De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Eierstokkanker is de vijfde belangrijkste oorzaak van kanker gerelateerde sterfgevallen in de Verenigde Staten 1. Ondanks een positieve eerste reactie op therapieën, 70 tot 90 procent van de vrouwen met eierstokkanker te ontwikkelen nieuwe uitzaaiingen, en de herhaling is vaak dodelijk 2. Het is daarom nodig om te begrijpen hoe secundaire uitzaaiingen ontstaan om betere behandelingen voor tussen-en late stadium eierstokkanker te ontwikkelen. Eierstokkanker uitzaaiing ontstaat wanneer kwaadaardige cellen los te maken van de primaire tumor en de verspreiding van de hele buikholte. De verspreide cellen kunnen vormen meercellige clusters, of sferoïden, die ofwel blijft onthecht, of implantaat op organen in de buikholte 3 (figuur 1, Film 1).
Alle organen in de buikholte zijn bekleed met een enkele, continue, laag van mesotheelcellen 4-6 (figuur 2). Echter mesotheelcellen ontbreken van onderperitoneale tumor massa's, zoals blijkt uit electronen microscoop studies van weggesneden menselijk tumorweefsel secties 3,5-7 (figuur 2). Dit suggereert dat mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de tumormassa door een onbekende proces.
Vorige in vitro experimenten toonden aan dat de primaire eierstokkanker cellen efficiënter te hechten aan extracellulaire matrix dan mesotheelcellen 8, en meer recente studies is gebleken dat primaire peritoneale mesotheelcellen eigenlijk een barrière te verstrekken aan eierstokkanker celadhesie en invasie (in vergelijking met adhesie en invasie op substraten die niet waren bedekt met mesotheelcellen) 9,10. Dit zou betekenen dat mesotheelcellen fungeren als een barrière tegen eierstokkanker metastase. De cellulaire en moleculaire mechanismen die eierstokkanker cellen inbreuk pleegt op deze barrière, en exclusief de mesothelium hebben, tot voor kort nog onbekend.
Hier beschrijven we ee methode voor een in vitro assay dat modellen de interactie tussen ovarium kankercellijn sferoïden en mesotheelcellen in vivo (figuur 3 Film 2). Ons protocol werd aangepast van vroeger beschreven methoden voor het analyseren van ovariële tumor cel interacties met mesotheelcellen monolagen 8-16, en werd voor het eerst beschreven in een rapport waaruit blijkt dat het ovariële tumor cellen maken gebruik van een integrine-afhankelijke activering van myosine en trekkracht, met uitsluiting van de bevordering van mesotheelcellen van onder een tumor sferoïde 17. Dit model maakt gebruik van time-lapse fluorescentie microscopie om toezicht te houden de twee celpopulaties in real time en biedt ruimtelijke en temporele informatie over de interactie. De ovarium kankercellen drukken rood fluorescent eiwit (RFP) terwijl de mesotheelcellen drukken green fluorescent protein (GFP). RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden hechten aan de GFP expressie mesotheelcellen monolaag. De sferoïden verspreiding, binnen te vallen, endwingen mesotheelcellen opzij een gat in de monolaag. Dit gat is weergegeven als de negatieve ruimte (zwart) in de GFP beeld. De oppervlakte van de opening kan dan worden gemeten kwantitatief te analyseren verschillen in afstand activiteit tussen controlegroep en populaties van ovariumkanker en / of mesotheelcellen. Deze test vereist slechts een klein aantal van eierstokkanker cellen (100 cellen per sferoïde X 20-30 sferoïden per conditie), zodat het haalbaar is om deze test met behulp van kostbare primaire tumor cel monsters uit te voeren. Bovendien kan deze assay gemakkelijk worden aangepast voor high throughput screening.
Protocol
1. Ovarian Cancer Cell Spheroid Vorming
- RFP expressie ovariumkanker cellen gekweekt in 10% basismedium (een maat celkweekmedium bevattende een 50:50 mengsel van 199 en MCDB105 10% geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% pen-strep). Om RFP uitdrukken gelabelde ovarium kankercellen transfecteren de cellen met een plasmide dat RFP en selecteren cellen die RFP. Als alternatief kan virale vectoren worden gebruikt om op transiënte drukken fluorescente eiwitten en cellen kan vooraf geïncubeerd met een fluorescerende kleurstof cel tracker (Invitrogen).
- Voorafgaand aan het vormen van ovariumkanker sferoïden, moet bereiden lage wrijvingscoëfficiënt 96 en ronde bodem kweekschalen. Om lage wrijvingscoëfficiënt kweekplaten produceren 30μl poly-HEMA (6 mg polyhydroxyethylmethacrylaat in 1 ml 95% EtOH) oplossing toegevoegd aan elk putje van een 96 Corning celkweek schotel. De platen met 96 putjes werden geïncubeerd in een 37 ° C niet-bevochtigde incubator de ethanol, l verdampeneaving een laag poly-HEMA op elk putje. Deze poly-HEMA film voorkomt cellen zich hecht aan de bodem van de put, waardoor de cellen in suspensie groeien 18. [Als alternatief kan Ultra-Low Attachment kweekplaten (Corning) worden gebruikt in plaats van poly-HEMA gecoat gerechten.]
- Na het lage-adhesie kweekplaten bereid, trypsinize een plaat ovarium kankercellen pellet cellen in een tafelblad centrifuge (Heraeus) 900 RCF 3 minuten zuig de supernatant en in suspensie opnieuw in 10% basismedium.
- Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Stel de concentratie van cellen, dat er 100 cellen per 50 ul 10% basismedium.
- Voeg 50 ul van het uniform opgeschort verdunde celsuspensie in elke well van de 96 goed poly-HEMA gecoate cultuur schotel.
- Incubeer de plaat met 96 putjes in een 37 ° C celkweek incubator gedurende 16 uur (de tijd worden verhoogd of verlaagd afhankelijk van de hoeveelheid tijd dieeen bepaalde cel lijn naar meercellige sferoïden of gewenst experimentele condities) vormen voor de eierstokkanker cellen samen te laten cluster, de vorming van een meercellige sferoïde in elk putje. Sommige tumorcellen apoptose ondergaan in deze periode is het van belang een tijd kiezen voor inductie van apoptose.
2. Mesothelial Cell monolaagvorming
- In een celkweek kap voorlaag de putjes van een 6 goed glazen bodem MatTek schaal met fibronectine door toevoeging van 2 ml van een 5μg fibronectine / ml PBS oplossing in elk putje van de schotel en incubatie bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. De optische kwaliteit van het glas-bottoms in MatTek gerechten zorgen voor een hoge resolutie microscopische beeldvorming.
- GFP-expressie mesotheelcellen gekweekt in 10% basismedium. Trypsinize een plaat van mesotheelcellen, naar beneden draaien in een tafelblad centrifuge (Heraeus) op 900RPM gedurende 3 minuten, zuig het supernatant, en opnieuw te schorten in 10% Base Medium. Demesotheelcellen hier gebruikt reeds expressie GFP wanneer ze verkregen, maar ongelabelde mesotheelcellen kan worden door transfectie met een plasmide dat GFP cDNA of preincubating de cellen in een groen fluorescerend cel tracker kleurstof (Invitrogen).
- Na de 30-minuten fibronectine incubatie (in stap 2.1), was de putjes van de MatTek schotel met 2 ml PBS.
- Zuig het PBS en de plaat 6 x10 5 mesotheelcellen cel per putje in elke well van de 6 goed MatTek schotel. Incubeer de MatTek schotel in een 37 ° C celkweek incubator nacht om de mesotheelcellen te hechten aan de schaal en een monolaag vormen.
3. Mesothelial Cell Clearance Assay
- Gebruik een pipet om de kanker van de eierstokken sferoïden te halen bij de 96 en poly-HEMA gecoate plaat.
- Zuig het medium van een goed van de 6 goed MatTek schotel met een mesotheelcellen cel monolaag. Was eenmaal met 2 ml PBS. Voeg alle sferoïden van de 96 goed plaat een put van het MatTek schotel (3x ~ het aantal sferoïden die zullen worden afgebeeld om rekening te houden sferoïden landing van de zijde van de schotel te kunnen afgebeeld).
- Plaats de MatTek schotel op het podium van een omgekeerde groothoek fluorescentiemicroscoop staat om time-lapse imaging voor de duur van ten minste 8 uur. Gebruik een gemotoriseerde podium om afbeelding meerdere posities in de schotel, met meerdere sferoïde intercalatie gebeurtenissen, in een enkel experiment. We maken gebruik van een Nikon Ti-E Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop met geïntegreerde Perfect Focus System en lage [20x-0.75 numerieke apertuur (NA)] vergroting / NA differentieel interferentie contrast (DIC) optica, een Nikon halogeen transilluminator met 0,52 NA lange werkafstand (LWD) condensor, Nikon snel (<100 ms schakeltijd) excitatie en emissie filters (GFP Ex 480/40, Em 525/50, RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50), Sutter snel overgedragen en epifluorescentie lichtpad Smart Shutters, een Nikon lineaire-gecodeerde gemotoriseerde podium, een Hamamatsu ORCA-AG gekoeld charge-coupled device (CCD) camera, een custom-built microscoop incubatiekamer met de temperatuur en CO 2-controle, Nikon NIS-elementen AR-software versie 3, en een TMC trillingsisolatie tafel.
- De ovarium kankercellijn sferoïden zal naar de bodem van de schotel en hechten aan de mesotheelcellen celmonolaag. Verzamel GFP, RFP en fase beelden van de 20 + sferoïde / monolaag interacties, elke 10 minuten, gedurende 8 uur.
- De RFP expressie ovarium kankercellijn sferoïden zal binnendringen in de GFP expressie mesotheelcellen celmonolaag een gat in de monolaag. Na 8 uur meten de grootte van de gaten door het opsporen van de zwarte gaten GFP beelden met behulp Elements (of een ander geschikt software zoals beeld J). Normaliseren gatgrootte de eerste bolvormige grootte wordt door het gat 8 uur door de grootte van de bolvormige de overeenkomstige RFP beeld op tijdstip nul. In exruime, werd het gat grootte slechts een keer gemeten, maar het kan gemeten worden meerdere keren gedurende de acht uur durende experiment beter inzicht in de dynamiek van intercalatie.
4. Representatieve resultaten
In dit voorbeeld vergeleken mesotheelcellen goedkeuring vermogen van OVCA433 ovarium kankercellijn sferoïden dat verzwakte expressie van Talin-1 OVCA433 sferoïden beheersen. OVCA433 sferoïden van elke groep werden toegevoegd aan een MatTek schotel met ZT mesotheelcellen celmonolagen. Zes sferoïden van elke groep werden afgebeeld elke 10 minuten voor acht uur (Figuur 4, Film 3, Film 4). De gaten die in de monolaag door het verspreidorgaan sferoïden gemeten en zes positie van elke groep werden gemiddeld. Figuur 4 laat zien dat de gemiddelde klaring gebied gecreëerd door Tallinn een knockdown sferoïden was aanzienlijk kleiner dan de gemiddelde oppervlakte aan controle sferoïden, wat suggereert dat Tallinn is vereist voor mesotheelcellen klaring door OVCA433 eierstokkanker sferoïden.
Figuur 1. Eierstokkanker Metastase. Primaire ovariële tumoren te ontwikkelen, hetzij bij de ovariële oppervlakte-epitheel of eileiders. Tumorcellen / clusters af te breken uit de primaire tumor en verzamelen in de buikholte. Tumorcellen kunnen dan samen tot meercellige sferoïden te vormen. Sferoïden dan hechten aan de mesotheelcellen cel monolagen langs de buikholte. De mesotheelcellen zijn uitgesloten van onder de bijgevoegde ovariumkanker sferoïde, waardoor de sferoïden toegang tot de onderliggende kelder membraan te verkrijgen.
Movie 1. Eierstokkanker Metastase. Klik hier om film te bekijken .
Figuur 2. mesotheelcellen lijn het oppervlak van menselijke peritoneale weefsel en zijn uitgesloten van onder eierstokkanker cel implantaten.
Figuur 3. Mesothelial Clearance Assay. Ovarium kanker sferoïden gevormd door incubatie 100 RFP expressie ovariumkanker cellen per putje in een poly-HEMA gecoate 96 en rondbodem kweekschaal bij 37 ° C gedurende 16 uur. Poly-HEMA voorkomt dat de cellen hechten aan de kweekschaal, waardoor de cellen gesuspendeerd blijven en elkaar hechten tot een cluster vormt per well. Mesotheelcellen celmonolagen bereid door uitplaten 6x10 5 mesotheelcellen per putje in een fibronectine gecoate 6 goed MatTek schaal en incuberen van de plaat bij 37 ° C gedurende 16 uur. De sferoïden worden vervolgens overgedragen aan de MatTek schotel met de mesothelial monolaag en de twee celpopulaties worden afgebeeld elke 10 minuten voor 8 uur met een Nikon Ti-E-Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop en Elements-software.
Movie 2. Mesothelial Ontruiming Assay. Klik hier om film te bekijken .
Figuur 4. Verzwakking van Tallinn 1 expressie in OVCA433 sferoïden verlaagt mesotheelcellen klaring vermogen. OVCA433 sferoïden (rood) met en zonder verzwakte expressie van Talin een mochten hechten aan en in een ZT mesotheelcellen monolaag (groen) dringen. De twee celpopulaties werden afgebeeld elke 10 minuten voor 8 uur met een Nikon Ti-E Inverted Gemotoriseerde Widefield Fluorescentie time-lapse microscoop en elementen software. De grafiek laat zien dat Tallinn een verzwakkingaanzienlijk vermindert mesotheelcellen cel klaring (kwantiel plot met groene balken aan de middelen).
Movie 3. Controle OVCA433 sferoïden (rood) binnen te vallen in een mesotheelcellen monolaag (groen). Klik hier om film te bekijken .
Movie 4. Verzwakking van Tallinn 1 expressie in OVCA433 sferoïden (rood) vermindert mesotheelcellen (groen) ruimte vermogen. Klik hier om de film te bekijken .
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De "Mesothelial Clearance Assay" hier gepresenteerde maakt gebruik van time-lapse microscopie te zien op de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen, in grote ruimtelijke en temporele detail. Eerder had een aantal groepen 8-14 gebruikt eindpunt testen aan te tonen dat eierstokkanker cellen hechten aan en binnen te vallen in mesotheelcellen cel monolagen. Deze test is uniek omdat het gebruikt fluorescent gelabelde cellen te onderscheiden tumorcellen van me...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Wij hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We willen graag de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School, in het bijzonder Jennifer Waters, Lara Petrak en Wendy Zalm, voor de opleiding en het gebruik van hun timelapse microscopen bedanken. Wij zouden ook graag Rosa Ng en Achim Besser bedanken voor waardevolle discussies. Dit werk werd ondersteund door NIH Grant 5695837 (tot M. Iwanicki) en GM064346 aan JSB, door een subsidie van Dr Miriam en Sheldon Adelson G. Medical Research Foundation (tot GCO).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | Vennootschap | Catalogusnummer | Reacties |
| OVCA433 eierstokkanker cellen | Geschenk van Dr Dennis Slamon | ||
| ZT mesotheelcellen | Geschenk van Dr Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc | 117-500 | |
| FBS-warmte geïnactiveerd | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| Platen met 96 putjes | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylaat (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | Voor de poly-HEMA oplossing te ontbinden 6mg poly-HEMA poeder in 1 ml 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Verdun tot 95% in dH 2 0 |
| Celcultuur kap | Nuaire | NU-425-300 | |
| Weefselkweek incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator voor poly-HEMA platen | Labline Instrumenten | Keizerlijk III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 goed glazen onderste schaal | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectine | Sigma | F1141-1 mg | |
| PBS | Cellgro | 21 tot 040-CV | |
| Time-lapse microscoop: | |||
| Microscoop | Nikon | Ti-E Omgekeerde gemotoriseerde Fluorescentie time-lapse microscoop met geïntegreerde Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerieke apeture | |
| Halogeen transilluminator | Nikon | 0,52 NA lange werkafstand condensor | |
| Excitatie en emissie filters | Chroma single-pass filters in Nikon behuizing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Verzonden en Epifluoresce lichtpad | Sutter | Smart Shutters | |
| Lineaire-gecodeerde gemotoriseerde fase | Nikon | ||
| Gekoelde charged-coupled device-camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscoop incubatiekamer met de temperatuur en CO 2-controle | custom-built | ||
| Trillingsisolatie tafel | TMC | ||
| NOS-Elements-software | Nikon | Versie 3 |
Referenties
- Jemal, A. CA Cancer J. Clin. 59, 225-249 (2009).
- Ries, L. G., Melbert, D., Krapcho, M., Stinchcomb, D. G., Howlader, N., Horner, M. J., Mariotto, A., Miller, B. A. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2005. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. Available from: http://seer.cancer.gov/csr/1975_2005 (2007).
- Burleson, K. M. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Birbeck, M. S., Wheatley, D. N. An Electron Microscopic Study of the Invasion of Ascites Tumor Cells into the Abdominal Wall. Cancer Res. 25, 490-497 (1965).
- Witz, C. A., Monotoya-Rodriguez, I. A., Schenken, R. S. Whole explants of peritoneum and endometrium: a novel model of the early endometriosis lesion. Fertil. Steril. 71, 56-60 (1999).
- Zhang, X. Y. Characteristics and growth patterns of human peritoneal mesothelial cells: comparison between advanced epithelial ovarian cancer and non-ovarian cancer sources. J. Soc. Gynecol. Investig. 6, 333-340 (1999).
- Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. The First Line of Intra-abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer. Cancer Discovery. 1, 100-102 (2011).
- Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. J. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. An in vitro model system for studying tumor cell adhesion and invasion. Exp. Cell. Res. 160, 499-513 (1985).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Ksiazek, K. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids. J. Transl. Med. 4, 6-6 (2006).
- Heyman, L. Vitronectin and its receptors partly mediate adhesion of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Tumour. Biol. 29, 231-244 (2008).
- Heyman, L. Mesothelial vitronectin stimulates migration of ovarian cancer cells. Cell. Biol. Int. 34, 493-502 Forthcoming.
- Lessan, K., Aguiar, D. J., Oegema, T., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and beta1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
- Leroy-Dudal, J., Heyman, L., Gauduchon, P., Carreiras, F. Adhesion of human ovarian adenocarcinoma IGROV1 cells to endothelial cells is partly mediated by the alphav integrins-vitronectin adhesive system and induces an alteration of endothelial integrity. Cell. Biol. Int. 29, 482-488 (2005).
- Leroy-Dudal, J. Transmigration of human ovarian adenocarcinoma cells through endothelial extracellular matrix involves alphav integrins and the participation of MMP2. Int. J. Cancer. 114, 531-543 (2005).
- Iwanicki, M. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discovery. 1, 144-157 (2011).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Gregoire, L., Munkarah, A., Rabah, R., Morris, R. T., Lancaster, W. D. Organotypic culture of human ovarian surface epithelial cells: a potential model for ovarian carcinogenesis. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 34, 636-639 (1998).
- Roberts, P. C. Sequential molecular and cellular events during neoplastic progression: a mouse syngeneic ovarian cancer model. Neoplasia. 7, 944-956 (2005).
- Okada, T., Okuno, H., Mitsui, Y. A novel in vitro assay system for transendothelial tumor cell invasion: significance of E-selectin and alpha 3 integrin in the transendothelial invasion by HT1080 fibrosarcoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 12, 305-314 (1994).
- Zervantonakis, I. K., Kothapalli, C. R., Chung, S., Sudo, R., Kamm, R. D. Microfluidic devices for studying heterotypic cell-cell interactions and tissue specimen cultures under controlled microenvironments. Biomicrofluidics. 5, 13406-1310 (2011).
- Brandt, B. 3D-extravasation model -- selection of highly motile and metastatic cancer cells. Semin. Cancer Biol. 15, 387-395 (2005).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat. Rev. Cancer. 3, 921-930 (2003).
- Dai, J., Ting-Beall, H. P., Hochmuth, R. M., Sheetz, M. P., Titus, M. A. Myosin I contributes to the generation of resting cortical tension. Biophys. J. 77, 1168-1176 (1999).
- Laferriere, J., Houle, F., Taher, M. M., Valerie, K., Huot, J. Transendothelial migration of colon carcinoma cells requires expression of E-selectin by endothelial cells and activation of stress-activated protein kinase-2 (SAPK2/p38) in the tumor cells. J. Biol. Chem. 276, 33762-33772 (2001).
- Dong, C., Slattery, M. J., Rank, B. M., You, J. In vitro characterization and micromechanics of tumor cell chemotactic protrusion, locomotion, and extravasation. Ann. Biomed. Eng. 30, 344-355 (2002).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
