Methodenartikel

High-throughput Fysische in kaart brengen van Chromosomen met Automatisch In situ Hybridisatie

DOI:

10.3791/4007

⸱

28 juni 2012

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoomassemblages gebaseerd op massaal parallelle DNA-sequencingtechnologieën zijn meestal sterk gefragmenteerd. De ontwikkeling van fysieke chromosoomkaarten kan mogelijk genoomassemblages verbeteren. Hier demonstreren we innovatieve benaderingen voor chromosoomvoorbereiding, fluorescente in situ hybridisatie en beeldvorming die de doorvoer van de ontwikkeling van fysieke kaarten aanzienlijk verhogen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projecten om hele genoomsequenties te verkrijgen voor 10.000 gewervelde soorten1 en voor 5.000 insecten en verwante geleedpotigen2 zullen naar verwachting in de komende 5 jaar plaatsvinden. Bijvoorbeeld, het sequencen van de genomen van 15 malariamugsoorten wordt momenteel gedaan met behulp van een Illumina-platform3,4. Deze Anopheles -soortencluster omvat zowel vectoren als niet-vectoren van malaria. Wanneer de genoomsamenstellingen beschikbaar komen, zullen onderzoekers de unieke kans hebben om comparatieve analyses uit te voeren voor het afleiden van evolutionaire veranderingen die relevant zijn voor de vectorcapaciteit. Het is echter moeilijk gebleken om next-generation sequencing reads te gebruiken om hoogwaardige de novo genoomsamenstellingen te genereren5. Bovendien zijn de bestaande genoomsamenstellingen voor Anopheles gambiae, hoewel verkregen met de Sanger-methode, onvolledig of gefragmenteerd4,6.

Het succes van comparatieve genomische analyses zal beperkt zijn als onderzoekers te maken hebben met talrijke sequencing contigs, in plaats van met op chromosomen gebaseerde genoomsamenstellingen. Gefragmenteerde, niet-gekarteerde sequenties veroorzaken problemen voor genomische analyses omdat: (i) niet-geïdentificeerde gaten onjuiste of onvolledige annotatie van genomische sequenties veroorzaken; (ii) niet-gekarteerde sequenties leiden tot verwarring tussen paraloge genen en genen van verschillende haplotypen; en (iii) het ontbreken van chromosoomtoewijzing en oriëntatie van de sequencing contigs maakt het niet mogelijk om de herschikkingsfylogenie te reconstrueren en chromosoomevolutie te bestuderen. Het ontwikkelen van hoge resolutie fysische kaarten voor soorten met nieuw gesequencete genomen is een tijdige en kosteneffectieve investering die genoomannotatie, evolutionaire analyse en hersequencering van individuele genomen uit natuurlijke populaties zal vergemakkelijken7,8.

Hier presenteren we innovatieve benaderingen voor chromosoomvoorbereiding, fluorescente in situ hybridisatie (FISH) en beeldvorming die een snelle ontwikkeling van fysische kaarten vergemakkelijken. Met behulp van An. gambiae als voorbeeld, laten we zien dat de ontwikkeling van fysische chromosoomkaarten potentieel de genoomsamenstellingen en dus de kwaliteit van genomische analyses kan verbeteren. Ten eerste gebruiken we een hogedrukmethode om polyteense chromosoomuitstrijken voor te bereiden. Deze methode, oorspronkelijk ontwikkeld voor Drosophila9, stelt de gebruiker in staat om meer details op chromosomen te visualiseren dan de reguliere uitwrijftechniek10. Ten tweede wordt een volledig geautomatiseerd front-end systeem voor FISH gebruikt voor hoogdoorvoer fysische genoomkartering. Het geautomatiseerde systeem voor plaatkleuring voert meerdere analyses tegelijkertijd uit en vermindert de manuele tijd aanzienlijk11. Ten derde wordt een automatisch systeem voor fluorescente beeldvorming, dat een gemotoriseerde plaatdrager omvat, gebruikt om gelabelde chromosomen na FISH automatisch te scannen en te fotograferen12. Dit systeem is vooral nuttig voor het identificeren en visualiseren van meerdere chromosomale platen op dezelfde plaat. Bovendien legt het scanproces een meer uniforme FISH-resultaat vast. Over het algemeen is het geautomatiseerde hoogdoorvoer fysische karteringsprotocol efficiënter dan een standaard handmatig protocol.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van polyteende chromosomen onder hoge druk uit ovariekweekcellen

  1. Dissecteerde halfdrachtige Anopheles vrouwtjes op 25 uur na bloedvoeding onder een dissectiemicroscoop en fixeerde eierstokken in verse gemodificeerde Carnoy's oplossing met methanol (100% methanol: glazuur azijn, 3:1). In dit stadium bevinden de eierstokken zich in de III-ontwikkelingsfase van Christophers wanneer follikels een ovale vorm hebben en een transparant gebied met voedingscellen binnen follikels een ronde vorm heeft13. Plaats eierstokken van ongeveer vijf vrouwtjes in 500 μl gemodificeerde Carnoy's oplossing in een 1,5 ml Eppendorf buisje en bewaar ze 24 uur op kamertemperatuur. Breng eierstokken over naar -20 °C voor langdurige opslag.
  2. Bereid een gemodificeerde Carnoy's oplossing voor met ethanol (100% ethanol: glazuur azijn, 3:1) en 50% propionzuur vlak voor het maken van slides. Plaats een paar eierstokken op een stofvrije glasplaat in één druppel gemodificeerde Carnoy's oplossing. Verdeel eierstokken in ongeveer 6 secties met dissectie naalden en plaats ze in druppels van 50% propionzuur op schone glasplaten onder een dissectie MZ6 Leica stereomicroscoop. Gebruik een aparte glasplaat voor elke sectie.
  3. Gebruik naalden om follikels te dissecteren en veeg resterend weefsel weg met filterpapier of keukenpapier onder een dissectiemicroscoop. Voeg een nieuwe druppel van 50% propionzuur toe aan de follikels en laat ze 3-5 minuten op kamertemperatuur staan. Plaats een dekglas bovenop de druppel van 50% propionzuur. Laat de glasplaat ongeveer 1 minuut staan.
  4. Wickel de glasplaat met filterpapier en plastic. Gebruik een Dremel 200 draaischijfgereedschap met een Flex-Shaft-aansluiting en zachte plastic tip ingesteld tussen 3000-5000 RPM, druk de follikels uit door de tip in cirkels te draaien en het dekglas lichtjes aan te drukken om de kernen gelijkmatig te verspreiden. Deze stap duurt ongeveer 1 minuut. Controleer de verspreidingskwaliteit met een Olympus CX41 Phase Microscoop met een 20x objectief.
  5. Maak een sandwich door een extra dekglas naast het dekglas te plaatsen dat de chromosomen bedekt, en bedek ze met een tweede microscoopglas. Dit vermindert de kans dat de glasplaat in de tang wordt geplet. Wikkel de glasplaten in met een plastic folie die in glazen glasplaatcontainers en filterpapier wordt geleverd om de sandwich vast te houden en om de glasplaat te beschermen tegen krassen door de tang.
  6. Oefen druk uit op de glasplaten via een mechanische tang. Een druk van 85-120 inch-lbs is voldoende en wordt bereikt door een koppelschroevendraaier te gebruiken. Deze stap is noodzakelijk om de chromosomen zoveel mogelijk plat te maken.
  7. Verwijder de tweede microscoopglas en het extra dekglas. Verwarm de glasplaat met het dekglas dat de chromosomen bedekt tot 55 °C op een glasplaatdenaturatie/hybridisatiesysteem gedurende 10-15 minuten om de chromosomen verder plat te maken. Dompel de glasplaat gedurende ten minste 15 seconden in vloeibaar stikstof en verwijder, wanneer het bubbelen is gestopt, snel het dekglas met een scheermesje. Plaats de glasplaten onmiddellijk in koud 50% ethanol gedurende 5 minuten. Ontwater de glasplaten in 70%, 90%, 100% ethanol gedurende 5 minuten elk. Laat de glasplaten aan de lucht drogen.

2. FISH met behulp van een geautomatiseerd glasplaatkleuringssysteem

Het programma is ingesteld met het Xmatrx geautomatiseerde glasplaatkleuringssysteem om de volgende stappen uit te voeren, behalve het labelen van de sonde. Het gedetailleerde nick-translatielabelingsprotocol wordt beschreven in de documentatie die bij DNA-polymerase van Fermentas wordt geleverd.

  1. Voor FISH bereidt u fluorescente sondes voor door genomische BAC-DNA te labelen met een fluorofoor met behulp van een nick-translatieprotocol. Meng 1 μg DNA, 0,05 mM van elk ongelabeld dATP, dCTP en dGTP en 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- of Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x nick-translatiebuffer, 20 eenheden DNA-polymerase I, 0,0012 eenheden DNase I en nuclease-vrij water tot 25 μl. De verhouding van DNA-polymerase I/DNase I wordt empirisch geselecteerd om sondes met een groottebereik van 300 tot 500 bp te verkrijgen. Bewaar de mix gedurende 1 uur bij 15 °C.
  2. Plaats glasplaten en reagentia in het Xmatrx geautomatiseerde glasplaatkleuringssysteem en start het programma om de volgende stappen uit te voeren. Breng 800 μl 1x PBS aan gedurende 20 minuten. Spuit de glasplaten met lucht. Voer formalinefixatie uit door 450 μl 4% formaline in 1x PBS aan te brengen gedurende 1 minuut, gevolgd door wasbeurten met 100% ethanol gedurende 1 seconde twee keer en gedurende 2 minuten één keer. Spuit de glasplaten met lucht.
  3. Verwarm de glasplaten gedurende 2 minuten op 45 °C om bubbels te voorkomen bij het aanbrengen van de sondes. Breng 20 μl van de DNA-sondes aan, voeg druppels minerale olie toe om verdamping van een hybridisatieoplossing te voorkomen, en plaats een dekglas erop. Ontdoe chromosomen en DNA-sondes van hun structuur door de glasplaten gedurende 10 minuten op 90 °C te verwarmen.
  4. Voor hybridisatie, incubeer glasplaten bij 42 °C gedurende 14 uur met dekglasjes op. De hybridisatieoplossing bestaat uit 2x SSC, 100 mM natriumfosfaat, 1x Denhardt's oplossing, 100 μg/ml natriumaziet en 10% dextransulfaat in formamide.
  5. Voor

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De meest cruciale stap van de hogedrukprocedure is het correct platdrukken van ovariële verpleegsterscellen, geïsoleerd in het Christophers' III-stadium van ovariële ontwikkeling13. Onjuist platdrukken kan leiden tot onvoldoende verspreide chromosomen, wat problemen kan veroorzaken bij het bepalen van sondelocaties na FISH. Als de chromosomen te veel platgedrukt worden, kunnen ze breken of verlengd raken tot het punt waarop bandpatronen verloren gaan. Het produceren van meerdere slides moet leiden tot een consistentie bij het platdrukken van de slides met het Dremel-gereedschap, wat de algehele efficiëntie van slideproductie zal verhogen. De hogedruktechniek werd oorspronkelijk ontwikkeld voor vers geïsoleerde speekselklieren van D. melanogaster9. Echter, eierstokken van muggen worden routinematig gepreserveerd in een gemodificeerde Carnoy's fixeervloeistof (3 methanol: 1 ijsaftige azijnzuur naar volume) voordat ze worden gebruikt voor chromosomale preparaten. Daarom hebben we het bestaande hogedrukprotocol gewijzigd om het geschikt te maken voor de gefixeerde ovariële verpleegsterscel polyteende chromosomen van de malariamug An. gambiae. Omdat de hoge druk wordt toegepast met behulp van een precisiebank met een hoogparallelle werkoppervlakte van de hele slide, duurt het aanzienlijk minder tijd om de chromosoomsmaak voor te bereiden dan met een traditionele tiktechniek met een potloodslijper.

Andere belangrijke stappen zijn het voldoende weken van follikels in 50% propionzuur en het verwarmen van de slide. Beide stappen zijn essentieel om de chromosomen plat te maken. Als ze worden verwaarloosd, kunnen chromosomen er glanzend uitzien na dehydratatie, wat mogelijk leidt tot een overvloed aan achtergrond die kan worden aangezien voor een signaal in FISH. De hogedruktechniek voor het platdrukken werkt ook goed met dezelfde oplossingen bij het maken van mitotische chromosoompreparaten. De extra spreiding en afvlakking helpt om de chromosomen beter uit hun kernen te laten komen. Het toepassen van gelijke druk zou ze dienovereenkomstig moeten afvlakken om metingen mogelijk te maken en mogelijk een betere resolutie van banden zichtbaar te maken door kleuring. De details over het isoleren van mitotische chromosomen uit muggen worden elders gegeven15. Hoewel reguliere smaakpreparaten voldoende zijn voor veel doeleinden, inclusief FISH 16 en immunokleuring17, verlaagt de hogedrukmethode niet alleen de potentiële variantie van de ene slide naar de andere, maar verhoogt ook de algehele chromosoomkwaliteit, wat leidt tot hogere details bij het in kaart brengen van chromosomen. Deze procedure kan ook worden gebruikt voor het bereiden van polyteende chromosoommembranen voor laser-capture microdissectie.

Beperkingen van de hogedrukmethode zijn slidebreuk en overrekking van de chromosomen. Slidebreuk veroorzaakt door te veel stress op de slide via de klemm voorkomt, maar wordt beperkt door gebruik van de in het artikel aangegeven drukken. Voor overrekking van de chromosomen, als het Dremel-gereedschap gedurende een langere periode op de slide wordt toegepast, bestaat de mogelijkheid dat de chromosomen te ver uitgerekt raken en resolutie verliezen. Dit kan worden verholpen door het gereedschap voor een korte periode toe te passen, onder de microscoop te controleren en meer tijd met het Dremel-gereedschap toe te passen als de chromosomen onvoldoende verspreid zijn.

Een traditioneel FISH-protocol omvat een aantal was- en incubatiestappen, die meestal 5-20 minuten duren en bijna volledige aandacht van een onderzoeker vereisen voor de hele duur van het experiment. Bovendien is het aantal slides dat handmatig kan worden behandeld meestal beperkt tot enkele slides in een bepaald experiment. In tegenstelling hiermee voert een geautomatiseerd slidekleuringssysteem alle stappen (inclusief wassen, incubatie, sonde-applicatie, denaturatie, hybridisatie, coverslip-applicatie en verwijdering) automatisch uit. Dit maakt 6-8 werkuren vrij voor een onderzoeker in een FISH-experiment. Bovendien kan een geautomatiseerd FISH-systeem de doorvoer aanzienlijk verhogen. Bijvoorbeeld, het Xmatrx-systeem is in staat om tot 40 assays op enkele preparatieslides en tot 80 assays op dubbele preparatieslides tegelijkertijd te verwerken. Onder de beperkingen van dit systeem is dat het niet efficiënt is voor een klein aantal FISH-experimenten, omdat het het voorbereiden van grote volumes oplossingen vereist. Bovendien kan het in het systeem geprogrammeerde FISH-protocol wijzigingen en aanpassingen vereisen voor nieuwe toepassingen.

Een slidescansysteem is een geautomatiseerde versie van een fluorescente microscoop. Geautomatiseerde stagebeweging en een eenvoudig microscoopbedieningspaneel maken de tijd van een onderzoeker vrij en maken het bedienen van de microscoop extreem eenvoudig. Bijvoorbeeld, de software in het ACCORD PLUS-scansysteem zorgt voor eenvoudige opname van meerdere fluorescentiekanalen en eenvoudig te beheren beeldverwerving. Een voorbeeld hiervan is de opname van z-stacks in plaats van het nemen van een enkele afbeelding; de software neemt een configureerbare z-stack van afbeeldingen op om ervoor te zorgen dat ten minste één afbeelding scherp blijft. Hoewel dit systeem meer gemaakt is voor meervoudige beeldacquisitie (veel cellen op een enkele slide), maakt het het nog steeds eenvoudiger om chromosomen op de slide te vinden dan handmatig door de slide te navigeren.

Zowel het geautomatiseerde slidekleuringssysteem als het scansysteem worden routinematig gebruikt voor FISH-diagnose van chromosomale afwijkingen in menselijke cellen door cytogenetische klinieken. In dit onderzoek hebben we een protocol ontwikkeld dat deze geautomatiseerde systemen gebruikt voor een basisonderzoekstoepassing. Het geautomatiseerde hoogdoorvoerfysische kaartprotocol kan de snelle ontwikkeling van fysische chromosoomkaarten voor elke soort van interesse vergemakkelijken. Hoewel we in dit rapport polyteende chromosomen voor fysische kaarten hebben gebruikt, kunnen mitotische chromosomen ook met deze systemen worden gebruikt. Het zou nuttig zijn voor het protocol om te worden aangepast aan mitotische chromosomen, omdat de me

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de subsidie van National Institutes of Health 1R21AI094289 aan Igor V. Sharakhov. Het Xmatrx Automatisch Glijmiddelkleuringssysteem en ACCORD PLUS Automatisch Scansysteem werden gekocht met de hulp van het Equipment Trust Fund-programma, Fralin Life Science Institute, Department of Entomology en Department of Biochemistry van Virginia Tech.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22x22 mm microscope coverslipsFisher12-544-10
18x18 mm microscope coverslipsFisher12-553-402
AzijnzuurFisherA491-212
MethanolFisherA412-4
PropionzuurSigma-Aldrich402907
Dremel 200 draaigereedschap met een Flex-Shaft-aansluitingRand3" Multifunctionele Mini-bankmolen (met snelheidsbegrenzer)
Speciaal ontworpen 200 μl plastic tips (kralen plastic randen) voor Dremel toolPipetmanF171300Snijden en smelt vet uiteinde van pipet tips
Tin gecoate snelle viceAvenger Gold ToolmakerMTC-200-1Precisie geslepen vierkant en parallel tot binnen 0.00025
Koppel sleutelCraftsman44593
ThermoBrite Slide Denaturatie/Hybridisatie SysteemAbbott Molecular30-144110
25 mm barrier slidesAbbott MolecularXT108-SL
25 mm coverslipsAbbott MolecularXT122-90X
Xmatrx Geautomatiseerd Slide Staining SysteemAbbott Molecular08L46-001
MZ6 Leica stereomicroscoopLeicaVA-OM-E194-354Een ander stereomicroscoop kan worden gebruikt
Olympus CX41 Fase MicroscoopOlympusCX41RF-5Een andere fase microscoop kan worden gebruikt
ACCORD PLUS Geautomatiseerd ScansysteemBioView (VS)BV-5000-ACCP
10x PBSInvitrogenP5493
10% NBF (neutraal gebufferd formaline)Sigma-AldrichHT501128
99% formamideFisher ScientificBP227500
Dextran sulfaat natriumzoutSigmaD8906
20x SSC bufferInvitrogenAM9765
NatriumfosfaatSigma-AldrichS3264
50x Denhardt's oplossingSigma-AldrichD2532
NatriumazietSigma-AldrichS2002
1 mM YOYO-1 jodide (491/509) oplossing in DMSOInvitrogenY3601
ProLong Gold antifade reagens InvitrogenP36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTPFermentasR0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTPGE HealthcarePA53022, PA55022
BSASigmaA3294
DNA polymerase IFermentasEP0041
DNase I FermentasEN0521

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species. J. Hered. 100, 659-674 (2009).
  2. Robinson, G. E., et al. Creating a Buzz About Insect Genomes. Science. 331, 1386-1386 (2011).
  3. Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from: http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/ (2012).
  4. Besansky, N. Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites. White Paper. , 1-15 (2008).
  5. Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. Limitations of next-generation genome sequence assembly. Nature. 8, 61-65 (2011).
  6. Sharakhova, M. V., et al. Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly. Genome Biol. 8, R5(2007).
  7. Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. Every genome sequence needs a good map. Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).
  8. Bhutkar, A., et al. Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes. Genetics. 179, 1657-1680 (2008).
  9. Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nature. 4, 483-485 (2007).
  10. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).
  11. FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from: http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html (2012).
  12. The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from: http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332 (2012).
  13. Clements, A. N. The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction. , Chapman & Hall. (1992).
  14. BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from: http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/ (2012).
  15. Sharakhova, M. V., et al. Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).
  16. Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis. J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).
  17. Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling. J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).
  18. Vatolina, T. Y., et al. Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster. PLoS ONE. 6, (2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Chromosoompreparatiefluorescentie in situ hybridisatiegeautomatiseerde beeldvorminghogedrukmethodepolytene chromosomenAnopheles gambiaenick translatiegeautomatiseerde plakjeskleuringfluorescentie beeldvormingssysteemfysieke genoommapping

Gerelateerde artikelen