Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

Samenvatting

Nanodiscs zijn kleine discoïde deeltjes die membraaneiwitten te nemen in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. We een visuele protocol dat de stap-voor-stap opname van de MalFGK2 transporter in een schijf toont.

Samenvatting

De nanodisc is een schijfvormige deeltje (~ 10 tot 12 nm groot) die val membraaneiwitten in een klein stukje van de fosfolipide dubbellaag. De nanodisc is zeer aantrekkelijk voor het bestuderen membraaneiwitten, met name in de context van ligand-receptor interacties. De methode ontwikkeld door Sligar en collega's is gebaseerd op de amfipatische eigenschappen van een sterk ontwikkelde a-helix scaffold eiwitten die afkomstig apolipoproteïne A1. De hydrofobe oppervlakken van de scaffold proteïne interactie met de vetacylgroepen zijketens van de lipide dubbellaag terwijl de poolgebieden maken het waterige milieu. Analyses van membraaneiwitten in nanodiscs duidelijk voordelen bieden liposoom omdat de deeltjes klein, homogeen en water oplosbaar. Bovendien kunnen biochemische en biofysische methoden gewoonlijk gereserveerd oplosbare eiwitten worden toegepast en aan beide zijden van het membraan. In deze visuele protocol we een stap-voor-stap reconstitutie van een goed tekensgekarakteriseerd bacteriële ABC transporter, de man-MalFGK ₂ complex. De vorming van de schijf een zelf-assemblage proces dat afhangt van hydrofobe interacties die plaatsvinden tijdens de geleidelijke verwijdering van het detergens. We beschrijven de essentiële stappen en we wijzen op het belang van het kiezen van een juiste eiwit-lipide naar verhouding om de vorming van aggregaten en grotere polydisperse liposoom-achtige deeltjes te beperken. Eenvoudige kwaliteitscontroles zoals gelfiltratiechromatografie, native gel elektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie ervoor dat de schijven correct zijn opgelost.

Protocol

Algemeen Reconstitutie Proces

De reconstitutie proces begint met het mengen van het membraan scaffold proteïne (MSP) met het gezuiverde MalFGK ₂ complex in de aanwezigheid van detergens-gesolubiliseerde fosfolipiden. De stap wordt gevolgd door de langzame verwijdering van het detergens door een adsorberend polystyreen materiaal genaamd Bio-Beads of Amberlite (figuur 1). De auto-assemblageproces komt meest waarschijnlijk door de apolaire interacties tussen de hydrofobe fosfolipiden, de MalFGK ₂ complex en het oppervlak van de MSP amfipatische eiwit. Het eindproduct is een schijfvormige deeltjes uit twee moleculen MSP wikkelen rond de MalFGK ₂ complex. De deeltjes worden gescheiden van de adducten en aggregaten door ultra-centrifugatie en analytische size-exclusion chromatografie. De deeltjes worden gekenmerkt door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie.

titel "> 1. Voorbereiding van de membraan steiger Protein, MSP

1. De his-gelabeld MSP (versie MSP1D1 ¹⁾ wordt geproduceerd uit plasmide in E. pMSP1D1 coli BL21 (DE3) geïnduceerd bij _OD600 ~ 0,5 met 0,5 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside gedurende 3 uur bij 37 ° C.
2. De cellen worden geoogst door centrifugatie bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C en geresuspendeerd in TSG10 buffer die 100 uM phenylmethanesulfonyl fluoride.
3. De cellen worden gelyseerd met een Franse pers (3x) bij 8.000 psi en het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door centrifugeren bij 5000 g gedurende 10 min bij 4 ° C. De oplosbare fractie die het MSP geïsoleerd door ultra-centrifugatie bij 125.000 xg gedurende 45 minuten.
4. Het MSP wordt gezuiverd door nikkel-chelerende chromatografie met ~ 1,5 ml Ni Sepharose HP in TSG10 buffer. Verontreinigingen worden weggespoeld met TSG10 buffer die 50 mM imidazool. Het MSP wordt geëlueerd met TSG10 buffer bevattende 600 mMimidazool. Het gezuiverde eiwit wordt gedialyseerd in TSG10 buffer en opgeslagen in -70 ° C bij een eiwitconcentratie van ~ 10-15 mg / ml.

2. Voorbereiding van de MalFGK ₂ Complex

1. De MalFGK ₂ complex, his-tag aan de C-terminus van MÄLK, uitgedrukt uit plasmide pBAD22-FGK in E. coli BL21 (DE3) en geïnduceerd bij OD ₆₀₀ ~ 0,5 met 0,2% L-arabinose gedurende 3 uur bij 37 ° C.
2. Na cellysis en centrifugeren zoals in stap 1.3, wordt het membraan pellet geresuspendeerd in TSG20 buffer bij een eindconcentratie van 5 mg / ml. Het materiaal wordt opgelost met 1% w / v n-dodecyl-β-maltopyranoside (DDM) gedurende 3 uur bij 4 ° C onder zachtjes schudden.
3. Het onoplosbare materiaal wordt verwijderd door ultra-centrifugatie zoals in stap 1.3 en de supernatant met het opgeloste MalFGK ₂ complex wordt verzameld en gezuiverd zoals in stap 1.4, zonder dialyse.
4. Further zuivering wordt bereikt door gelfiltratiechromatografie in TSGD buffer op een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,5 ml / min.

3. Bereiding van Fosfolipiden

1. Een E. coli totale lipide extract opgelost in chloroform wordt gescheiden in 1000 nmol porties in schroefdop microcentrifugebuizen. Het oplosmiddel wordt verdampt onder een zachte stikstofstroom en vervolgens een nacht gedroogd in een vacuüm exsiccator.
2. De lipidefilm werd opgelost in TS buffer bij 5 nM eindconcentratie en gevortext krachtig en gesoniceerd. De opgeloste lipiden ziet er iets ondoorzichtige vanwege hun algemene onoplosbaarheid in water TS buffer, maar blijven in suspensie. DDM wordt toegevoegd tot een eindconcentratie van 0,5% (~ 10 mM), waarbij de oplossing helder wordt.
3. Het lipidemengsel wordt in een waterbad en pulse gesonificeerd 5 keer ~ 5 sec. Het lipidemengsel wordt opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week.

4. Voorbereiding van Bio-Beads

1. Ongeveer 10-15 ml (droog volume) Bio-Beads is geplaatst in een 50 ml buis.
2. De kralen worden achtereenvolgens gewassen met 50 ml 100% methanol, 95% ethanol, milliQ H ₂ O en tenslotte TS buffer (tweemaal elk).
3. De gewassen korrels werden bewaard bij 4 ° C in ongeveer 10 ml TS buffer.

5. Nanodisc Reconstitutie

1. Het MSP wordt verdund in buffer TSGD de eindconcentratie van ~ 7 mg / ml (~ 0,3 mM).
2. ~ 2 nmol gezuiverd MalFGK ₂ complex worden gemengd bij een eiwit: MSP: lipide-verhouding van 1:3:60 of 1:3:400 in TSGD buffer. De eindconcentratie is 6 uM MalFGK _2, 18 uM MSP en 360 uM lipiden (1:3:60) of 2,4 mM lipiden (1:3:400). Het eindvolume is 300 pl. De uiteindelijke concentratie DDM 0,08% (~ 1,6 mM). De eindconcentratie van glycerol afhankelijk van de hoeveelheid lipide toegevoegd maar blijft ongeveer 5-10% v / v.
3. ~ 50 pi Bio-Bead suspensie wordt aangebracht op de buis en het mengsel wordt een nacht geïncubeerd op een schommelende tafel bij 4 ° C.
4. De kralen worden gesedimenteerd door zwaartekracht en de oplossing wordt gepipetteerd door een smalle punt zoveel Bio-Beads vermijden mogelijk.
5. Grote precipitaten worden verwijderd door ultra-centrifugatie bij 100.000 xg gedurende 20 minuten. De schijven worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer. Fracties die de schijven worden samengevoegd en een monster opnieuw worden geïnjecteerd op dezelfde gelfiltratiekolom de stabiliteit van het prepareren.
6. De gezuiverde schijven kunnen bij -70 ° C gedurende langere tijd. Na ontdooien op ijs, moet de schijven worden onderworpen aan ultra-centrifugeren zoals in stap 5,5 tot verwijdering van potentiële neerslaat. Een aliquot wordt geanalyseerd door gelfiltratiechromatografie opdat significante aggregatie of precipitatie niet tijdens het ontdooienproces.

6. Inheemse Gel Elektroforese

1. 1 uM nanodiscs (-0,2 mg / ml) worden geanalyseerd door natieve PAGE ^{6, 7} (Tris-HCl pH 8,8, 4-12%) de kwaliteit van de reconstitutie (figuur 3A) te beoordelen.
2. De binding van MalE (1 uM) aan de MalFGK _2-complex opgelost in nanodiscs wordt ook beoordeeld via natieve-PAGE (Figuur 3A).
3. Na elektroforese wordt de gel gekleurd met Coomassie blauw gedurende 10 minuten, en ontkleurd voor ~ 1 uur.

7. Dynamic Light Scattering (DLS)

1. Nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie zoals in stap 2.4 in TSG10 buffer met een Superdex 200 HR 10/300 kolom met een stroomsnelheid van 0,1 ml / min. Fracties die nanodiscs worden samengevoegd en geconcentreerd tot ~ 10 mg / ml met een Amicon centrifugaal filter.
2. Het monster wordt twee keer gefilterd (0,22 urn filter) vóór analyse met behulp DLSeen Dynapro nanostar instrument (Wyatt Technology) in een 1 ul inwendig volume quartz cuvette. Gegevens worden bevestigd met de DYNAMICS software (Wyatt Technology) de diameter en het molecuulgewicht van de deeltjes schatten.

8. ATPase Afmetingen

1. De ATPase-activiteit van MalFGK _{2-gereconstitueerde} nanodiscs wordt bepaald met een colorimetrische assay ^8.
2. 1 uM gezuiverd discs en 1 mM ATP gemengd met toenemende hoeveelheden MalE en geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 20 minuten. De vrijgave van anorganisch fosfaat wordt gemeten bij 660 nm.
3. De hoeveelheid afgegeven fosfaat vergeleken met een standaardcurve gegenereerd met een fosfor standaardoplossing.

9. Representatieve resultaten

De nanodiscs worden gezuiverd door gelfiltratiechromatografie (Figuur 2A links). Het chromatogram toont aan dat de meerderheid van de gereconstitueerde dISC (zwarte trace) elueren als een enkele piek, terwijl schijven gemaakt met overmaat lipiden (rood spoor) elueren in het lege volume en als een reeks van brede pieken. De kwaliteit van de nanodiscs wordt verder geanalyseerd door natieve gelelektroforese en dynamische lichtverstrooiing spectroscopie (DLS). Goed opgeloste discs migreren als een scherpe band op de gel dat de gereconstitueerde in aanwezigheid van een overmaat lipiden migreren als uitstrijkje (Figuur 2A rechts). Analyse door DLS blijkt dat de disc populatie homogeen met een gemiddelde diameter van 11,4 nm (Figuur 2B). De gereconstitueerde schijven hebben een schijnbaar molecuulgewicht van 215 kDa op basis van de onderlinge DLS. Monsters gereconstitueerd in aanwezigheid van overmaat lipiden vertoning wijdverspreid radii ongeveer 100 nm, typisch voor niet-homogene monsters.

De kwaliteit van de MalFGK ₂ complex wordt bepaald door native gel elektroforese en ATPase activiteit doormetingen (figuur 3). De maltosebindingsproteïne MalE bindt met een hoge affiniteit aan de MalFGK ₂ transporter ^{9, 10.} Behulp van niet-denaturerende gelelektroforese, is het mogelijk te detecteren een complex tussen mannelijke en MalFGK ₂ (Figuur 3A). Het stimuleren van de MÄLK ₂ ATPase activiteit van MalE wordt getoond in figuur 3B.

Figuur 1. Typisch stroomschema voor de reconstitutie-protocol.

Figuur 2. Kwaliteitscontrole van de nanodisc voorbereiding. A. Gelfiltratie-analyse (Superdex 200 HR 10/300 kolom) van de nanodiscs opgelost bij lage lipide-ratio (1/3/60; zwart spoor) of hoge lipide ratio (1/3/400; rode spoor). Natieve gelelektroforese van dezelfde schijf preparaat. Molecular gewicht markers in kDa zijn aangegeven. B. Dynamische lichtverstrooiing analyse van dezelfde disc voorbereiding. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Analyse van de MalFGK _2-nanodisc deeltjes. A. Gel shift analyse van MalE geïncubeerd met toenemende hoeveelheden MalFGK _2-nanodisc deeltjes. B. ATPase activiteit van de MalFGK _2-nanodisc deeltjes als functie van MalE concentratie.

Discussie

We beschrijven een eenvoudige procedure voor de reconstructie van de maltose transporter in nanodiscs. De transporteur is ATPase actief en de interactie met de oplosbare bindingspartner MalE opnieuw kunnen worden (figuur 3). De succesvolle reconstructie van de vervoerder in nanodiscs opent de weg voor extra biofysische en biochemische analyse. Van bijzonder belang is de systematische analyse zijn de MÄLK ATPase en maltose transport activiteit in wasmiddel, liposoom en nanodiscs. ABC-transporters wijzige...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
Amicon Ultra-4 50K centrifugaalfilter	Millipore	UFC805008	Volg de fabrikant protocol voor een juist gebruik
Bio-Beads SM-2 Adsorbens	Bio-Rad	152-3920
E. coli totale lipiden	Avanti Polar Lipids	100500C	Opgelost in chloroform, behandelen als geschikt voor een organisch oplosmiddel
Ni sepharose hars HP	GE Healthcare	17-5268-01
Fosfor standaardoplossing	Sigma-Aldrich	P3869
pMSP1D1	Addgene	20061
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare	17-5172-01
			Tabel I. specifieke reagentia.
			Naam Samenstelling Reacties DDM voorraad 10% w / v DDM Resuspendeer in milliQ water en bewaar bij -20 ° C MalFGK 2 stock 1-2 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM Bewaren bij -70 ° C na zuivering MSP voorraad 10-15 mg / ml 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol Bewaren bij -70 ° C na zuivering in <1 ml aliquots en voorkomen vries / dooi cycli Fosfolipide voorraad 5 nM E. coli totaal lipiden 0,5% w / v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 week TS buffer 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl Bewaar bij 4 ° C TSG10 buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol Bewaar bij 4 ° C TSG20 buffer 50 mM Tris-HCl, pH 8 100 mM NaCl 20% v / v glycerol Bewaar bij 4 ° C TSGD buffer 50 mM Tris-HCl, pH7.9 100 mM NaCl 10% v / v glycerol 0,03% w / v DDM Bewaar bij 4 ° C en voeg DDM vlak voor gebruik Tabel II. Solution recepten.