Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Samenvatting

AVEXIS een high throughput assay ontwikkeld eiwit interactie systematisch scherm nieuwe extracellulaire receptor-ligand paar betrokken bij cellulaire opname processen. Het is specifiek ontworpen om voorbijgaande eiwit interacties die zijn moeilijk te identificeren met behulp van andere high throughput benaderingen op te sporen.

Samenvatting

Extracellulair eiwit: eiwit interacties tussen uitgescheiden of membraan-tethered-eiwitten zijn van cruciaal belang voor zowel het initiëren intercellulaire communicatie en het waarborgen van de samenhang binnen meercellige organismen. Eiwitten voorspeld te vormen extracellulaire interacties worden gecodeerd met ongeveer een kwart van de menselijke genen ^1, maar ondanks hun belang en de overvloed, de meeste van deze eiwitten zijn er geen gedocumenteerde bindende partner. De eerste plaats is dit te wijten aan hun biochemische eigenzinnigheid: membraan-ingebed eiwitten zijn moeilijk te oplosbaar in hun natieve conformatie en bevatten structureel belangrijke posttranslationele modificaties. Ook de interactie affiniteiten tussen receptor-eiwitten vaak gekenmerkt door een uiterst lage interactie sterke punten (halveringstijd <1 seconde) zich verzetten tegen hun detectie met een groot aantal veelgebruikte high throughput methoden ^2.

We beschrijven hier een test, AVEXIS (aviditeit-based EXtracelluLAR Interactie Scherm) dat deze technische uitdagingen waarmee de detectie van zeer zwakke eiwit interacties (t _1/2 ≤ 0,1 sec) met een laag vals-positieve tarief ³ overwint. De test wordt gewoonlijk uitgevoerd in een high throughput formaat systematische screening van duizenden interacties in een geschikte vorm microtiterplaat (Fig. 1) in te schakelen. Het berust op de productie van oplosbare recombinante eiwit bibliotheken die de ectodomein fragmenten van celoppervlaktereceptoren of uitgescheiden eiwitten waarin het screenen van interacties bevatten, daarom is deze benadering voor type I, type II, GPI gekoppelde celoppervlakreceptoren en uitgescheiden eiwitten maar niet multipass membraan eiwitten zoals ionkanalen of transporteurs.

Het recombinant eiwit bibliotheken worden geproduceerd met een handige en hoogwaardige zoogdierexpressiesysteem ^4, die belangrijke posttranslationele modificaties zoals glycosyla zorgenTIE en disulfidebindingen worden toegevoegd. Uitgedrukt recombinante eiwitten worden uitgescheiden in het medium en geproduceerd in twee vormen: een gebiotinyleerde aas die kan worden vastgelegd op een streptavidine-gecoate vaste fase die geschikt zijn voor screening, en een pentamerised enzym-gelabeld (β-lactamase) prooi. De lokaas en prooi eiwitten worden aan elkaar in een binair wijze directe interactie tussen, vergelijkbaar met een conventionele ELISA (Fig. 1) detecteren. De pentamerisation van de eiwitten in de prooi wordt bereikt door een peptide sequentie van het kraakbeen oligomere matrix eiwit (COMP) en verhoogt de lokale concentratie van de ectodomains wat significante aviditeit winsten in staat te stellen zelfs zeer voorbijgaande interacties te detecteren. Door het normaliseren van de activiteiten van zowel het aas en ten prooi aan vooraf bepaalde niveaus voorafgaand aan de screening hebben we laten zien dat de interacties met monomere halfwaardetijden van 0,1 sec kan worden gedetecteerd met een laag percentage valse positieven ^3.

Protocol

1. Het samenstellen van een bibliotheek van Bait and Prey Plasmide-expressievectoren

1. Stel een lijst celoppervlaktereceptor en uitgescheiden eiwitten van belang te gescreend interacties en ophalen de sequenties van een geschikte eiwitsequentie database. De eiwitten die het N-terminale signaalpeptide secretorische geschikt (deze omvatten type I GPI gekoppeld en uitgescheiden eiwitten). Gewoonlijk is een eiwitfamilie (bijvoorbeeld immunoglobulinesuperfamilie of de receptoren tot een specifiek celtype zoals erythrocyten) geselecteerd.
2. Bepaal de omvang van de extracellulaire gebieden identificeert de locatie van het signaalpeptide en transmembraan gebied met proteïne kenmerk voorspelling software. Wij gebruiken meestal de SignalP v3.0 ⁵ en TMHMM v2.0 ^6.
3. Ontwerp primersets dat de gehele ectodomein fragment elke receptor versterken. Wij hebben een reeks lokaas en prooi vectoren die voor dit doel geschikt die eenerkrijgbaar van Addgene ( http://www.addgene.org/~~V ). Ontwerp de sense primer rond het begin methionine een Notl restrictie-enzym site en een optimale Kozak sequentie omvatten, die wordt gevolgd door 25 baseparen exact gen sequentie (Fig. 2A).
4. Ontwerp de antisense primer type I receptor eiwitten afkappen vlak voor de voorspelde transmembraangebied zodat de gehele ectodomein als oplosbaar recombinant eiwit tot expressie. Voeg een Ascl restrictieplaats in deze primer die vervolgens zou zich moeten vertalen in frame van een C-terminale rat Cd4d3 +4 eiwit tag ⁷ (Fig. 2A).
5. Amplify de ectodomein fragmenten uit alle genen met behulp van deze primers en klonen ze in het aas of prooi vector. We vinden het soms handig om ze eerst te klonen in de shuttle worden geblokkeerd voordat subklonering in een geschikte zoogdier expressievector, hebben we een afgeleide van de pTT3 vector ^3,4 te gebruiken. Zowel het aas en prooi vectoren contain C-terminale eiwitlabels als volgt (fig. 2B).
   1. Aas: Een tag met domeinen 3 en 4 van de rat CD4 (Cd4d3 +4) eiwit, gevolgd door een peptidesequentie die een substraat voor het E.coli BirA enzym kan dus monobiotinylated een specifiek lysineresidu (Fig. 2B) . De Cd4d3 +4 tag wordt herkend door de OX68 monoklonale antilichaam wordt gebruikt om de expressie van het lokaas eiwitten door ELISA kwantificeren. Het lokaas eiwitten zijn dus monomere en monobiotinylated. Extra lokaas eiwit vectoren waarin het peptide biotinylatable vervangen door een 6-tag zijn voor zuivering zijn.
   2. Prooien: prooien ook een rat Cd4d3 +4 tag gevolgd door een peptide sequentie van de rat kraakbeen oligomere matrixeiwit (COMP) en een C-terminaal β-lactamase enzym. De COMP peptide zorgt ervoor dat de prooi vormen pentamers een keer uitgedrukt (Fig. 2B).

2. Prey-en Bait-eiwitexpressie

We maken gebruik vaneen geschikte hoge expressie systeem met suspensiekweek van de HEK293E cellijn ⁴ van eiwit bibliotheken te produceren, maar elk zoogdier-expressie-systeem dient geschikt. Een commercieel beschikbare alternatief is de Freestyle systeem. Cellen gekweekt worden routinematig op een schudplateau (125 opm) bij 37 ° C, _5% CO2 70% relatieve vochtigheid. Zowel positieve als negatieve controle eiwitten moeten ook worden uitgedrukt. De rat Cd4d3 +4 tag alleen-fragment is beschikbaar als zowel een aas en prooi en zijn geschikt negatieve controles. Ook aas en prooi vectoren die een positieve controle coderen zijn beschikbaar (Addgene), we gebruiken meestal de rat CD200-Cd200R interactie ^8.

1. Zaad HEK293E cellen de dag voor transfectie met een dichtheid van 2,5 x 10 mL ⁵ cellen ^-1. We routinematig de cultuur van de cellen in volumes van 50 ml in Freestyle293 media aanleiding van de aanbevelingen van de fabrikant. Voor een efficiënte biotinylatie te garanderen, aan te vullen thij celkweekmedium gebruikt aas eiwitten met D-biotine produceren tot een uiteindelijke concentratie van 100 uM. Medium gebruikt om de prooi tot expressie niet moeten worden aangevuld met D-biotine.
2. De volgende dag, transfecteren cellen met behulp van een geschikt transfecties reagens (bijv. 293fectin). Gebruik 25 ug van het lokaas of prooiplasmide constructen voor een 50 ml cultuur te transfecteren. De gebiotinyleerde lokaas produceren co-transfecteren het plasmide dat codeert voor het lokaas te construeren met een plasmide dat uitgescheiden vorm van het E.coli eiwit-biotine ligase codeert ( BIRA) die verkrijgbaar is bij Addgene. Co-transfecteren lokaas plasmiden met een 10:1 ratio (2,5 ug) van het plasmide dat codeert voor het afgescheiden BirA eiwit.
3. Oogst culturen vijf dagen na transfectie door eerst pelletiseren van de cellen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 20 minuten gevolgd door filtratie van de supernatant door een 0,22 pm filter.

[Tip: Bait and prooi eiwits moeten worden opgeslagen onverdund bij 4 ° C en als een algemene richtlijn moet gebruikt worden binnen een jaar worden. Voeg bacteriostatics zoals 50 ug / ml polymyxine B sulfaat of 10 mM _NaN3 bacteriële besmetting van de supernatanten voorkomen.]

3. Normalisatie van de Bait and Prey Monsters

Een van de belangrijkste kenmerken van de AVEXIS test is dat omdat de recombinante eiwitten worden uitgescheiden kunnen worden verdund of geconcentreerd (genormaliseerde) om binnen de vastgestelde drempel activiteiten voordat het gebruikt wordt in de test. Wij hebben gevonden dat het niveau waarop de recombinante eiwitten tot expressie diverse overspannen - tot 4 grootteorden - en dus de normalisatiestap vermindert het aantal valse positieven bij de schermen.

3.1 Bait normalisatie

Opmerking: geconjugeerd D-biotine worden verwijderd uit de media (gewoonlijk door dialyse), aangezien het concurreren met de gebiotinyleerde bait eiwit binden aan bindingsplaatsen streptavidine.

1. Overdracht aas supernatanten in dialyse slang, etiket, stevig knippen en dialyse uitgebreid tegen een geschikte buffer, zoals PBS om vrij biotine te verwijderen.

[Tip: Wij hebben gevonden dat voldoende dialyse normaal bereikt 6 x 50 ml lokaas supernatanten tegen een volume van 4,5 L PBS met 4 veranderingen over een periode van 24 uur. Onvoldoende dialyse kan worden waargenomen door een remming van eiwit binding bij lage verdunningen tijdens het aas normalisatie stap (Fig. 3A).

2. Voer een ELISA om de relatieve niveau waarop het lokaas eiwitten tot expressie te bepalen. Bereid een verdunningsreeks van het gebiotinyleerde aas eiwitten en ze vast op streptavidine gecoate microtiterplaat. Gebruik de rat Cd4d3 +4 tag te detecteren en kwantificeren van de gevangen aas eiwitten met behulp van een monoklonaal antilichaam (OX68). Concentraat of aas eiwitten verdunnen tot het minimum bedrag dat nodig is om alle biot verzadigenin bindingsplaatsen in de put een streptavidine-beklede platen.
3. Blok de putjes van een streptavidine-beklede platen met fosfaat gebufferde saline/0.1% Tween-20 (PBST) / 2% bovine serum albumine (BSA) gedurende 15 minuten.
4. In een aparte plaat, een verdunningsreeks (vier 01:03 verdunningen gewoonlijk voldoende) van het lokaas eiwitten in PBST / 2% BSA en overdracht aan putjes van een streptavidine-beklede platen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
5. Was 3x in PBST. Voeg 100 ul van 2 ug / ml muis anti-rat Cd4d3 +4 IgG (OX68) geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
6. Was 3x in PBST. Voeg 100 pi anti-muis alkalische fosfatase van 1:5000 verdunning in PBST / 2% BSA en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
7. Was 3x in PBST en een definitieve wassen in PBS om eventuele resten van schoonmaakmiddel te verwijderen. Voeg 100 pi 1 mg / ml substraat 104 in diethanolamine buffer (10% diethanolamine (v / v), 0,5 mM _MgCl2, 10 mM _NaN3, pH9.8, opgeslagen van licht bij 4° C).
8. Na een uur maatregel absorptie bij 405 nm. Representatieve lokaas normalisatie resultaten worden getoond in Figuur 3A.
9. Bait eiwitten die tot expressie komen op een niveau dat onvoldoende zijn om alle biotine-bindingsplaatsen van een streptavidine-gecoate plaat te verzadigen, indien gebruikt onverdund, moet worden geconcentreerd met behulp van Vivaspin concentrators (Vivascience, 10kDa MWCO). Als een gids, schatten we dat ~ 5 ug van een typische aas eiwit (~ 80 kDa) voldoende is om een ​​plaat met 96 putjes te verzadigen.
   1. Lokaas eiwitten die in hoge concentraties worden verdund in PBST / 2% BSA tot een concentratie voldoende om de streptavidine-beklede platen verzadigen. De activiteit van de aas moet worden opnieuw gecontroleerd na verdunning of concentratie om ervoor te zorgen dat zij alle biotine bindingsplaatsen in het streptavidine-gecoate plaat te verzadigen.

3,2 Prey normalisatie

1. Kwantificering van de relatieve waarop de prooi eiwitten worden uitgedrukt in het β-lactamaseenzymactiviteit.
2. Eerst een verdunningsreeks van de supernatant die de prooi eiwitten in PBST / 2% BSA buffer. Voeg 20 pi van de verdunningen 60 ul van een 242 uM (0,125 mg / ml) nitrocefin oplossing (Calbiochem).
3. Onmiddellijk over de plaat een microtiterplaat lezer dat een absorptie gemeten bij 485 nm per minuut gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur is. Representatieve prooi normalisatie resultaten worden getoond in figuur 3B.
4. Concentreer je monsters met behulp van centrifugale concentrators of verdunnen ze in PBST / 2% BSA een drempel activiteit van ~ 2 nmol min ^-1 omzet van nitrocefin te bereiken. Praktijk wordt dit bereikt wanneer de nitrocefin gehydrolyseerd binnen ~ 7 minuten.

4. AVEXIS Screening Procedure

1. Was een streptavidine-gecoate plaat in PBST.
2. Voeg 100 ul van PBST / 2% BSA in elk putje en incubeer gedurende 30 minuten aan een valse eiwitbindingsplaatsen binnen elke goed te blokkeren.

[Tip: om resten van het wassen buffer na wasstappen te verwijderen, de plaat wordt getikt - krachtig - op keukenpapier]

3. Verwijder de blokkeeroplossing een smart beweging van de plaat over een spoelbak en voeg 100 ul genormaliseerde gebiotinyleerd monomere lokaas de geschikte putjes en geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
4. Verwijder het aas monsters van de plaat door upturning de plaat en slim te vegen over een wastafel, en was 3 keer in PBST.
5. Voeg 100 pi van de genormaliseerde pentamerized prooi construct in elk putje en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 1 uur was als in stap 4.4 en alleen uitvoeren een laatste wassen met PBS.
6. Voeg 60 ul van 242 uM nitrocefin oplossing (5 mg opgelost in 500 pL nitrocefin DMSO, meng en verder de nitrocefin verdund in 40 ml PBS en passeren door een 0,22 pm filter voor het toevoegen aan platen) en incuberen bij kamertemperatuur . Positieve interacties kan worden waargenomenop het oog aangezien de gele nitrocefin wordt gehydrolyseerd tot een rode kleur. Kwantificeren door het lezen van de absorptie bij 485 nm met behulp van een plaat lezer. Een typische plaat en kwantificering is weergegeven in Fig. 4.

[Tip: positieve interacties worden gewoonlijk binnen 2 uur bij kamertemperatuur maar platen worden geplaatst bij 4 ° C gedurende 16 uur om alle mogelijke interacties worden opgespoord. We hebben ook ontdekt dat neergeslagen nitrocefin en tekortkomingen in het plastic van de microtiterplaat, zoals krassen / vingerafdrukken af ​​en toe naar artefactual valse positieven op 485 nm leiden ondanks dat er geen openlijke nitrocefin hydrolyse. Het is daarom raadzaam om foto's van de platen te nemen om visueel op te nemen nitrocefin omzet in de putten.]

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van een representatieve AVEXIS afschermplaat is in figuur 4. Men moet in acht hydrolyse (geel naar rood) van de nitrocefin substraat in depositieve controle putjes (zowel het antilichaam gemedieerde prooi opnameknop en positieve controle interactie) in ongeveer tien minuten. Sommige interacties binnen het scherm zijn ook waargenomen binnen deze tijdschaal, maar anderen kan het langer duren (enkele uren) te verschijnen. Gewoonlijk een hit-van ongeveer 0,4-0,6% (positieve interactie elke 150-250 interacties gescreend) typisch afhankelijk van het eiwit libraries worden gescreend.

Figuur 1. Identificatie van receptor-ligand interacties tussenbeide komen voor cellulaire processen met behulp van erkenning AVEXIS. Het schema toont twee samenwerkende cellen (A en B) uitwisselen van informatie interactie tussen membraan ingebedde receptoreiwitten. AVEXIS een schaalbaar eiwit interactie assay speciaal ontworpen nieuwe receptor-ligand paren die worden gekenmerkt door een zeer zwakke interactie sterke identificeren. Recombinant zoluble eiwit bibliotheken die de hele ectodomein van de cel receptor aan de oppervlakte repertoire van beide cellen zijn ofwel samengesteld als pentamere β-lactamase-gelabeld prooien (cel type A) of monomere biotine-gelabeld aas (voor cel-type B). De pentamerisation van prooien verhoogt de lokale concentratie van de ectodomains een algemene aviditeit voordeel bewerkstelligen zodat zelfs zeer kortstondige interacties worden opgespoord. Het aas bibliotheek is gekleed op streptavidine-gecoate platen en systematisch gezocht heeft naar interacties met de prooi eiwitten. Na een korte wasbeurt, worden alle gevangen prooien gedetecteerd met behulp van de β-lactamase activiteit in verband met de prooi.

Figuur 2. Lokaas en prooi construct ontwerp. (A) De rat CD200 receptor eiwit als voorbeeld van hoe de gehele ectodomains van celoppervlak receptor eiwitten bepaald en primers zijn ontworpen om zowel lokaas teen prooi expressie constructen. De cDNA en vertaald eiwitsequentie zijn vanaf de N-terminale signaalpeptide de membraanomspannende transmembraangebied van rat CD200. Een sense primer is ontworpen om een ​​5 'Notl restrictie-enzym site optimale Kozaksequentie gevolgd door 25 basen van exact volgorde aan de CD200 cDNA sequentie behoren. De antisense primer omvat een Ascl website en 25 bases van de exacte overeenkomst volgorde onmiddellijk stroomopwaarts van de geselecteerde ectodomein truncatie residu bevindt. Om de ectodomein te houden in frame met de rat Cd4d3 +4 tag, moet de Ascl site te vertalen als Gly-Ala-Pro. (B) Een schematische voorstelling van het aas en prooi expressie constructen. Elk bevat receptor ectodomains geflankeerd door Notl en Ascl sites en een Cd4d3 +4 tag. De lokaas bevatten een C-terminaal peptide sequentie die specifiek kunnen worden door cotransfectie monobiotinylated met een plasmide dat een afgescheiden BirA enzym. De prooien worden gevolgd door het pentamerisation sequentievan het kraakbeen oligomere matrix eiwit (COMP) en β-lactamase enzym.

Figuur 3. Normalisatie van het aas en prooi eiwitten. (A) Representatieve voorbeelden van aas normalisatie. Een verdunningsreeks van vier gedialyseerde lokaas supernatanten werden aangetoond d.m.v. ELISA met een anti-CD4 tag monoklonale antilichaam. De vier aas worden uitgedrukt op verschillende niveaus 1> 2> 3> 4. Aas moet worden genormaliseerd naar een drempelwaarde dat de biotine bindingsplaatsen in elke goed verzadigd. Sterk uitgedrukt aas kan worden verdund aan eiwit te besparen (bijv. aas 1 kan worden verdund ~ 1:100), en slecht uitgedrukt aas geconcentreerd. Verminderde metingen bij lage verdunningen worden soms waargenomen bij sommige aas (bijv. aas 2) die is toe te schrijven aan de aanwezigheid van niet-geconjugeerde D-biotine door onvolledige dialyse. (B) De niveaus waarop prooi eiwitten zijn exingedrukt wordt gekwantificeerd met behulp van de hydrolyse snelheid van een β-lactamase substraat, nitrocefin. In het getoonde voorbeeld zijn de drie prooien uitgedrukt op verschillende niveaus prooi 1> 2> 3. Prooien worden genormaliseerd tot activiteit van ~ 2 nmol min ^-1, hetgeen overeenkomt met hydrolyse van 14,5 nmol nitrocefin voltooien ~ 7 minuten (bijv. prooi 1). De andere prooien in dit voorbeeld worden geconcentreerd voor gebruik in screening.

Figuur 4. Vertegenwoordiger AVEXIS screening resultaten. (A) Een foto van een vertegenwoordiger AVEXIS screening plaat. Een prooi eiwit wordt probed tegen 41 verschillende aas en een positieve interactie wordt gedetecteerd in goed E2. Controles in de afschermplaten omvat: een gebiotinyleerde anti-CD4 antilichaam alle prooi eiwit vangen toegevoegd en (G6), een controle interactie: rat CD200 (lokaas)-Cd200R (prooi) met Cd200R prooi gebruikt drempel verdunning (H3), 1:10 (H4) en 1:100 (H5). Negatieve controles waren: een Cd4d3 +4 aas afgetast met de prooi eiwit wordt gescreend (H1) en de Cd200R prooi (H2). (B) Kwantificering van de absorptie waarden van hetzelfde scherm in drievoud uitgevoerd. Datapunten zijn gemiddelden ± SD.

Discussie

Bij levende cellen worden waargenomen in vivo, hun plasma membranen vertonen zeer dynamische gedrag: in-en uitrollen membraanprocessen als ze contact op te nemen en communiceren met hun buren ^2. De fysieke wisselwerking tussen het membraan-ingebed receptor-eiwitten die veel van deze contacten bemiddelen hebben zich ontwikkeld tot een uiterst zwak om dit zeer beweeglijke gedrag mogelijk te maken. Er wordt geschat dat de monomere interactie sterke punten zo zwak als 50 pM kan volstaan ​​om de spontane interacties op fysiologische receptor dichtheden ^9, dat maakt het opsporen van nieuwe interacties extreem uitdagend ^2,10 rijden. De AVEXIS hier beschreven methode is een gevoelige methode voor het detecteren van transiënte extracellulair eiwit: eiwit interacties die kunnen op een schaalbare manier worden uitgevoerd met een lage valse meldingen. Terwijl andere schaalbaar methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren extracellulaire interacties ^11-15een voordeel van AVEXIS is dat de experimentele parameters, zoals het aas en prooi activiteiten zijn gekwantificeerd om zelfs detecteren van de zwakste van de interacties (t _1/2 ≤ 0,1 s) met behoud van een lage valse meldingen ^3. Daarnaast zijn de gestroomlijnde en robuuste monstervoorbehandelingsprocedures staat deze test uit te voeren op een veel grotere schaal dan andere testen en we hebben onlangs beschreven op een systematische interactie scherm in totaal meer dan ~ 16.500 mogelijke interacties ^16.

De test kan worden uitgevoerd op een eiwit dat het mogelijk is geven een oplosbare recombinante eiwit fragment. Dit omvat ook eiwitten die een N-terminale signaalpeptide als type I, GPI gekoppeld en uitgescheiden eiwitten bevatten. We hebben onlangs ontwierpen een reeks van vectoren die nu ons in staat stellen type II eiwitten tot expressie als aas ^17. De test het algemeen niet geschikt voor multipass membraan eiwitten zoals ion transporters of pompen, omdat zij waarschijnlijk correct gevouwen buiten het kader van de plasmamembraan. We hebben toegepast om een verscheidenheid van verschillende systemen en succes uitgedrukt extracellulaire eiwitten zebravis ^3,16,18, mens, muis en P. falciparum voor interactie schermen.

In termen van de middelen die nodig zijn om een ​​AVEXIS scherm, hebben we ontdekt dat een belangrijk knelpunt is de selectie, bouw, en de volledige sequentie van het expressieplasmiden. Dit aspect van de methode kan tot een jaar ~ 100 lokaas en prooi constructies te maken, maar met de dalende kosten van gen-synthese, hebben we nu in de handel te bevorderen besteden dit aspect van het project. Het zoogdierexpressiesysteem samen met een groot schudden weefselkweek incubator (gebruiken we een INFORS HT Multitron Cell) kan een enkele onderzoeker uit te drukken en te normaliseren tot ~ 100 lokaas en prooi eiwitten per maand. Zodra de eiwitten worden geproduceerd en genormaliseerd, screening interacties is snel met tot twaalf 96-wells platen worden vervolgens verwerkt per dag. De enige maat apparatuur die wij hebben ontworpen om de productie van dergelijke grote aantal eiwitten vergemakkelijken is perslucht aangedreven zuiger die gebruikt wordt om tot voorbij vijf supernatanten door een filter 0.22μm parallel.

De belangrijkste klasse van interacties die kunnen gemist worden in vergelijking met de interacties verwacht van de literatuur (fout-negatieven) zijn homophilic interacties, hoewel sommige van deze interacties kunnen worden gedetecteerd ^3. In de gevallen waarin te verwachten interacties niet worden gedetecteerd, zijn wij van mening dat dit te wijten is aan de vorming van homophilic interacties door de prooi eiwitten (een prooi "maskeren"-effect), die vervolgens voorkomt verdere interacties met geïmmobiliseerde aas eiwitten. De frequentie waarmee interacties gedetecteerd afhankelijk van de inhoud van het eiwit bibliotheek worden gescreend. Als richtlijn voor de lezer, een scherm van> 30, 000 interacties binnen de zebravis immunoglobuline superfamilie resulteerde in 188 meldingen - een frequentie van 0,6% ^3,16,18. Een snelle controle kan worden uitgevoerd om positieve resultaten verifiëren om te bepalen of de interactie kan worden gedetecteerd in zowel lokaas-prooi oriëntaties, die kan dezelfde interactie onafhankelijk worden gedetecteerd of de eiwitten aanwezig als ofwel een lokaas of een prooi. Wanneer we deze heen en weer gaande gedrag waargenomen, is de binding vervolgens aangetoond om specifiek te zijn door aan te tonen direct verzadigbare binding van gezuiverde eiwitten met oppervlakte-plasmonresonantie. Benadrukt moet worden dat, omdat we binding aviditeit te verhogen door kunstmatig pentamerising de prooi eiwitten, we niet de test geschikt is voor kwantitatief vergelijken van interactie sterke punten te overwegen. Om biofysische binding parameters van de interacties die we gebruiken monomere proteïnen en Surface Plasmon Resonance te verkrijgen. Ten slotte, als een interactie is geïdentificeerd, de high doorvoer aard van de assay maakt het relatief eenvoudig aan te passen aan de test scherm reagentia zoals antilichamen of kleine moleculen die de interactie blokkeren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Cat. Aantal	Reacties
Freestyle media	Invitrogen	12338018
Nitrocefin	Calbiochem	484400
SA gecoate microtiterplaten	Nunc	734-1284
OX68 antilichaam	AbDSerotec	MCA1022R
Dialysebuis	Doorboren	PN68100
Polymyxine B	Sigma	P4932
D-biotine	Sigma	B4639-5G
Substraat-104	Sigma	1040-506
Vivaspin-20 centrifugale concentrators	Sartorius	VS2002
0,22 pm filters	Nalgene	190-2520