Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde weergave In vivo-Achtige eigenschappen niet die in conventionele cultuur modellen en dienen als een meer nauwkeurige organotypische modelsysteem voor een veelheid aan wetenschappelijke onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cellen en weefsels in het lichaam ervaring milieu-omstandigheden die hun architectuur beïnvloeden, intercellulaire communicatie, en de algemene functies. Voor in vitro celcultuur modellen om nauwkeurig na te bootsen het weefsel van belang, de groei omgeving van de cultuur is een cruciaal aspect om te overwegen. Veel gebruikte conventionele celkweek systemen verspreiden epitheliale cellen op een vlakke twee-dimensionale (2-D) ondoordringbare oppervlakken. Hoewel er veel is geleerd van de conventionele celkweek systemen, veel bevindingen zijn niet reproduceerbaar in de menselijke klinische proeven of weefselexplantaten, mogelijk als gevolg van het ontbreken van een fysiologisch relevante micro-omgeving.
Hier wordt beschreven een teeltsysteem dat vele van de cultuur toestand grenzen van 2-D celculturen overwint met de innovatieve roterende wand vat (RWV) bioreactor technologie. Wij en anderen hebben aangetoond dat organotypische RWV-afgeleide modellen kunnen structureel samen te vattene, functie, en authentieke menselijke reacties op externe stimuli op dezelfde wijze als de mens explant weefsels 1-6. De RWV bioreactor is een suspensiekweek systeem dat zorgt voor de groei van epitheelcellen onder lage fysiologische vloeistof schuifkracht. De bioreactoren in twee verschillende formaten, een hoge aspect roterend vat (HARV) of een langzaam draaiende laterale vat (STLV), waarin zij verschillen van de beluchting bron. Epitheelcellen worden toegevoegd aan de bioreactor keuze in combinatie met poreus collageen beklede parels microdrager (figuur 1A). De cellen gebruiken de korrels als groei steiger tijdens de constante vrije val in de bioreactor (figuur 1b). De micro-omgeving die door de bioreactor kan de cellen aan drie-dimensionale (3-D) aggregaten het weergeven van in vivo-achtige kenmerken vormen vaak niet waargenomen onder standaard 2-D kweekomstandigheden (figuur 1D). Deze kenmerken zijn onder andere tight junctions, mucons productie, apicale / basale oriëntatie, in vivo eiwit lokalisatie, en extra epitheliale cel-type specifieke eigenschappen.
De overgang van een monolaag van epitheelcellen een volledig gedifferentieerde 3-D totale varieert afhankelijk celtype 1 7-13. Periodieke bemonstering van de bioreactor zorgt voor monitoring van epitheliale totale formatie, cellulaire differentiatie markers en levensvatbaarheid (figuur 1D). Zodra celdifferentiatie en gaatvorming wordt vastgesteld, worden de cellen geoogst uit de bioreactor en soortgelijke assays uitgevoerd op 2-D cellen kunnen worden op de 3-D aggregaten met een paar overwegingen (figuur 1E-G). In dit werk beschrijven we gedetailleerde stappen van hoe cultuur 3-D-epitheliale cel aggregaten in de RWV bioreactor en een verscheidenheid van potentiële testen en analyses die kunnen worden uitgevoerd met de 3-D aggregaten. Deze analyses omvatten, maar zijn niet beperkt tot, structurele / morphological analyse (confocale, scanning en transmissie elektronenmicroscopie), cytokine / chemokine secretie en cell signaling (cytometrische bead array en Western blot analyse), de analyse van genexpressie (real-time PCR), toxicologische / Analyse van Geneesmiddelen en gastheer-pathogeen interacties. Het gebruik van deze testen het fundament gelegd voor meer diepgaande en uitgebreide studies zoals metabolomics, transcriptomics, proteomics en andere array-gebaseerde applicaties. Ons doel is om een niet-conventionele middelen van het kweken van menselijke epitheelcellen aan organotypische 3-D modellen die de mens in vivo weefsels herhalen, op een gemakkelijke en robuust systeem om te worden gebruikt door onderzoekers met uiteenlopende wetenschappelijke belangen te produceren.
Protocol
Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder BSL-2 omstandigheden in een laminaire stroming kap.
1. Voorbereiden van de STLV Bioreactor
- Monteer de STLV bioreactor volgens protocol van de fabrikant en het uitvoeren van ontgifting protocol om de steriliteit van de bioreactor te garanderen. Bedek open poorten met luer caps en vul de STLV met 95% ethanol gedurende 24 uur.
- Verwijder ethanol en vullen STLV met gesteriliseerd gedestilleerd water gedurende 24 uur.
- Herhaal stap 1.2 met gesteriliseerd alleen gedistilleerd water.
- Met het gereedschap door leverancier los alle schroeven, capsules en midden van d....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gebruik van de RWV bioreactor-technologie hier gepresenteerd kunnen onderzoekers de mogelijkheid om hun huidige celcultuur verder te gaan naar een meer fysiologisch relevante organotypische celkweek model. De RWV bioreactor celkweek systeem zorgt voor een lage shear micro-omgeving die cellen in staat stelt om 3-D cellulaire aggregaten te vormen met in vivo-achtige kenmerken, met inbegrip tight junctions, mucine de productie, de extracellulaire processen (dwz microvilli), en cellulaire polariteit. Het merendeel .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Brooke Hjelm bedanken voor haar technische expertise en Andrew Larsen voor zijn eiwit analyse. Dit werk werd deels gefinancierd door de Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant en de NIH NIAID seksueel overdraagbare infecties en Topical Microbiciden Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Steeds meer industrieën herkennen Biologie van kopieën voor hergebruik van cijfers.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Naam van het serum | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Gebruikt bij 1:500 verdunning |
| FACSDiva | BD | Flowcytometer | |
| β-tublin antilichaam | Calbiochem | 654162 | Gebruikt op 1:5000 verdunning |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor en componenten | Synthecon | RCC-4 | |
| Cell zeef | BD Falcon | 352340 | 40 pm poriegrootte |
| Conische buis (50 ml) | Corning | 5-538-60 | |
| Dekglaasjes | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Aangepast menselijke kit | |
| Cytodex kralen | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethyleendiaminetetraazijnzuur |
| Epitheliale specifieke antilichaam (ESA) | Chemicon | CBL251 | Gebruikt om 1:50 verdunning |
| Foetaal runderserum (FBS) | Gibco | 10438 | Hitte geïnactiveerd |
| HARV (wegwerp) | Synthecon | D-405 | |
| Zoutzuur | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrine antilichaam | Sigma | Ik 9018 | |
| Objectglaasjes | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagens | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3 - (4,5-Dimethylthiazolyl 1-2) -2,5-difenyl tetrazolium Bromide |
| MUC1 antilichaam (microscopie) | Santa Cruz | Sc-7313 | Gebruikt om 1:50 verdunning |
| MUC1 antilichaam (flowcytometrie) | BD Pharmingen | 559774 | Ook wel CD227, gebruik 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Elektronen Microscopie Wetenschappen | 15710 | Verdund tot 4% in DPBS |
| Petrischaal (klein) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyreen buis filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyreen stijgbuis | BD Falcon | 352058 | |
| PR antilichaam | DAKO | M3569 | Gebruikt bij 1:100 verdunning |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Montage media met DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Natriumdodecylsulfaat | Sigma | 71725 | |
| Sterilisatie zakje | VWR | 11213-035 | |
| Kranen (enkele reis) | Medex | MX5061L | |
| Spuit (10 ml) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Spuit (5 ml) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypaan blauw | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antilichaam | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antilichaam Clone 6F10; gebruikt bij 1:5000 verdunning |
Referenties
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
