Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

Samenvatting

Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.

Samenvatting

De nanodisc is een schijfvormige deeltje (~ 10 tot 12 nm groot) die val membraaneiwitten in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. De nanodisc is zeer aantrekkelijk voor het bestuderen membraaneiwitten, met name in de context van ligand-receptor interacties. De methode ontwikkeld door Sligar en collega's is gebaseerd op de amfipatische eigenschappen van een sterk ontwikkelde a-helix scaffold eiwitten die afkomstig apolipoproteïne A1. De hydrofobe oppervlakken van de scaffold proteïne interactie met de vetacylgroepen zijketens van de lipide dubbellaag terwijl de poolgebieden maken het waterige milieu. Analyses van membraaneiwitten in nanodiscs duidelijk voordelen bieden liposoom omdat de deeltjes klein, homogeen en water oplosbaar. Bovendien kunnen biochemische en biofysische methoden gewoonlijk gereserveerd oplosbare eiwitten worden toegepast en aan beide zijden van het membraan. In deze visuele protocol we een stap-voor-stap reconstitutie van een goed tekensgekarakteriseerd bacteriële ABC transporter, de man-MalFGK ₂ complex. De vorming van de schijf een zelf-assemblage proces dat afhangt van hydrofobe interacties die plaatsvinden tijdens de geleidelijke verwijdering van het detergens. We beschrijven de essentiële stappen en we wijzen op het belang van het kiezen van een juiste eiwit-lipide naar verhouding om de vorming van aggregaten en grotere polydisperse liposoom-achtige deeltjes te beperken. Eenvoudige kwaliteitscontroles zoals gelfiltratiechromatografie, native gel elektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie ervoor dat de schijven correct zijn opgelost.

Protocol

Algemeen Reconstitutie Proces

De reconstitutie proces begint met het mengen van het membraan scaffold proteïne (MSP) met het gezuiverde MalFGK ₂ complex in de aanwezigheid van detergens-gesolubiliseerde fosfolipiden. De stap wordt gevolgd door de langzame verwijdering van het detergens door een adsorberend polystyreen materiaal genaamd Bio-Beads of Amberlite (figuur 1). De auto-assemblageproces komt meest waarschijnlijk door de apolaire interacties tussen de hydrofobe fosfolipiden, de MalFGK ₂ complex en het oppervlak van de MSP amfipatische eiwit. Het eindproduct is een schijfvormige deeltjes uit....

Discussie

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de reconstructie van de maltose transporter in nanodiscs. De transporteur is ATPase actief en de interactie met de oplosbare bindingspartner MalE opnieuw kunnen worden (figuur 3). De succesvolle reconstructie van de vervoerder in nanodiscs opent de weg voor extra biofysische en biochemische analyse. Van bijzonder belang is de systematische analyse zijn de MÄLK ATPase en maltose transport activiteit in wasmiddel, liposoom en nanodiscs. ABC-transporters wijzige.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Amicon Ultra-4 50K centrifugaalfilter	Millipore	UFC805008	Volg de fabrikant protocol voor een juist gebruik
Bio-Beads SM-2 Adsorbens	Bio-Rad	152-3920
E. coli totale lipiden	Avanti Polar Lipids	100500C	Opgelost in chloroform, behandelen als geschikt voor een organisch oplosmiddel
Ni sepharose hars HP	GE Healthcare	17-5268-01
Fosfor standaardoplossing	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tabel I. specifieke reagentia.
			Naam Samenstelling Reacties DDM voorraad 10% w / v DDM Resuspendeer in milliQ water en bewaar bij -20 ° C MalFGK 2 stock 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM Bewaren bij -70 ° C na zuivering MSP voorraad 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol Bewaren bij -70 ° C na zuivering in <1 ml aliquots en voorkomen vries / dooi cycli Fosfolipide voorraad 5 nM E. coli totaal lipiden 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Bewaar bij 4 ° C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol Bewaar bij 4 ° C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v glycerol Bewaar bij 4 ° C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM Bewaar bij 4 ° C en voeg DDM vlak voor gebruik Tabel II. Solution recepten.