High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisatie

Samenvatting

Genoomassemblages op basis van massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn doorgaans sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan genoomassemblages potentieel verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie en imaging die de doorvoer van de ontwikkeling van de fysieke kaart aanzienlijk verhogen.

Samenvatting

Projecten om volledige genoomsequenties te verkrijgen voor 10.000 gewervelde diersoorten¹ en voor 5.000 insecten- en verwante arthropodensoorten² zullen naar verwachting de komende 5 jaar plaatsvinden. Zo wordt bijvoorbeeld de sequencing van de genomen van 15 malariamuggensoorten momenteel uitgevoerd met een Illumina-platform^3,4. Deze Anopheles-soortencluster omvat zowel vectoren als niet-vectoren van malaria. Wanneer de genoomassemblages beschikbaar komen, krijgen onderzoekers de unieke kans om comparatieve analyses uit te voeren om evolutionaire veranderingen af te leiden die relevant zijn voor het vermogen als vector. Het is echter moeilijk gebleken om next-generation sequencing reads te gebruiken voor het genereren van hoogwaardige de novo genoomassemblages⁵. Bovendien zijn de bestaande genoomassemblages voor Anopheles gambiae, hoewel verkregen via de Sanger-methode, incompleet of gefragmenteerd^4,6.

Het succes van comparatieve genomische analyses zal beperkt zijn als onderzoekers te maken hebben met talrijke sequencing contigs in plaats van chromosoomgebaseerde genoomassemblages. Gefragmenteerde, niet-toegewezen sequenties veroorzaken problemen voor genomische analyses omdat: (i) niet-geïdentificeerde gaten leiden tot een onjuiste of onvolledige annotatie van genomische sequenties; (ii) niet-toegewezen sequenties leiden tot verwarring tussen paraloge genen en genen van verschillende haplotypes; en (iii) het gebrek aan chromosoomtoewijzing en oriëntatie van de sequencing contigs het onmogelijk maakt om de fylogenie van herschikkingen te reconstrueren en de evolutie van chromosomen te bestuderen. Het ontwikkelen van fysische kaarten met een hoge resolutie voor soorten met recent gesequenced genomen is een tijdige en kosteneffectieve investering die de genoomannotatie, evolutionaire analyse en re-sequencing van individuele genomen uit natuurlijke populaties zal vergemakkelijken^7,8.

Hier presenteren wij innovatieve benaderingen voor chromosoompreparatie, fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en beeldvorming die de snelle ontwikkeling van fysieke kaarten faciliteren. Met An. gambiae als voorbeeld tonen we aan dat de ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten potentieel genoomassemblages en daarmee de kwaliteit van genomische analyses kan verbeteren. Ten eerste gebruiken we een hogedrukmethode om polytene chromosoompreparaten te maken. Deze methode, oorspronkelijk ontwikkeld voor Drosophila⁹, stelt de gebruiker in staat om meer details op chromosomen te visualiseren dan met de reguliere squashing-techniek¹⁰. Ten tweede wordt een volledig geautomatiseerd front-endsysteem voor FISH gebruikt voor high-throughput fysieke genoommapping. Het geautomatiseerde systeem voor het kleuren van preparaten voert meerdere assays gelijktijdig uit en vermindert de actieve werktijd aanzienlijk¹¹. Ten derde scant en fotografeert een automatisch fluorescent beeldvormingssysteem, inclusief een gemotoriseerde objecttafel, automatisch de gelabelde chromosomen na FISH¹². Dit systeem is bijzonder nuttig voor het identificeren en visualiseren van meerdere chromosomale platen op hetzelfde preparaat. Bovendien levert het scanproces een uniformer FISH-resultaat op. Over het algemeen is het geautomatiseerde high-throughput protocol voor fysieke mapping efficiënter dan een standaard handmatig protocol.

Protocol

1. Hogedruk-preparatie van polytene chromosomen uit ovariële voederscellen

1. Disseceer half-gravide Anopheles-vrouwtjes 25 uur na bloedvoeding onder een dissectiemicroscoop en fixeer de ovaria in verse gemodificeerde Carnoy-oplossing met methanol (100% methanol: glaciaal azijnzuur, 3:1). In dit stadium bevinden de ovaria zich in Christophers' stadium III van ontwikkeling, waarbij de follikels een ovale vorm hebben en het transparante gebied met voederscellen binnen de follikels een ronde vorm heeft¹³. Plaats de ovaria van ongeveer vijf vrouwtjes in 500 μl gemodificeerde Carnoy-oplossing in een 1,5 ml Eppendorf-buisje en bewaar deze 24 uur bij kamertemperatuur. Verplaats de ovaria naar -20 °C voor langdurige bewaring.
2. Bereid vlak voor het maken van de preparaten een gemodificeerde Carnoy-oplossing voor met ethanol (100% ethanol: glaciaal azijnzuur, 3:1) en 50% propionzuur. Plaats één paar ovaria in één druppel gemodificeerde Carnoy-oplossing op een stofvrij objectglas. Verdeel de ovaria in ongeveer 6 secties met dissectienaalden en plaats deze in druppels 50% propionzuur op schone objectglazen onder een Leica MZ6 dissectiestereomicroscoop. Gebruik voor elke sectie een apart objectglas.
3. Scheid de follikels door te disseceren met naalden en veeg het resterende weefsel weg met filterpapier of keukenpapier onder een dissectiemicroscoop. Voeg een nieuwe druppel 50% propionzuur toe aan de follikels en laat deze 3-5 minuten bij kamertemperatuur rusten. Plaats een dekglas bovenop de druppel 50% propionzuur. Laat het objectglas ongeveer 1 minuut staan.
4. Wikkel het objectglas in filterpapier en plastic. Gebruik een Dremel 200 roterend gereedschap met een Flex-Shaft-opzetstuk en een zachte plastic tip, ingesteld tussen 3000-5000 RPM, om de follikels uit te drukken door de tip in cirkels te draaien en licht op het dekglas te drukken om de kernen gelijkmatig te verspreiden. Deze stap duurt ongeveer 1 minuut. Controleer de spreidingskwaliteit met een Olympus CX41 fasemicroscoop met een 20x objectief.
5. Maak een 'sandwich' door een extra dekglas naast het dekglas dat de chromosomen bedekt te plaatsen, en dek deze af met een tweede objectglas. Dit vermindert de kans dat het objectglas in de bankschroef wordt verbrijzeld. Wikkel de glazen in een plastic vel (zoals meegeleverd bij objectglashouders) en filterpapier om de sandwich op zijn plaats te houden en het objectglas te beschermen tegen krassen door de bankschroef.
6. Oefen druk uit op de objectglazen via een mechanische bankschroef. Een druk van 85-120 inch-lbs is voldoende en wordt bereikt met een momentsleutel. Deze stap is noodzakelijk om de chromosomen zoveel mogelijk af te platten.
7. Verwijder het tweede objectglas en het extra dekglas. Verwarm het objectglas met het dekglas dat de chromosomen bedekt tot 55 °C op een denaturatie-/hybridisatiesysteem voor objectglazen gedurende 10-15 minuten om de chromosomen verder af te platten. Dompel het objectglas gedurende ten minste 15 seconden in vloeibare stikstof en verwijder, zodra het bubbelen is gestopt, snel het dekglas met een scheermesje. Plaats de objectglazen onmiddellijk gedurende 5 minuten in koude 50% ethanol. Dehydrateer de objectglazen in 70%, 90% en 100% ethanol gedurende elk 5 minuten. Laat de objectglazen aan de lucht drogen.

2. FISH met behulp van een geautomatiseerd systeem voor het kleuren van coupes

Het programma is ingesteld met het Xmatrx geautomatiseerde coupes kleuringssysteem om de volgende stappen uit te voeren, met uitzondering van de sonde-markering. Het gedetailleerde nick-translatie markeringsprotocol is beschreven in de documentatie die wordt geleverd bij de DNA-polymerase van Fermentas.

1. Bereid vóór de FISH fluorescentie-sondes voor door genomisch BAC-DNA te labelen met een fluorochroom met behulp van een nick-translation-protocol. Meng 1 μg DNA, elk 0,05 mM niet-gelabelde dATP, dCTP en dGTP en 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- of Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl van 10x nick-translation-buffer, 20 units DNA-polymerase I, 0,0012 units DNase I, en nuclease-vrij water tot 25 μl. De ratio DNA-polymerase I/DNase I wordt empirisch gekozen om sondes te verkrijgen met een groottebereik van 300 tot 500 bp. Incubeer het mengsel 1 uur bij 15 °C.
2. Plaats de objectglazen en reagentia in het Xmatrx geautomatiseerde slide-kleuringssysteem en start het programma om de volgende stappen uit te voeren. Breng 800 μl 1x PBS aan gedurende 20 min. Blaas de objectglazen droog met lucht. Voer formalinefixatie uit door 450 μl 4% formaline in 1x PBS gedurende 1 min aan te brengen, gevolgd door wasstappen met 100% ethanol tweemaal gedurende 1 sec en eenmaal gedurende 2 min. Blaas de objectglazen droog met lucht.
3. Verwarm de objectglazen 2 min bij 45 °C om belletjesvorming bij het aanbrengen van de sondes te voorkomen. Breng 20 μl van de DNA-sondes aan, voeg druppels minerale olie toe om verdamping van de hybridisatieloplossing te voorkomen en plaats een dekglas bovenop. Denatureer de chromosomen en DNA-sondes door de objectglazen 10 min bij 90 °C te verwarmen.
4. Incubeer de objectglazen voor hybridisatie 14 uur bij 42 °C met de dekglazen erop. De hybridisatieloplossing bestaat uit 2x SSC, 100 mM natriumfosfaat, 1x Denhardt-oplossing, 100 μg/ml natriumazide en 10% dextraansulfaat in formamide.
5. Verwarm de objectglazen voor de stringentiewasstappen 2 min bij 42 °C, verwijder de dekglazen en was de objectglazen 4 keer gedurende 1 sec in 2x SSC. Blaas de objectglazen droog met lucht. Breng tweemaal 800 μl 0,4x SSC aan bij 42 °C gedurende 10 min. Was de objectglazen in 2x SSC bij 25 °C gedurende 10 min.
6. Voer chromosomenkleuring uit door 50 μl 1 μM YOYO-1 in 1x PBS aan te brengen. Breng druppels minerale olie aan om verdamping van de kleuringsoplossing te voorkomen, plaats de dekglazen en incubeer 10 min bij 25 °C. Verwijder de dekglazen en was de objectglazen 4 keer gedurende 1 sec in 2x SSC. Blaas de objectglazen droog met lucht. Breng 15 μl ProLong Gold antifade-reagens aan. Plaats de dekglazen.

3. Aflezen van slides met een automatisch fluorescent beeldsysteem

Deze sectie beschrijft in detail het gebruik van de Duet-software, die standaard wordt geleverd bij het ACCORD PLUS geautomatiseerde scansysteem. De instructies beginnen na het inschakelen in deze volgorde: de Olympus U-RFL-T voeding voor een halogeenlamp, de computer Dell precision T3500, de microscoop Olympus BX61 met een aangesloten camera Olympus U-CMAD3.

1. Voor het instellen van de 10x Pre-Scan opent u de Duet-software in het ACCORD PLUS automatische scansysteem. Klik op de knop "Online". Voer een nieuw Case ID in en wijs een Slide ID toe. Klik op de stip met het label "BF". Dit is de optie voor brightfield. Stel de scanoptie in op "10x Prescan". Gebruik "2500x circle", "10000x circle" of "rectangle". Klik op "Set&run" voor de 10x Pre-Scan.
2. Klik op de knop "OK" om de 10x Pre-Scan uit te voeren. Volg de aanwijzingen om het scannen correct af te stellen. Klik op "Finish" om de scan te starten. Druk op het tabblad "Main" om terug te keren naar het hoofdscherm. Klik op de knop "Offline". Zoek het toegewezen Case ID en Slide ID en klik op "Offline Scan". Klik in het zwarte vak linksboven op een pijl en selecteer "10x Prescan". Ga met de pijlen (< || Δ >, ook wel de knoppen "terug", "pauze", "afspelen", "vooruit") door de gescande beelden.
3. Nadat u een interessant beeld heeft gevonden, dubbelklikt u op het scherm in het midden van het doelgebied en drukt u op "Snap". Hiermee wordt een beeld gemarkeerd voor latere vastlegging. Nadat alle doelen zijn geselecteerd, klikt u op "Classify". Selecteer "10x Prescan". Klik met de rechtermuisknop op een beeld om de beelden te classificeren. Selecteer "Polytene".
4. Stel de 40x Pre-Scan in in de Duet-software. Klik op "Main" om terug te keren naar het hoofdmenu. Selecteer opnieuw "Online". Selecteer een slide. Wijzig "BF" in "FL". Wijzig de taaknaam in "Revisit-X40-RG". Wijzig de sectie direct onder de laatste instelling in "Revisit-ALL". Klik op "Set&Run". Druk op "OK". Volg opnieuw de aanwijzingen om de automatisering in te stellen. Klik op de knop "Start matching views" om de 10x en 40x beelden op elkaar af te stemmen. Klik op "Finish" om de scan te starten. Zodra dit is voltooid, klikt u op "Classify" en bekijkt u de beelden.

4. Representatieve resultaten

Figuur 1 geeft schemaatisch de preparatie van chromosomen onder hoge druk weer. Deze stap omvat het proces van het platdrukken van chromosomen met behulp van een Dremel-instrument en een mechanische bankschroef, evenals de visualisatie van chromosomen met een fasecontrastmicroscoop. Figuur 2 illustreert de hybridisatie van een fluorescent gelabelde probe aan doel-DNA op de chromosoompreparaten met behulp van een geautomatiseerd slide-kleuringssysteem, het gebruik van een geautomatiseerde scannende microscoop voor het visualiseren en mappen van de probes na het FISH-experiment, en het plaatsen en oriënteren van genomische scaffolds op de chromosomen.

Preparaten van polytene chromosomen uit eierstok-voedingscellen van vrouwtjes van An. gambiae werden gemaakt met behulp van de hogedruktechniek. Deze methode beschadigt of verandert de meeste chromosoomstructuren niet (Figuur 3). Het vlakt gebogen chromosomen af en onthult zo verborgen fijne banden die op reguliere preparaten niet zichtbaar zijn (Figuur 4).

De probes die in dit protocol worden gebruikt, zijn genomische BAC-DNA-klonen verkregen uit een ND-TAM BAC-bibliotheek, gegenereerd uit DNA van de An. gambiae PEST-stam. Het genomische DNA voor deze bibliotheek werd geëxtraheerd uit pas uitgekomen eerste-instar-larven van beide geslachten. Figuur 5 toont de resultaten van FISH met BAC-klonen die zijn gehybridiseerd met polytene chromosomen van An. gambiae. Deze procedure werd uitgevoerd met het Xmatrx geautomatiseerde slide-kleuringssysteem. Met behulp van een cytogenetische fotokaart voor An. gambiae¹⁰ werden twee BAC-klonen, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) en BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), respectievelijk gelokaliseerd in de onderverdelingen 16C en 16D van de 2R-arm. De BLAST-zoekopdracht tegen de AgamP3-assemblage van de An. gambiae PEST-stam ¹⁴ identificeerde echter de sequenties die homolog zijn aan 102B24 en 142O19 in respectievelijk de onderverdelingen 16B and 17A van de 2R-arm (Tabel 1). Daarom kan de correspondentie tussen de genomische coördinaten en de cytogenetische onderverdelingen nu worden aangepast op basis van onze mappinggegevens. De BLAST-zoekopdracht tegen de genoomassemblages van de An. gambiae M-vorm en S-vorm wees uit dat de twee BAC-klonen zich in verschillende contigs bevinden, maar in dezelfde scaffolds binnen elke vorm (Tabel 1). De geïdentificeerde contigs kunnen nu worden geassocieerd met specifieke chromosomale locaties. Bovendien kunnen de geïdentificeerde scaffolds nu correct worden georiënteerd binnen de cytologische onderverdelingen 16CD. Interessant is dat de afstanden tussen de 102B24- en 142O19-sequenties in de scaffolds respectievelijk 1,892,981 bp, 1,658,391 bp en 1,688,426 bp zijn in de genoomassemblages van de PEST-stam, M-vorm en S-vorm. Omdat de PEST-stam een hybride is tussen de M- en S-vormen, is dit verschil waarschijnlijk te wijten aan een incorrecte assemblage van het PEST-genoom.

BAC (toegangsnummer)	PEST-stam AgamP3 Coördinaten	M-vorm contigs Coördinaten	M-vorm scaffolds Coördinaten	S-vorm contigs Coördinaten	S-vorm scaffolds Coördinaten
102B24 (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43,681,342- 43,681,874	ABKP020247 53.1 32,513- 33,045	EQ090167.1 1,858,377- 1,858,909	ABKQ010123 32.1 4,299- 4,832	EQ099711.1 215,891- 216,424
102B24 (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43,788,213- 43,788,969	ABKP020247 51.1 24,816- 25,575	EQ090167.1, 1,772,683- 1,773,442	ABKQ010123 35.1 27,782- 28,540	EQ099711.1, 305,514- 306,272
142O19 (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45,428,580- 45,429,264	ABKP020247 01.1 2,499- 3,185	EQ090167.1 315,806- 316,492	ABKQ010123 76.1 49,242- 49,942	EQ099711.1 1,791,625- 1,792,325
142O19 (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45,560,099- 45,574,323	ABKP020220 17.1 30,971- 32,469	EQ090167.1 200,518- 202,016	ABKQ010123 79.1 27,760- 28,508	EQ099711.1 1,903,569- 1,904,317

Tabel 1. BLAST-resultaten van de BAC-uiteinde-sequenties tegen de genoomassemblages van An. gambiae.

Figuur 1. Schematische weergave van chromosoompreparatie onder hoge druk. De eierenstokken van de mug worden getoond in het juiste ontwikkelingsstadium.

Figuur 2. Een schema dat geautomatiseerde FISH, het scannen van objectglaasjes en de chromosoommapping van genomische scaffolds weergeeft.

Figuur 3. Een preparaat van polyteen chromosoom 3 van An. gambiae, verkregen met de hogedruktechniek. 3L en 3R markeren de linker- en rechterarm bij hun telomeren. PH en IH duiden respectievelijk op pericentrisch en intercalair heterochromatine.

Figuur 4. Vergelijking van polytene chromosomen van An. gambiae voorbereid met de traditionele (boven) en hogedruktechniek (onder). De afbeeldingen tonen subdivisies 29A-30E van arm 3R (A) en 43D-46D van arm 3L (B).

Figuur 5. FISH van BAC-klonen op polytene chromosomen van An. gambiae. A) Hybridisatie van 102B24 (rood signaal) met de 2R-arm. B) Duaalkleur-FISH van 102B24 (rood signaal) en 142O19 (blauw signaal) op respectievelijk de onderverdelingen 16C en 16D van de uitgerekte 2R-arm. Pijlen geven de hybridisatiesignalen aan van BAC-klonen gelabeld met Cy3 (rood) en Cy5 (blauw). C-de centromere regio. a/+ toont de heterozygote 2La inversie. Chromosomen werden tegengekleurd met de fluorofoor YOYO-1.

Discussie

De meest kritische stap van de hogedrukprocedure is het correct platdrukken van ovariële voedercellen die zijn geïsoleerd in het Christophers' III-stadium van de ovariële ontwikkeling¹³. Onjuist platdrukken kan leiden tot onvoldoende uitgespreide chromosomen, wat problemen kan veroorzaken bij het bepalen van de locaties van probes na FISH. Als de chromosomen te veel worden platgedrukt, kunnen ze breken of zodanig worden uitgerekt dat bandingspatronen verloren gaan. Het maken van meerdere preparaten zou moeten leiden tot consistentie bij het platdrukken van de slides met het Dremel-instrument, wat de algemene efficiëntie van de slideproductie zal verhogen. De hogedruktechniek werd oorspronkelijk ontwikkeld voor vers geïsoleerde speekselklieren van D. melanogaster⁹. Echter, eierstokken van muggen worden routinematig bewaard in een gemodificeerde Carnoy-fixatieoplossing (3 methanol: 1 glaciaal azijnzuur op volume) voordat ze worden gebruikt voor chromosomale preparaten. Daarom hebben we het bestaande hogedrukprotocol aangepast om het geschikt te maken voor de gefixeerde polytene chromosomen van de ovariële voedercellen van de malariamug An. gambiae. Omdat de hoge druk wordt uitgeoefend met een precisievise die over een zeer parallel werkoppervlak voor de gehele slide beschikt, kost het bereiden van de chromosoom-squash aanzienlijk minder tijd dan bij het gebruik van een traditionele tiktechniek met een potloodgum.

Andere belangrijke stappen zijn het voldoende weken van de follikels in 50% propionzuur en het verhitten van het objectglas. Beide stappen zijn essentieel om te helpen de chromosomen plat te maken. Als deze worden verwaarloosd, kunnen de chromosomen na dehydratie glanzend lijken, wat potentieel leidt tot een overmaat aan achtergrondruis die voor een signaal bij FISH kan worden aangezien. De techniek van het squashen onder hoge druk werkt ook goed met dezelfde oplossingen bij het maken van mitotische chromosoompreparaten. Het aanvullende spreiden en platmaken helpt om de chromosomen beter uit hun kernen te brengen. Het aanbrengen van gelijkmatige druk zou ze dienovereenkomstig plat moeten maken om metingen mogelijk te maken en potentieel een betere resolutie van de door kleuring zichtbare banden te verkrijgen. De details over het isoleren van mitotische chromosomen uit muggen worden elders beschreven¹⁵. Hoewel reguliere squash-preparaten voldoende zijn voor veel doeleinden, waaronder FISH ¹⁶ en immunokleuring¹⁷, verlaagt de methode onder hoge druk niet alleen de potentiële variantie van het ene objectglas naar het andere, maar verhoogt het ook de algemene chromosoomkwaliteit, wat leidt tot meer detail bij het in kaart brengen van chromosomen. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het prepareren van membraanpreparaten van polytene chromosomen voor laser-capture microdissectie.

Beperkingen van de hogedrukmethode omvatten het breken van het objectglas en het overmatig uitrekken van de chromosomen. Het breken van het objectglas als gevolg van een te hoge spanning op het glas via de bankschroef is mogelijk, maar wordt beperkt door het gebruik van de in het artikel vermelde drukken. Wat betreft het overmatig uitrekken van de chromosomen: als het Dremel-gereedschap gedurende een langere periode op het objectglas wordt toegepast, bestaat de mogelijkheid dat de chromosomen te veel worden uitgerekt en aan resolutie verliezen. Dit kan worden verholpen door het gereedschap gedurende een korte periode toe te passen, dit onder de microscoop te controleren en het Dremel-gereedschap langer te gebruiken als de chromosomen onvoldoende gespreid zijn.

Een traditioneel FISH-protocol omvat een reeks was- en incubatiestappen, die gewoonlijk 5-20 min duren en gedurende de gehele experimentduur bijna de volledige aandacht van een onderzoeker vereisen. Bovendien is het aantal preparaten dat handmatig kan worden verwerkt in een bepaald experiment meestal beperkt tot slechts enkele slides. In tegenstelling hiertoe voert een geautomatiseerd systeem voor het kleuren van preparaten alle stappen (inclusief wassen, incubatie, aanbrengen van de probe, denaturatie, hybridisatie, aanbrengen en verwijderen van het dekglas) automatisch uit. Dit bespaart een onderzoeker tot 6-8 werkuren tijdens een FISH-experiment. Daarnaast kan een geautomatiseerd FISH-systeem de doorvoersnelheid aanzienlijk verhogen. Zo is het Xmatrx-systeem in staat om gelijktijdig tot 40 assays op enkelvoudige preparaten en tot 80 assays op dubbele preparaten te verwerken. Een beperking van dit systeem is dat het niet efficiënt is voor een klein aantal FISH-experimenten, aangezien het het bereiden van grote volumes oplossingen vereist. Bovendien kan het in het systeem geprogrammeerde FISH-protocol aanpassingen en correcties vereisen voor nieuwe toepassingen.

Een slide-scanningsysteem is een geautomatiseerde versie van een fluorescentiemicroscoop. Geautomatiseerde tafelverplaatsing en een eenvoudig bedieningspaneel voor de microscoop besparen de onderzoeker tijd en maken het bedienen van de microscoop uiterst eenvoudig. Zo maakt de software in het ACCORD PLUS-scanningsysteem het eenvoudig om meerdere fluorescentiekanalen vast te leggen en de beeldacquisitie gemakkelijk te beheren. Een voorbeeld hiervan is de mogelijkheid om z-stacks vast te leggen in plaats van één enkele afbeelding; de software legt een configureerbare z-stack van beelden vast om te garanderen dat ten minste één beeld scherp blijft. Hoewel dit systeem primair is ontwikkeld voor de acquisitie van meerdere beelden (veel cellen op één objectglas), maakt het het vinden van chromosomen op het objectglas nog steeds veel eenvoudiger dan wanneer men handmatig over het objectglas navigeert.

Zowel het geautomatiseerde systeem voor het kleuren van coupes als het scansysteem worden routinematig door cytogenetica-klinieken gebruikt voor FISH-diagnostiek van chromosomale afwijkingen in menselijke cellen. In deze studie hebben we een protocol ontwikkeld dat deze geautomatiseerde systemen benut voor een fundamentele onderzoekstoepassing. Het geautomatiseerde high-throughput protocol voor fysieke mapping kan de snelle ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten voor elke gewenste soort vergemakkelijken. Hoewel we in dit rapport polytene chromosomen hebben gebruikt voor fysieke mapping, kunnen mitotische chromosomen ook met deze systemen worden gebruikt. Het zou nuttig zijn om het protocol aan te passen voor mitotische chromosomen, aangezien de meeste organismen geen leesbare polytene chromosomen ontwikkelen. Echter kunnen polytene chromosomen, wanneer beschikbaar, nuttige informatie verschaffen over de correspondentie van functionele genoomdomeinen met de chromosoomstructuur op de hoogste resolutie. De organisatorische principes van polytene chromosomen, zoals patronen van banden en interbanden, zijn onlangs vergeleken met die van reguliere niet-polytene (interfase) chromosomen¹⁸. Daarom heeft de gedetailleerde fysieke mapping die is uitgevoerd op chromosoompreparaten onder hoge druk het potentieel om DNA-sequenties te koppelen aan specifieke chromosomale structuren zoals banden, interbanden, puffs, centromeren, telomeren en heterochromatine; waardoor chromosoomgebaseerde genoomassemblages kunnen worden gecreëerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
22x22 mm microscoopdekglaasjes	Fisher	12-544-10
18x18 mm microscoopdekglaasjes	Fisher	12-553-402
Azijnzuur	Fisher	A491-212
Methanol	Fisher	A412-4
Propionzuur	Sigma-Aldrich	402907
Dremel 200 rotary tool met een Flex-Shaft opzetstuk	Rand		3" multifunctionele mini-bankslijper (met toerentalbegrenzer)
Speciaal ontworpen 200 μl plastic tips (met gekraalde plastic randen) voor Dremel tool	Pipetman	F171300	Snijd en verhit het dikke uiteinde van de pipetpunten
Vertinde snelsluitende bankschroef	Avenger Gold Toolmaker	MTC-200-1	Precisieslepen haaks en parallel tot binnen 0.00025
Koppelmoersleutel	Craftsman	44593
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System	Abbott Molecular	30-144110
25 mm barrière-objectglazen	Abbott Molecular	XT108-SL
25 mm dekglaasjes	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Automated Slide Staining System	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Leica stereomicroscoop	Leica	VA-OM-E194-354	Een andere stereomicroscoop kan worden gebruikt
Olympus CX41 fasecontrastmicroscoop	Olympus	CX41RF-5	Een andere fasecontrastmicroscoop kan worden gebruikt
ACCORD PLUS Automated Scanning System	BioView (USA)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (neutraal gebufferde formaline)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamide	Fisher Scientific	BP227500
Dextrantsulfaat natriumzout	Sigma	D8906
20x SSC-buffer	Invitrogen	AM9765
Natriumfosfaat	Sigma-Aldrich	S3264
50x Denhardt-oplossing	Sigma-Aldrich	D2532
Natriumazide	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM YOYO-1 jodiumide (491/509) oplossing in DMSO	Invitrogen	Y3601
ProLong Gold antifade-reagens	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare	PA53022, PA55022
BSA	Sigma	A3294
DNA polymerase I	Fermentas	EP0041
DNase I	Fermentas	EN0521