Retrograde Fluorescerende Labeling Maakt Gerichte Extracellulair Single-unit Opnemen van geïdentificeerde neuronen In vivo

Samenvatting

Retrograde transport van fluorescente kleurstof labelt een sub-populatie van neuronen op basis van anatomische projectie. Gelabelde axons kunnen visueel worden gericht In vivo, Waardoor extracellulaire opname van geïdentificeerde axonen. Deze techniek vergemakkelijkt opnemen wanneer neuronen niet kunnen worden gelabeld door middel van genetische manipulatie of moeilijk te isoleren met 'blind' In vivo Benaderingen.

Samenvatting

Het algemene doel van deze methode is om single-unit reacties opnemen van een geïdentificeerde populatie van neuronen. In vivo elektrofysiologische opnames van individuele neuronen zijn van cruciaal belang om te begrijpen hoe neurale circuits functioneren onder natuurlijke omstandigheden. Traditioneel zijn deze opnamen uitgevoerd "blind" betekent de identiteit van de opgenomen cel bekend bij het begin van de opname. Cellulaire identiteit kan vervolgens worden bepaald via intracellulaire ^1, juxtacellular ² of losse-patch ³ iontoforese van kleurstof, maar deze opnames kunnen niet vooraf worden gericht op specifieke neuronen in regio's met functioneel heterogene celtypes. Fluorescente proteïnen kunnen tot expressie worden gebracht in een cel-type-specifieke wijze toelaat visueel geleide eencellige elektrofysiologie ^4-6. Er zijn vele modelsystemen waarvoor deze genetische hulpmiddelen zijn niet beschikbaar. Zelfs in genetisch toegankelijke modelsystemen, de gewenste promoter kan onbekend zijn of genetisch homogene neuronen kan hebben verschillende projectie patronen. Zo hebben virale vectoren gebruikt om specifieke subgroepen van projectieneuronen ⁷ labelen, maar het gebruik van deze methode wordt beperkt door de toxiciteit en het gebrek aan trans-synaptische specificiteit. Zo worden extra technieken die specifieke pre-visualisatie te bieden om op te nemen vanaf geïdentificeerd enkele neuronen in vivo nodig. Pre-visualisatie van het doelwit neuron is bijzonder nuttig voor moeilijke opnameomstandigheden, waarvoor klassieke eencellige opnamen vaak onbetaalbaar moeilijk ^8-11. De nieuwe techniek beschreven in dit document gebruikt retrograde transport van een fluorescente kleurstof opgebracht door middel wolfraam naalden snel en selectief labelen van een specifieke subgroep van cellen binnen een bepaald hersengebied basis van hun unieke axonale uitsteeksels, waardoor een visuele indicatie gerichte elektrofysiologische opnames vinden van geïdentificeerde neuronen in een intacte kring withina gewervelde CNS.

De belangrijkste nieuwe vordering van onze werkwijze is het gebruik van fluorescente labeling van specifieke celtypes te richten op niet-genetisch toegankelijk modelsysteem. Zwak elektrisch vissen zijn een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen neurale circuits in wakker, gedragen dieren ^12. We gebruik gemaakt van deze techniek om zintuiglijke verwerking te bestuderen, met "kleine cellen" in de voorste exterolateral nucleus (ELA) van zwak elektrisch mormyrid vis. "Kleine cellen" worden verondersteld te zijn tijd vergelijker neuronen van belang voor het opsporen submillisecond verschillen in de aankomsttijden van presynaptische spikes ^13. Echter anatomische kenmerken zoals dichte myeline overspoelen synapsen en kleine cellichamen dat zij uiterst moeilijk opnemen deze cellen op traditionele wijze ^{11, 14.} Hier laten we zien dat onze nieuwe methode selectief labelt deze cellen in 28% van de voorbereidingen, waardoor voor betrouwbare, robuuste opnamen en karakrization van reacties op electrosensory stimulatie.

Protocol

1. Bereid Dye-gecoate Naalden

1. Elektrolytisch scherpen een 160 micrometer diameter wolfraam draad ^15. Final naald diameters moeten variëren 5-50 micrometer. Het aantal naalden nodig is hangt af van de grootte van het gebied is gemerkt. We bereidden 5 naalden voor 3-5 injecties in de achterste exterolateral nucleus (ELP).
2. De avond voor het experiment, een druppel (<0.25 pl) van 2 mM dextran-geconjugeerde Alexa Fluor 10.000 MW verf op de distale 100 um van elke naald.
3. Laat de naalden aan de lucht drogen bij kamertemperatuur, waardoor geconcentreerde kleurstof aan het uiteinde. Bewaar de naalden bij 4 C in een donkere container ter bescherming tegen licht °.

2. Bereid Animal voor Heelkunde

1. Induceren algemene anesthesie door het plaatsen van de vis in een oplossing van 300 mg / L MS-222 in water tank.
2. Weeg de vis en de maatregel vorklengte (tip van snuit tot splitsing van de staartvin) en body diepte (maximale dorso-Ventral afstand in het dwarsvlak). Deze metingen moeten binnen de in tabel 1, zodat de vis past in een opname kamer klein genoeg voor onder een water-immersie microscoop objectief (figuur 1) in het bereik vallen.
3. Immobiliseren en elektrisch geluid van de vis door het injecteren van 100 ul van 3 mg / ml flaxedil in het dorsale lichaam spiermassa.
4. Vul de opname kamer (Figuur 1A) met tank water. Leg de vis ventrale zijde naar beneden op het platform in het midden van de kamer (figuur 1). Lever een beluchte oplossing van 100 mg / L MS-222 met behulp van een pipet in de mond van de vis (1-2 ml / min). Het stabiliseren van de vis met in was geplaatst aan beide zijden van het lichaam (figuur 1C) vast staven. De conditie van de vis door te controleren op continue bloedstroming in het oculaire vaten en een normale lichaamskleur.
5. Draai het platform langs de lange as en laat de back-end van de platform zodat een zijde van het dorsale oppervlak van de kop van de vis wordt blootgesteld boven het water terwijl de rest van het lichaam van de vis ondergedompeld blijft. Een klein stukje van Kimwipe moet op elke niet-ondergedompelde deel van de huid uitdrogen te voorkomen worden geplaatst.

3. Surgery (figuur 2)

De basis chirurgische procedure beschreven is goed ingeburgerd en betrouwbaar voor blinden in vivo opnames mormyrids ^16. Voor andere toepassingen, bloot de gewenste regio's voor de etikettering en opnemen. Het gebied dat axon terminals van de cellen van belang moet zijn bereikbaar via een kleurstof beklede naald. Het gebied dat meer proximale segmenten van dezelfde axons voldoende ruimte boven het weefsel moeten de werkafstand van het water-immersie objectief (2 mm in ons geval) tegemoet.

1. Breng een 0,4%-oplossing van lidocaïne op het blootgestelde oppervlak van het hoofd met behulp van een Q-tip.
2. Met behulp van een scalpel, snijd de omtrek van een rechthoekig stukje huid. Verwijder de rechthoek met een paar pincetten. De grootte van de rechthoek schaal met vis maat, maar moet ongeveer 3 mm x 5 mm voor 6,2 cm vis (Figuur 2A). De laterale rand van de rechthoek overeenkomt met die midden van het oog, zou de voorste rand van de rechthoek juist achter het oog, en de mediale rand van de rechthoek moet net lateraal van middellijn van de vis zijn.
3. Vouw de blootgestelde schedel regio anteromedially om een extra 2,5 mm vierkant niet-overlappende gebied (Figuur 2B) bloot te leggen.
4. Helemaal leeg te maken en droog het blootgestelde oppervlak van de schedel met de scalpel om weg te schrapen overtollige weefsel en Kimwipes en gedwongen de lucht aan het oppervlak (figuur 2C) drogen.
5. Lijm een ​​metalen paal op de anteromediale blootgestelde schedel regio met superlijm. Wacht tot de lijm volledig droog is (figuur 2D).
6. Verwijderen van een rechthoek van de schedel, ongeveer 2 mm X 4 mm voor een 6,2 cm vis. Gebruik een tandheelkundige boor met een ~ 0.5 mm diameter kogelmolen carbide tip om de omtrek van de rechthoek te verdunnen. Vervolgens, met behulp van een scalpel en pincet, snijd de omtrek van de rechthoek en schil het weg aan de onderliggende hersenen bloot te leggen. Extra boren of snijden met een klein schaartje kan nodig zijn om EL (figuur 2E) volledig bloot. Als spierbloeding optreedt, kan een elektrocauterisatie apparaat worden gebruikt.
7. Weggesneden zowel de dura mater (gepigmenteerd) en de pia mater (duidelijke) met behulp van de lente schaar of naald en verwijder de plankjes met een pincet. De voorste en achterste delen van het exterolateral nucleus (EL) zijn nu zichtbaar, ELA en ELP, respectievelijk (figuur 3A).

4. Retrograde Labeling van axonen van Interest

1. Plaats een manipulator met kleurstof beklede naald (in stap 1) werd het doelgebied die axons van interest, in ons geval elp.
2. Vlug steek de naald ongeveer 25 micrometer in het weefsel. Wacht 15-30 seconden, totdat alle kleurstof is eraf, en dan trekken de naald.
3. Herhaal met extra verse naalden nodig plaatsen elk op een andere locatie zodat de kleurstof verspreid het doelgebied. We gebruikten 3-5 naalden per preparaat.
4. Spoel overtollige kleurstof uit de holte met Hickman's beltoon oplossing.
5. Wacht minstens 2 uur kleurstofopname en transport.

5. Visualisatie van Axonen van Interest

1. Plaats de opname kamer, samen met de vis, onder het doel van een verticale, vaste-fase epifluorescerende microscoop. Als het lichaam van de vis afsluit lichtinval, moeten zowel wit en fluorescerende lichtbronnen van boven komen. Zorgvuldige plaatsing van een glasvezel lichtbron boven de schedel holte laat bevredigend brightfield afbeeldingen. Voor epifluorescentie bekijken, fluorescentie filterspecificaties moeten overeenkomen met de absorptie / emissie-spectrum van de kleurstof.
2. Overschakelen ademhaling om verse tank water en behouden hetzelfde debiet. Plaats een aardedraad in de blootgestelde hersenen holte en maak verbinding met de grond van de opname headstage (zie 6.3).
3. Plaats een paar registrerende elektroden naast de basis van de staart en verbinden met een differentiële versterker en meters (bijv. audio monitor oscilloscoop of computer) om de elektrische ontlading orgel commando (EODC) volgen. Nadat de vis herstelt van anesthesie kan EODC worden gebruikt als een indicator van de toestand van de vis.
4. Bereid een geschaalde schets van het gebied hersenen bekeken bij een lage vergroting. Behoren grote bloedvaten als oriëntatiepunten (kan variëren van vis tot vis) om de exacte locatie van het label axonen alleen zichtbaar onder hoge vergroting (figuur 3D) te identificeren.
5. Bevestigen kleurstof plaatsing. Bekijk eerst gehele weefsel met helderveld verlichting voor oriëntatie ( Figuur 3A). Vervolgens bekijken met fluorescerende verlichting (Figuur 3B). Elp zal hebben diffuse etikettering (Figuren 3B en 3C). Minimaliseren fluorescentie excitatie aan de fotodynamische en fototoxische effecten van de kleurstof te beperken.
6. Gebruik de schepen als oriëntatiepunten voor ELA onder hoge vergroting lokaliseren. Verlichten met tl-licht tijdens het zoeken naar een label axon nabij het oppervlak. (Figuur 4).

6. Opnemen Extracellulair Activiteit

1. Trek zuigkracht registrerende elektroden met 1 mm OD, 0,58 mm ID borosilicaatglas capillaire glas voor gloeilampen. Ideaal tip grootte zal afhangen van de diameter van het doel axonen, die in ons geval is 0,1-0,2 urn ^17. Voor onze toepassing, elektrode tip diameters waren 1,5 ± 0,4 micrometer (range: 1,0-2,4 micrometer) met een 5 mm lange, smalle schacht om de gelabelde axonen benaderen zonder het verplaatsen van het omringende weefsel te dicht op elkaar gepakt.
2. Vul electroden met gefilterd Hickman's beltoon oplossing. Laatste tip weerstand is 45,2 ± 38,0 MQ (bereik: 16-155 MQ).
3. Plaats de elektrode in een elektrode houder met een druk-poort en sluit deze aan op een versterker headstage gemonteerd op een manipulator. Voer een drukleiding van de drukpoort een T-splitsing eindigend in een manometer en een injectiespuit voor het bewaken en regelen van de druk, respectievelijk.
4. Sluit de headstage een versterker en een analoog-digitaal acquisitieapparaat.
5. Met 30 mbar buitenwaartse druk op de elektrode lijn, plaatst een elektrode naast een label axon. Een low-light level camera gekoppeld aan imaging software wordt gebruikt om de pipet plaatsing visualiseren. Beginnen bij het weefsel oppervlak en vooraf de elektrode naar het axon. Als je het axon naderen, moet de buitenwaartse druk een lichte, maar merkbare beweging van het axon veroorzaken.
6. Terwijl de elektrode is naast het axon, (figuur 4A, boven) nemen de potenteial aan de elektrode tijdens de presentatie van teststimuli (in ons geval, gebruikten we 100 msec monofasische positieve en negatieve transversale pulsen met een intensiteit van 20 mV / cm; Figuur 1A). Actiepotentialen niet worden nageleefd, maar een elektrische artefact bevestigt goede opname / stimulatie (Figuur 4A, onder).
7. Laat de buitenwaartse druk op de elektrode en herhaal stimulatie / registratie. Actiepotentialen mag nog niet worden waargenomen (Figuur 4B).
8. Oefen lichte (125 ± 25 mbar) zuig aan de elektrode en herhaal stimulatie / registratie. Actiepotentialen moet nu worden waargenomen in respons op stimulatie (Figuur 4C). Spontane activiteit kunnen ook optreden. Als actiepotentialen niet worden nageleefd, laat de zuigkracht, duidelijk de elektrode met lichte druk, opnieuw lichtjes te bewegen de elektrode, en poging zuigkracht. Zodra actiepotentialen zichtbaar zijn, sluit de drukleiding.
9. Stimuleren en op te nemen alsgewenst.

7. Beëindiging en verwijdering

1. Wanneer alle opnames zijn voltooid, schakelt de ademhaling met 100 mg / L MS-222 tot EODC gestopt. Geen EODC moeten gedetecteerd minstens 10 minuten.
2. Gooi de vis volgens de institutionele richtlijnen en erkende zorg protocollen dier.

8. Representatieve resultaten

Voor onze specifieke toepassing, wij zijn geïnteresseerd in het bestuderen van stimulus codering door centrale sensorische neuronen. Succesvolle opname van gelabelde axonen analyse toelaten van een enkele eenheid reacties op sensorische stimulatie ^18. Figuur 5A toont representatieve actiepotentialen opgewekt door dwarse electrosensory stimulatie met bipolaire elektroden die zich aan de binnenkant van de linker en rechter wanden van de opname kamer. Spike tijden kan worden gepresenteerd als een piek raster plot (Figuur 5B). Een 25 msec pre-stimulus opname window toont het lage niveau van spontane activiteit. Deze bijzondere ELA "small cell" lang-pass afgestemd stimulusduur op een stimulus intensiteit van 6 mV / cm, waardoor het aantal takken per herhaling en stimulusduur toeneemt (figuur 5C). De gemiddelde eerste piek latency is 4,28 ± 0,16 msec, in overeenstemming met de verwachte wachttijd voor kleine cellen in ELA ^11.

Figuur 1. Specificaties voor een opname kamer die past onder de doelstelling van een vaste-fase epiflourescent microscoop. (A) To-schaal vierkante opname kamer gemaakt van plexiglas die uitzichten top, zij-en achterkant. Gepaarde sets van stimulatie-elektroden (sterretjes) bij de omtrek zorgen voor zowel transversale (rood-zwart) of longitudinaal (blauw-geel) stimulatie. Een extra stuk van plexiglas in de hoek, met een rubber beklede gat in het midden (oranje),houdt een zuig pipet die een constant waterpeil handhaaft. Twee verticale roestvrijstalen berichten geschroefd in de bodem van de kamer (constant groen) verbinding roestvaststalen posten (groene overzicht) aan het platform waarop de vis (lichtgrijs, beschreven in C) via verstelschaal klemmen. Een foto van de kamer wordt getoond onder het op schaal tekenen. (B) Individuele en geassembleerd uitzicht op de cirkelvormige plastic schijf klemmen gebruikt om het platform naar de verticale stijlen te beveiligen. Elke schijf klem heeft een groef (groen) voor een post en een gat in het midden van de spanschroef. Disc klemmen gedraaid zodat de groeven loodrecht op elkaar. Aandraaien van de schroef (rood) klemmen van de berichten op zijn plaats om verdere verticale en roterende beweging van het platform te voorkomen. (C) Voor-en zijkant op schaal uitzicht op het plexiglas platform gebruikt om de vis op zijn plaats te houden. Het platform is bedekt met een laag van paraffine (blauw) die houten dowe houdtls (zwarte balken) op zijn plaats om de vis te ondersteunen. Buizenstelsel voor beademingsinrichting de vis door een gat in de 'hoofdeinde' van het platform en eindigt in een pipetpunt in de mond van de vis. Een roestvrij stalen kop bericht (grijze balk) wordt aangesloten op het platform via een kogelgewricht waardoor 360 graden rotatie. RVS horizontale berichten (groen) worden geschroefd in een van beide eind van het perron. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. Schematisch overzicht van de operatie kijken neer op het dorsale oppervlak van de kop. (A) Maak vier bezuinigingen, in de aangegeven volgorde, om een rechthoekig stukje huid (rood) te verwijderen. (B) Trek de opening anteromedially om een extra rechthoekig stuk te verwijderen van de huid (groen). (C) Schraap alle resterende vet of ligamenten doorhet verplaatsen van de scalpel, zoals aangegeven door de pijl en droog het oppervlak volledig met Kimwipes en gedwongen lucht. (D) Lijm een roestvrijstalen paal aan de schedel met superlijm. Schaal bar in A geldt voor AD. (E) Gebruik een tandartsboor tot vier sneden maken, in de aangegeven volgorde, om een rechthoekig stuk bot (blauw) te verwijderen, waardoor de voorste en achterste exterolateral kernen (ELA en ELP, respectievelijk) . Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Fluorescentielabelling in de achterste exterolateral kern 3 uur na injectie van dextran-geconjugeerde Alexa Fluor 568. (A) de voorste en achterste exterolateral kernen (ElA en ELP respectievelijk) gevisualiseerd met helderveld van bovenaf. Notadat de uitgebreide myelination binnen Ela geeft het een relatief heldere uitstraling die het onderscheidt van Elp. (B) Dezelfde regio gevisualiseerd met behulp van epifluorescentie bekeken via een TRITC filter. (C) A samengevoegde afbeelding met blauw voor A (helderveld) en rood voor B (TRITC). (D) Voorbeeld van een verkleinde tekening van ELA en ELP waaronder grote bloedvaten (rode lijnen) die kunnen worden gebruikt als oriëntatiepunten voor de exacte locatie van het label axonen alleen zichtbaar onder hoge vergroting (de exacte locatie van de bloedvaten te identificeren varieert van vis tot vis). Gestippelde lijn geeft de grens tussen ELA en Elp. (E) Monster beelden verkregen met behulp van een TRITC filter uit 5 verschillende preparaten ter illustratie van een reeks succesvolle etikettering patronen van kleine cel axonen en SOMA in ELA.

Figuur 4. Single-unit extracellulairevan een label axon. (A) Opname elektrode (pijlpunt) onder positieve druk geplaatst grenzend aan een gelabelde kleincellige axon in ELA (top) registreert alleen edge artefact (pijlpunten) in reactie op een 100 msec 20 mV / cm monofasisch, contralaterale-positieve, dwars vierkante puls (onder). (B) loslaten buitenwaartse druk van de elektrode (pijlpunt) veroorzaakt de axon iets richting van de elektrode (geplaatst), maar er is nog geen reactie op de stimulus (bodem). ( C) Lichte onderdruk trekt het axon naar de elektrode (top, pijlpunt) en actiepotentialen in reactie op stimulusaanvang zijn nu zichtbaar (bodem, sterretje). Onderste helft van alle drie panelen bedekt reacties op 20 herhalingen van de stimulus.

Figuur 5. Representatieve resultaten met deze techniek. (A) 5 monster sporentoont actiepotentialen opgewekt door een 0,1 msec 6 mV / cm monofasisch, contralaterale-positieve, dwarse vierkante puls stimulus. (B) Raster perceel tonen spike keer tijdens 20 herhalingen van een 75 msec raam opname voor dezelfde eenheid gestimuleerd op tijdstip 0 met 6 mV / cm stimuli bij de selectie van beursgenoteerde rechts duur. (C) Duur stemmingscurve kwantificeren van de reacties weergegeven in het raster als spikes per stimulus herhaling.

	(G)	Vork Lengte (cm)	Body Diepte (cm)
Betekenen	2.42	6.20	1.14
Standaarddeviatie	0.64	0.52	0.18
Reeks	1,2-4,0	5,5-8,4	0,9-1,6

Tabel 1. Optimalegewicht, lengte en body diepte varieert voor vissen. Optimaal gewicht, vorklengte (tip van snuit tot splitsing van de staartvin) en body diepte (maximale dorso-ventrale afstand in het dwarsvlak) varieert waardoor vis om te passen in de opname kamer geïllustreerd in Figuur 1. Vissen die te klein zijn kunnen zal minder waarschijnlijk om de operatie te overleven en zal een kleine ELP hebben, waardoor kleurstof plaatsing uitdagend. Vissen die te groot zijn zal een grote, over vergaande cerebellum dat de toegang tot ELA en ELP zal verminderen en kan verhinderen dat het verlagen van de hoge energie-, water-immersie objectief dicht genoeg om zich te concentreren op de ELA en Elp.

Toepassing Site	Dye Type	Vis geprobeerd	Label in ELA	Label in Elp	Eenheden geprobeerd	Recordings
ELeen	Alexa Fluor injectie	32	26 (81,2%)	19 (59,4%)	50	4 (8,0%)
ELA	Alexa Fluor gedrenkt filtreerpapier	1	0	0	0	0
ELA	Di-I in DMSO	8	6 (75,0%)	0	0	0
ELA	Di-O kristallen	5	3 (60,0%)	2 (40,0%)	9	0
Elp	Solid Alexa Fluor kristallen	2	0	2 (100%)	0	0
Elp	Alexa Fluor coated wolfraamdraden	43	29 (67,4%)	41 (95,3%)	119	26 (21,8%)

Tabel 2. Slaagpercentage elke kleurstof injectie methode. Succes tarieven voor elke kleurstof injectie methode. Werkwijzen zijn verdeeld op basis injectieplaats en kleurstof type. In elke methode het totale aantal vissen geprobeerd en het percentage van deze experimenten dat resulteerde in succesvolle etikettering ElA en ELP weergegeven. Merk op dat de gerichte opname gebied is het tegenovergestelde van de toedieningsplaats (vetgedrukte dozen). Voor injectie werd kleurstofopname succesvol etikettering van zowel SOMA en axonen beschouwd. In tegenstelling, bij de opnameplaats alleen preparaten gemerkte axons werden geteld als succesvol labelingsexperimenten. Het totale aantal pogingen eenheden en het percentage van deze eenheden die resulteerde in succesvolle opnames worden ook getoond.

	# Van injectie sites	Gemiddelde volume per injectie (pi)	Waaier van volumes per injectie (pi)	Gemiddelde totale injectie volume (pl)	Bereik van de totale injectie volumes (pl)
Microinjector met Hamilton	3 of 4	0.144	,091-0,91	0.516	0,378-0,669
Nanoinjector met glazen pipet	2-4	0.069 (vaste)	Vast volume geïnjecteerd 1-6 keer	0.621	0,414-0,966
Microinjector met glazen pipet	2-6	0.093	0,058-0,202	0.360	0,252-0,540

Tabel 3. Hoeveelheden kleurstof gelden bij elk van de drie methoden voor Al injecterenEXA Fluor in ELA hoeveelheden kleurstof gelden bij elk van de drie methoden te injecteren Alexa Fluor in ELA (eerste methode van tabel 2). Kleurstof injectie in ELA werd uitgevoerd met zowel een nanoinjector en een microinjector met behulp van een 33 gauge Hamilton injectienaald of een getrokken glas capillair pipet. We varieerde het aantal injectieplaatsen, het volume per injectie en de totale hoeveelheid kleurstof injectie.

Discussie

Eenmaal onder de knie, zal deze techniek laten ons toe om geïdentificeerde neuronen, met inbegrip van individuele axonen, richten voor in vivo-opnamen in veel modelsystemen. Daarnaast is deze techniek maakt het mogelijk om spike output van neuronen met unieke anatomische kenmerken die traditioneel in vivo opname methoden uitdagend te maken betrouwbaar opnemen. Wij hebben deze techniek gebruikt om op te nemen van ELA "kleine cellen" in mormyrid zwak elektrisch vissen. Eerdere pogingen om de stemming eigenschappen van "kleine cellen" te bestuderen waren niet succesvol vanwege moeilijke opnameomstandigheden ^{11, 14.} Vergelijkbare anatomische kenmerken belemmeringen voor het verkrijgen van single-unit opnames van veel verschillende gewervelde auditieve en electrosensory neuronen ^8-10 creëren. Om deze uitdagingen in ons systeem te overwinnen, hebben we geprofiteerd van het feit dat "kleine cellen" zijn de enige cellen in ELA dat project te Elp. Zo retrograde transport van kleurstof geplaatst in Elp beperkt etikettering in ELA om "kleinecell "SOMA en axonen. Fluorescerende etikettering van de axonen toegestaan ​​precieze plaatsing van de elektroden naast het label axonen, waardoor single-unit opnames van geïdentificeerde cellen mogelijk ondanks ontoegankelijk SOMA. We probeerden somatische opnames, maar waren niet succesvol, waarschijnlijk te wijten aan de omliggende engulfing synapsen ^{11 17.} echter somatische kenmerken duidelijk zichtbaar suggereert dat deze techniek kan worden gebruikt om somatische opnamen richten in andere celtypen en andere circuits. Fluorescent labeling van neuronen door retrograde transport in vivo is gebruikt voor het geleiden gerichte opnames vitro ^19-21 . Een soortgelijke techniek werd gebruikt voor gerichte in vivo opnames van motorneuronen in zebravis ruggenmerg ^22. Ons werk vertegenwoordigt een nieuwe uitbreiding van deze benadering, waarbij zowel labeling en opnemen worden uitgevoerd in vivo in de hersenen. Onze methode toont aan dat in vivo etikettering van CNS gebieden met een retrograde tracer kan worden uitgebreid tot de studie van andere intacte circuits met dezelfde selectieve projectie neuronen. Bijvoorbeeld, in zoogdier auditieve verwerking, de inferior colliculus (IC) fungeert als een belangrijke schakel centrum voor input uit diverse rhombencephalic structuren ^23. Kleurstof injectie in de IC zou selectief etiketteren uitsteeksel cellen van elk van deze kernen. De superieure colliculus (SC) dient een soortgelijke functie voor visie ^24. Ruggenmerg preparaten zijn bijzonder geschikt voor deze techniek, het ruggenmerg is gemakkelijk toegankelijk, kan inktinjectie ver van de opnameplaats optreden, en het kan worden gecombineerd met de intracellulaire opname en het vullen van geselecteerde neuronen meer gedetailleerde anatomische informatie verwerven ^25. Tenslotte tract-tracing is een gevestigde techniek in het centrale zenuwstelsel complexe schakelingen in kaart ^26. De werkwijze kan worden gebruikt om functionele informatie aan deze studies werd geschreven wet calcium-gevoelige indicatoren in cat visuele cortex ^27.

De operatie, die goed gevestigd, betrouwbaar en regelmatig gebruikt voor blinde in vivo opnamen ¹⁶ moet worden aangevuld met minimale bloeding en geen schade aan het oppervlak van de hersenen om het dier en het weefsel te laten overleven. Met de praktijk, kan de chirurgie en kleurstof toepassing in 30-45 minuten worden voltooid. We succes "small cell" axons gemerkt in 67% van de preparaten. De meeste voorbereidingen hebben slechts 1 of 2 zichtbare label axonen, maar sommige hebben maar liefst 8. Van de 119 gemerkte eenheden geprobeerd, verkregen we enkele eenheid opnames van 26 eenheden verdeeld over 12 bereidingen (tabel 2). Zo werden gegevens verzameld van 41% van preparaten met gelabelde axonen voor een totale succespercentage van 28%.

De kritische aspect van kleurstof toepassing is het labelen van diepte. Ondiepe inbrengen van de wolfraamdraad resulteert in de kleurstof wordt gewassen away. Indien de penetratie te diep is, gemerkte axons niet zichtbaar voor targeting. Verder moet een mechanische beschadiging van de cel optreden van de kleurstof voldoende worden opgenomen ^{25, 28.} Echter, te veel schade de cellen te doden. We probeerden merken met andere kleurstoffen en andere (tabel 2), zoals anterograde etikettering door kleurstof injectie in Ela gekoppeld opname van gelabelde neuronen in Elp (tabel 3). Onze hypothese is dat anterograde etikettering was niet succesvol omdat labeling was beperkt tot cellen met somatische schade, waardoor ze niet meer reageert. Daarnaast kunnen pre-synaptische terminals zijn verstoord. Daarentegen retrograde labeling minimaliseert beide problemen. De hoeveelheid en de locatie van kleurstof toepassing kan worden aangepast aan de betreffende circuit onderzocht. Maximale labeling plaatsvindt met de grootste kleurstof concentratie die wij bereikt met beklede wolfraam draden. Echter, voor het labelen van axonen met deep projecties, kan kleurstof komt uit een wolfraam naald zoals het is gevorderd. In deze gevallen zou drukinjectie beter zijn. Kleurstof opname en transport zijn snel, met gelabelde axonen in onze voorbereiding zichtbaar al vanaf 2 uur na de injectie en aanvullende bestempeld axonen verschijnen zo laat 6 uur na de injectie. Aldus kan labeling en opnemen worden verwezenlijkt in een enkele dag, waardoor technische problemen geassocieerd met overleving chirurgie. Timing zal variëren voor elke toepassing, afhankelijk van de afstand die nodig is voor kleurstof vervoer.

Een ander cruciaal aspect is plaatsing van de elektroden. Het is belangrijk om het weefsel dicht bij de plaats van de gemerkte axon verstopping van het mondstuk te voorkomen voeren. Voor dichte weefsel zoals in ELA, een lange, dunne schacht op de registratie-elektrode minimaliseert teveel beweging van het omringende weefsel. Als u een goede opname niet wordt bereikt bij de eerste poging, herhaal met verse elektroden totdat een opname wordt verkregen of de Tissue wordt verstoord tot het punt waarop het axon niet meer zichtbaar. Het is echter ook belangrijk om snel plaats de elektrode naast het axon de hoeveelheid fluorescerende blootstelling die fototoxiciteit veroorzaken, bleken minimaliseren en kunnen beïnvloeden fysiologische eigenschappen van de cellen ^29-31.

Zodra een segment van axon met succes gezogen in de registratie-elektrode, kunnen opnamen worden verkregen gedurende enkele uren. Als eenheden consequent zijn verloren in minder dan 1 uur, overweeg dan om kleinere elektrode tips om de axon wegglijdt uit. Aan de andere kant, te kleine tip kan verstopt raken, lage signaal-ruis of schade aan het axon. Een gestage daling van de piek amplitude en de 'terugkeer' van een eenheid met extra zuigkracht is een indicatie dat de tip is te groot. Te veel zuigkracht kan onherstelbare schade aan het axon veroorzaken. Een oplossing is om een ​​klein lek kan in de luchtleiding zodat de druk langzaam terug naar nul. Snel de gelijkmaker the druk resulteert in een voorbijgaande relatieve passieve "push" die de axon uitgestoten wordt.

Hoewel deze techniek is een groot voordeel voor het verkrijgen gerichte opnamen van geïdentificeerde projectie neuronen, zal het niet nuttig zijn voor het onderscheid lokale interneuronen, zoals kleurstof zouden worden genomen door alle celtypes op de injectieplaats. Theoretisch kan het gebruik van meerdere fluoroforen met verschillende injectieplaatsen kan deze werkwijze worden uitgebreid. Zo kan vergelijking single-versus dubbele labeling gebruikt interneuronen van projectie neuronen na dubbele injecties op twee punten in de schakeling ³² te onderscheiden. Op dezelfde manier kan retrograde tracers worden gecombineerd met andere geavanceerde beeldvormende technieken, zoals twee-foton beeldvorming, zoals recentelijk in zebravink High Vocal center (HVC) ³² gedaan. Ook zijn opname gebieden beperkt tot die in de buurt van het oppervlak bij het gebruik van epifluorescentie microscopen, want we waren alleen in staat om op te lossen 1 μ m structuren binnen de eerste 30 urn weefsel. Echter kan deze diepte worden uitgebreid door het gebruik van andere microscopische technieken, zoals twee-foton microscopie ³³ of objectieve gekoppelde planaire verlichting microscopie ^34. Kortom, deze techniek vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in het onderzoek van neurale circuits in vivo, omdat het kan worden gebruikt voor het opnemen van enige neuronen in verschillende circuits in verschillende modelsystemen - waaronder die moeilijk toegankelijk zijn.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Tricaine Methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Gallamine Triethiodide	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’s Ringer Solution	NA	NA	NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump	Gilson of Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 rpm, Alternatief, een zwaartekrachtvoedingslijn met een stroomsnelheidsmeter
Dissectiemicroscoop	Nikon	SM2645
Superlijm	Super Glue Corporation	SGH2	2g tube
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Balfrezen Carbide boortje #1/4	World Precision Instruments	501860	0.19 DIA (boordiameter = 0.48 mm)
Laagtemperatuurcauterisatieset	World Precision Instruments	500391
Handmatige micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran geconjugeerd Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	2mM concentratie; 10.000MW De keuze van de golflengte van de kleurstof moet worden geselecteerd om overeen te komen met de filterinstellingen van de microscoop
Epifluorescente microscoop	Nikon	E600 FN	Een externe focusaccessoire is nuttig voor fijne focus TRITC-filter - of een geschikt filter om te passen bij focale vlakken voor verschillende kleurstofgolflengten
Laagvermogen objectief	Nikon	93182	CFI Plan Achromat-serie, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
Hoogvermogen objectief	Nikon	93148	CFI Fluor-serie, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2,0 mm
Witte lichtbron	Dolan-Jenner	Model 190	Vezeloptische verlichter
Fluorescentielichtbron	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Laag lichtniveau camera	Photometrics	CoolSnap ES
Digitaal manometer	Omega Engineering	HHP-201
Gemotoriseerde micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Versterker	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
Data-acquisitiesysteem	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Geïsoleerde pulsstimulator	A-M Systems	2100
Flaming/Brown micropipetpuller	Sutter Instruments	P-97	Programma-instellingen voor onze toepassing: Hitte: ramp + 1, Trek: ’0’, Snelheid: 60, Tijd: 90 Box filament
Pipetglas	World Precision Instruments	1B100F-4	Borosilicaat capillair glas met gloeidraad (1 mm OD, 0.58 mm ID)