Het analyseren van cellulaire internalisatie van nanodeeltjes en bacteriën door Multi-spectrale Imaging flowcytometrie

Summary

In dit artikel beschrijven we een methode gebruik te maken van multi-spectraal imaging flowcytometrie om de internalisering van polyanhydride nanodeeltjes of bacteriën door RAW 264.7 cellen te kwantificeren.

Abstract

Nanodeeltjes systemen naar voren zijn gekomen als waardevolle instrumenten in de toediening van vaccins door hun vermogen om efficiënt te leveren goederen, waaronder eiwitten, aan antigeen presenterende cellen ^1-5. Internalizatie van nanodeeltjes (NP) door antigeen-presenterende cellen een belangrijke stap in het genereren van een effectieve immuunrespons de ingekapselde antigeen. Om hoe veranderingen in nanopartikelformulering invloed functie te bepalen, hebben we getracht een high throughput, kwantitatieve experimentele protocol dat in overeenstemming was met het opsporen van geïnternaliseerde nanodeeltjes evenals bacteriën te ontwikkelen. Tot op heden zijn twee onafhankelijke technieken, microscopie en flowcytometrie, zijn de methoden die worden gebruikt om de fagocytose van nanodeeltjes te bestuderen. De high throughput aard van flowcytometrie genereert robuuste statistische gegevens. Echter, als gevolg van lage resolutie, is niet nauwkeurig te kwantificeren geïnternaliseerd versus cel gebonden nanodeeltjes. Microscopie genereert beelden met een hoge ruimtelijke resolutie, hHof toevoegde, het is tijdrovend en het gaat om kleine steekproeven ^6-8. Multi-spectrale beeldvorming flowcytometrie (MIFC) is een nieuwe technologie die aspecten van zowel microscopie en flowcytometrie dat multi-color spectrale fluorescentie en helder field imaging voert tegelijkertijd door middel van een laminaire kern opgenomen. Deze mogelijkheid biedt een nauwkeurige analyse van fluorescent signaal intensiteiten en ruimtelijke relaties tussen verschillende structuren en cellulaire functies op hoge snelheid.

Hierin beschrijven we een methode gebruik te maken van MIFC om de celpopulaties die zijn geïnternaliseerd polyanhydride nanodeeltjes of Salmonella enterica serovar Typhimurium karakteriseren. We beschrijven ook de voorbereiding van nanodeeltjes suspensies, cel-etikettering, de verwerving van een ImageStream ^X-systeem en de analyse van de gegevens met behulp van het IDEAS-toepassing. Ook tonen de toepassing van een techniek die kan worden gebruikt om de internalisatie p onderscheidenathways voor nanodeeltjes en bacteriën door het gebruik cytochalasine-D als een remmer van actine-gemedieerde fagocytose.

Protocol

1. RAW 264,7 Cel Cultuur

1. Harvest RAW 264.7 cellen van hun kolven wanneer zij confluentie door schrapen ze voorzichtig met een cel schraper. Graaf en plaat ze in een 24 goed celkweek schotel bij een dichtheid van 5 x 10 ⁵ cellen / putje in 0,5 ml volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (cDMEM, 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 2 mM Glutamax, en 10 mM HEPES) en overnacht bij 37 ° C incuberen in _5% CO2 incubator.

2. Pathogene Salmonella enterica serovar Typhimurium 14028 Transformatie en Cultuur

1. Stel recombinant plasmiden green fluorescent protein (GFP) te ....

Discussion

Onderzoek heeft aangetoond dat biologisch afbreekbare nanodeeltjes gebaseerd op poly (melkzuur-co-glycolzuur (PLGA) of polyanhydriden kan worden ingekapselde antigenen of geneesmiddelen leveren doelcellen. Opname van deze nanodeeltjes van fagocyten belangrijk voor de effectiviteit, waardoor kwantitatieve . analyse van de internalisatie van cruciaal belang in het ontwerpen van nieuwe nanodeeltjes systemen Door gebruik te maken van deze methode kan differentiële opname van nanodeeltjes door verschillende celtypen worden g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
RAW 264,7 cellijn	American Type Culture Collection (ATCC)	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	10 tot 013-CV
Foetaal runderserum	Atlanta Biologicals	S 11150	Van hoge kwaliteit
Glutamax	Gibco	35050-061
HEPES	Gibco	15630-080
24-wells plaat	TPP	92024
Celcultuur Kolven	TPP	90151
Cell schraper	TPP	99002	24 cm
Salmonella enterica serovar Typhimurium	ATCC	14028
BTX ECM630 Electro Cell Manipulator	BTX Harvard Apparatuur
MOPS	Fisher Scientific	BP308
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)	Cellgro	21 tot 040-CV
Ultrasoon vloeistof processor	MisOnix	S-4000
Cytochalasine-D	Sigma-Aldrich,	C8273
Formaldehyde	Polysciences	04018
Was buffer	2% hitte geïnactiveerd FBS, 0,1% natriumazide in PBS.
Perm / wasbuffer	BD Biosciences	554714
Clear-view klikdop microbuisjes	Sigma	T4816
Alexa Fluor phalloidin 660	Invitrogen	A22285
ImageStream X	Amnis CorporaTIE	100200	Opties: 658nm laser, autosampler
Natriumazide	Fisher Scientific	S 227I-500