) voor 24 uur en uitgescheiden cytokinen werden gemeten door cytometrische bead array. IL-6 wordt als pro-inflammatoire cytokine representatieve geproduceerd en gemeten. * Staat voor p <0,05; een eenzijdige Student's t-test vergelijking gestimuleerd monsters naar PBS-groep. (Modified van Hjelm et al. 2010) ^2.

Figuur 7. Controle genexpressie in 3-D epitheelcellen. Semi-kwantitatieve RT-PCR analyse van progesteron receptor (PR) expressie in monolaag (ML) of 3-D menselijke vaginale epitheelcellen. GAPDH wordt als een laad controle. Amplificatieproductenzijn slechts een gevolg van transcript uitdrukking die zich na 30 PCR-cycli. pijlpunten wijzen op PR bands alleen voorkomen in de 3-D monster.

Figuur 8. Eiwitexpressie analyse van 3-D epitheelcellen. Western blot analyse van monolaag en 3-D humane vaginale epitheelcellen geheel cellysaten (30μg) gemerkt met een anti-progesteron receptor (PR) antilichaam. β-tubuline werd gebruikt als een probe voor het laden controle.

Figuur 9. Drie-D menselijke epitheelcellen model ondersteunt een productieve virale infectie. Confocale immunofluorescentie microscopie beeld van de 3-D menselijke vaginale epitheelcellen totale geïnfecteerd met HSV-2. Cellen werden geïnfecteerd met een moi van 1,0 gedurende twee uur, gewassen, vaste 24 uur na infectie (4% PFA), en gekleurd met HSV-2 specifieke VP5 capsid antilichaam (groen) en de nucleaire vlek DAPI (blauw). Schaal bar: 50 urn.

Figuur 10. Individuele cel analyse in 3-D menselijke epitheelcellen model door flowcytometrie. (A) Monolayer of (B) 3-D menselijke vaginale epitheliale aggregaten waren gescheiden in EDTA, voorzien van een FITC-geconjugeerd antilichaam MUC1 (blauw), een isotypecontrole (groen) of PBS (rood) en FITC expressie werd gekwantificeerd door flowcytometrie. Getallen het percentage cellen dat positief gekleurd mucine antilichaam na gating nog achtergrondlawaai fluorescentie van het isotypecontrole gekleurde cellen. Niet-uniform pieken gevolg van de vele bloedglucose patronen en variërende MUC1 op het oppervlak van deze cellen.

Discussie

Gebruik van de RWV bioreactor-technologie hier gepresenteerd kunnen onderzoekers de mogelijkheid om hun huidige celcultuur verder te gaan naar een meer fysiologisch relevante organotypische celkweek model. De RWV bioreactor celkweek systeem zorgt voor een lage shear micro-omgeving die cellen in staat stelt om 3-D cellulaire aggregaten te vormen met in vivo-achtige kenmerken, met inbegrip tight junctions, mucine de productie, de extracellulaire processen (dwz microvilli), en cellulaire polariteit. Het merendeel ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Alexa Fluor 488	Invitrogen	A21131	Gebruikt bij 1:500 verdunning
FACSDiva	BD		Flowcytometer
β-tublin antilichaam	Calbiochem	654162	Gebruikt op 1:5000 verdunning
Bio-Plex 2000	BioRad	171-000205	v5 software
Bioreactor en componenten	Synthecon	RCC-4
Cell zeef	BD Falcon	352340	40 pm poriegrootte
Conische buis (50 ml)	Corning	5-538-60
Dekglaasjes	VWR	48366067
Cytokine bead array kits	BioRad	Aangepast menselijke kit
Cytodex kralen	Sigma	C3275
DPBS	Gibco	14190
EDTA	Sigma	ED-500G	Ethyleendiaminetetraazijnzuur
Epitheliale specifieke antilichaam (ESA)	Chemicon	CBL251	Gebruikt om 1:50 verdunning
Foetaal runderserum (FBS)	Gibco	10438	Hitte geïnactiveerd
HARV (wegwerp)	Synthecon	D-405
Zoutzuur	Sigma	258148	37%
Involucrine antilichaam	Sigma	Ik 9018
Objectglaasjes	VWR	16004-368
MTT reagens	MP Biomedicals, LLC	194592	3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-difenyl tetrazolium Bromide
MUC1 antilichaam (microscopie)	Santa Cruz	Sc-7313	Gebruikt om 1:50 verdunning
MUC1 antilichaam (flowcytometrie)	BD Pharmingen	559774	Ook wel CD227, gebruik 20μL per test
Paraformaldehyde	Elektronen Microscopie Wetenschappen	15710	Verdund tot 4% in DPBS
Petrischaal (klein)	BD Falcon	353002
Polystyreen buis filter	BD Falcon	352235
Polystyreen stijgbuis	BD Falcon	352058
PR antilichaam	DAKO	M3569	Gebruikt bij 1:100 verdunning
ProLong Gold	Invitrogen	P36931	Montage media met DAPI
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74903
Natriumdodecylsulfaat	Sigma	71725
Sterilisatie zakje	VWR	11213-035
Kranen (enkele reis)	Medex	MX5061L
Spuit (10 ml)	BD	309604	Luer-lock tip
Spuit (5 ml)	BD	309603	Luer-lock tip
Trypaan blauw	Invitrogen	T10282
Vp5 antilichaam	Santa Cruz	sc-13525	HSV-2 antilichaam Clone 6F10; gebruikt bij 1:5000 verdunning